Seqüente

O objetivo geral deste procedimento é acompanhar e quantificar sequencialmente a migração, proliferação e diferenciação de células-tronco e progenitoras osteogênicas endógenas na reparação de fraturas ósseas. Isso é realizado primeiramente marcando in vivo as células positivas para mixovírus, resistência ao vírus da influenza ou MX1 (MX one) por meio da injeção de ácido poli C poli I (poly cynic poly cyto ilic acid), e em seguida eliminando as células hematopoéticas residentes positivas para MX1 por irradiação. Na segunda etapa, células da medula óssea de tipo selvagem são administradas sistematicamente aos camundongos irradiados.

Em seguida, microfraturas são geradas na área Cal do camundongo por perfuração com agulha. Por fim, realiza-se a imagem sequencial intravital da reparação da microfratura. Essas imagens intravitais podem, eventualmente, ser utilizadas para avaliar a dinâmica da influxo e expansão de células-tronco e progenitoras osteogênicas nos locais da fratura.

Assim, a principal vantagem dessa técnica é que ela permite a realização de imagens repetitivas in vivo de células-tronco e progenitoras osteogênicas durante o processo de cicatrização de fraturas. As implicações dessa técnica estendem-se para a terapia de cicatrização de fraturas e da osteoporose. Como este método oferece uma nova ferramenta para monitorar células-tronco e progenitoras osteogênicas endógenas na regeneração e reparo ósseo.

A demonstração visual deste método é fundamental, pois a geração da microfratura com danos teciduais mínimos e a repetida imagem in vivo da lesão por fratura sem induzir formação severa de cicatriz são aspectos importantes para o método e tecnicamente desafiadores. Para rotular in vivo as células positivas para MX um em um camundongo repórter MX um Cree, comece injetando 200 microlitros de ácido poliácido poli citidílico por 20 gramas de peso do camundongo, via intraperitoneal, uma vez a cada dois dias durante 10 dias. Em seguida, para eliminar as células hematopoéticas residentes positivas para MX um, irradie os camundongos injetados com uma única dose de 9,5 gras. Após 24 horas, transplante 1 × 10⁶ células da medula óssea de tipo selvagem por camundongo, via intravenosa.

Quatro a seis semanas depois, anestesie o camundongo por injeção intraperitoneal com 50 microlitros de quetamina xilazina. Após confirmar a sedação por meio do aperto no dedo do pé, retire o couro cabeludo do camundongo transplantado com células da medula óssea e, em seguida, esterilize a pele exposta com um cotonete contendo álcool a 70%. Aplique gel lacrimal para prevenir a desidratação da córnea e, então, faça uma incisão transversal com menos de um centímetro de comprimento no couro cabeludo, começando de uma orelha e terminando na outra. Em seguida, gire o animal cerca de 60 graus e continue a incisão até atingir cerca de dois a três milímetros do nariz, utilizando pinças.

Puxe a aba de tecido em direção aos lados do animal para separar a pele; agora os ossos frontais e a intersecção das suturas sagital e coronal devem estar claramente expostos. Lave a superfície aberta com PBS estéril e, em seguida, remova suavemente os pelos residuais com cotonetes. Em seguida, para gerar microfraturas no crânio, segure a cabeça do camundongo com uma mão e uma agulha de calibre 30 com a outra.

Use a ponta de agulha de 30 para fazer cuidadosamente uma microperfuração em um dos lados dos ossos frontais, próximo à interseção das suturas sagital e coronal. Para evitar penetrar no cérebro, troque para uma agulha de maior calibre e gire a nova agulha para alargar o orifício da perfuração até cerca de 0,5 milímetros de diâmetro. Após criar uma segunda perfuração no osso frontal contralateral, adicione continuamente PBS em cada local, limpando até que o sangramento cesse.

Em seguida, para evitar a secagem, aplique uma gota suficiente de solução salina fisiológica estéril sobre o crânio, cobrindo completamente a área para a aquisição das imagens Vidal. Primeiro, ligue o scanner a laser baseado em polígonos para permitir a aquisição simultânea de imagens em múltiplos canais a uma taxa de vídeo de 30 quadros por segundo. Em seguida, ligue o laser de titânio-safira de femtosegundo para imagem de múltiplos fótons.

Defina a potência e o comprimento de onda em 880 nanômetros para a geração de segundo harmônico na imagem do osso calvário em 440 nanômetros para excitação de GFP e TD-tomate, ligue os lasers de estado sólido de 491 nanômetros e 561 nanômetros. Em seguida, ligue os detectores de tubo fotomultiplicador para cada sinal: um filtro de passagem de banda de 435 ± 20 nanômetros para a geração de segundo harmônico, um filtro de passagem de banda de 528 ± 19 nanômetros para GFP e um filtro de passagem de banda de 590 ± 20 nanômetros para TD-tomate. Agora, posicione o animal sobre uma platina motorizada do microscópio com eixos XYZ, em cima de uma almofada aquecida elétrica ajustada a 37 graus Celsius.

Use fita adesiva para manter o camundongo na posição e, em seguida, aplique uma gota de gel à base de 2% de Metilcelulose aquecido sobre o crânio. Para evitar secagem, coloque um lamínula sobre a área de imagem. Em seguida, utilize um objetivo de imersão em água de 30 x com abertura numérica de 0,9 e o controlador dos eixos XY e Z para detectar o sinal de SHG proveniente dos ossos.

Para localizar a superfície do crânio, identifique uma posição anatômica crucial, como a intersecção entre as suturas sagital e coronal, e adquira uma imagem. Marque as coordenadas X, Y e Z do ponto de referência e, em seguida, continue a busca pela localização da lesão utilizando os sinais de SHG e fluorescência como orientação. Quando cada região de interesse for encontrada, adquira uma imagem do melhor plano focal que contenha os sinais de SHG e fluorescência das células de interesse.

Salve as coordenadas XY, Z e a distância até a interseção das suturas sagital e coronal para definir sua localização precisa para a próxima rodada de aquisição de imagens. Em seguida, colete estruturas celulares tridimensionais e ósseas da lesão por fratura. Registre as imagens em intervalos de pilha Z de aproximadamente dois a cinco mícrons, com uma profundidade de cerca de 100 mícrons a partir da superfície endóssea.

Finalmente, após a obtenção de imagens em ambos os locais da lesão, utilize várias gotas de solução salina estéril para remover o gel de 2% de Metilcelulose do crânio. Agora, cubra a superfície com antibióticos e recoloque os retalhos cutâneos sobre o crânio, fechando o couro cabeludo com fio de sutura hipersensível e mantenha o animal em uma câmara de recuperação aquecida até que recupere consciência suficiente. Após três a cinco dias, repita os passos de imagem intravital para acompanhar as alterações celulares durante a cicatrização da fratura.

Neste experimento representativo, duas microfraturas foram geradas nos ossos frontais de camundongos osteocalcina-tomate genic MX1, GFP, após irradiação e substituição da medula óssea. A imagemagem tridimensional intravital sequencial das microfraturas mostrou uma realocação das células-tronco e progenitoras osteogênicas positivas para tomate no local da fratura no segundo dia, bem como sua expansão no quinto dia. Embora nenhum osteoblasto positivo para GFP tenha sido detectado nesse momento, no 12º dia, um subconjunto de progenitores osteo no entorno da superfície da fratura iniciou a diferenciação de osteoblastos positivos para tomate e GFP, conforme indicado pela seta. O acúmulo de novos osteoblastos e a formação de novo osso no 21º dia indicam que a migração e proliferação das células progenitoras osteogênicas foi um mecanismo importante para fornecer novos osteoblastos na cicatrização da fratura. Para testar se este método fornece uma saída consistente e quantitativa do número de progenitores osteo durante a cicatrização da fratura, as células-tronco e progenitoras osteogênicas positivas para MX1 YFP foram acompanhadas por 14 dias após a lesão.

Números pequenos de progenitores foram consistentemente detectados no local da lesão após três dias. O número de células aumentou continuamente no sétimo dia, atingindo uma população máxima no décimo dia, que se manteve no décimo quarto dia. A cinética da geração dos progenitores osteo foi quantificada por meio da medição da intensidade do sinal YFP ao longo do tempo e correlacionada com a observada por microscopia intra-vital.

Os progenitores foram inicialmente observados no terceiro dia, atingiram pico no décimo dia e permaneceram em intensidade igualmente alta até o décimo quarto dia. Ao tentar realizar este procedimento, é importante lembrar que técnicas hábeis de sutura e sangramento mínimo podem reduzir a formação de cicatrizes e diminuir a autofluorescência de fundo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como imaginar e acompanhar a migração, proliferação e diferenciação de células-tronco progenitoras osteogênicas endógenas no processo de reparação de fraturas.