Seqüente In vivo Imagem de osteogênicas células-tronco / progenitoras durante o reparo de fratura

O objetivo geral deste procedimento é rastrear e quantificar sequencialmente a migração, proliferação e diferenciação de células-tronco osteogênicas endógenas e progenitoras no reparo de fraturas ósseas. Isso é feito primeiro marcando o vírus mixo, a resistência ao vírus influenza, uma ou MX uma célula positiva in vivo por injeção de ácido policínico policito ilicílico e, em seguida, eliminando as células hematopoiéticas MX um positivas residentes por irradiação. Na segunda etapa, células da medula óssea do tipo selvagem são sistematicamente administradas aos camundongos irradiados.

Em seguida, microfraturas são geradas na área Cal do camundongo por perfuração com agulha. Finalmente, é realizada uma imagem sequencial intrafrasco do reparo da microfratura. Em última análise, essas imagens intravitais podem ser usadas para avaliar a dinâmica do influxo e expansão de células-tronco osteogênicas e progenitoras nos locais de fratura.

Portanto, a principal vantagem dessa técnica é que permite imagens repetitivas in vivo de células-tronco osteogênicas e progenitoras durante o curso da consolidação da fratura. A implicação dessa técnica se estendeu à terapia da consolidação de fraturas e osteoporose. Como este método oferece uma nova ferramenta para monitorar células-tronco progenitoras osteogênicas endógenas na regeneração e reparo ósseo.

A demonstração visual deste método é crítica, pois uma geração da microfratura com dano tecidual mínimo e a imagem in vivo repetida da lesão por fratura sem induzir a formação de cicatrizes graves são importantes para o método e tecnicamente desafiadoras Para rotular MX uma célula positiva in vivo, comece injetando 200 microlitros de ácido poliácido policito lílico por 20 gramas de MX um peso de camundongo repórter Cree intraperitoneal uma vez a cada dois dias por 10 dias. Em seguida, para eliminar o MX residente, uma célula hematopoiética positiva, irradie os camundongos injetados com uma dose única de 9,5 gras. Após 24 horas, transplante uma vez 10 para as sextas células da medula óssea do tipo selvagem por via intravenosa por camundongo.

Quatro a seis semanas depois, anestesiar o camundongo por injeção intraperitoneal com 50 microlitros de cetamina xilazina Após confirmar a sedação por pinça do dedo do pé, cortar o par de couro cabeludo do camundongo transplantado de células da medula óssea e, em seguida, esterilizar a pele exposta com um cotonete com álcool 70%. Aplique gel lacrimal para evitar a desidratação da córnea e, em seguida, faça uma incisão transversal com menos de um centímetro de comprimento no couro cabeludo, começando em uma orelha e terminando na outra. Em seguida, gire o animal cerca de 60 graus e continue a incisão até atingir cerca de dois a três milímetros do nariz usando uma pinça.

Puxe o retalho de tecido em direção aos lados do animal para separar a pele, tanto os ossos frontais quanto a interseção das suturas sagital e coronal devem agora estar claramente expostos. Lave a superfície aberta com PBS estéril e, em seguida, limpe suavemente os pelos residuais com cotonetes. Em seguida, para gerar microfraturas na panturrilha, segure a cabeça do mouse com uma mão e uma agulha de calibre 30 com a outra.

Use a ponta da agulha de calibre 30 para perfurar suavemente uma micropunção em um lado dos ossos frontais perto da interseção das suturas sagital e coronal. Para evitar penetrar no cérebro, mude para um calibre maior e gire a nova agulha para alargar o orifício de punção para cerca de 0,5 milímetros de diâmetro. Depois de gerar uma segunda punção no osso frontal contralateral, coloque continuamente o PBS em cada ponto até que o sangramento pare.

Em seguida, para evitar o ressecamento, aplique uma gota suficiente de solução salina fisiológica estéril no crânio para cobrir totalmente a área para adquirir as imagens de Vidal. Primeiro, ligue o scanner a laser baseado em polígonos para permitir a aquisição simultânea de imagens multicanal a uma taxa de vídeo de 30 quadros por segundo. Em seguida, ligue o laser de safira de titânio de femtossegundo para imagens multifótons.

Defina a potência e o comprimento de onda para 880 nanômetros para imagens de geração de segundo harmônico do osso da calvária em 440 nanômetros para excitação de tomate GFP e TD, ligue os lasers de estado sólido de 491 nanômetros e 561 nanômetros. E, em seguida, ligue os detectores de tubo fotomultiplicador para cada sinal um filtro passa-banda de 435 mais ou menos 20 nanômetros para segunda geração harmônica, um filtro passa-banda de 528 mais ou menos 19 nanômetros para GFP e um passe de banda de 590 mais ou menos 20 nanômetros para tomate TD. Agora, coloque o animal em um estágio de microscópio motorizado do eixo XYZ em cima de uma almofada de aquecimento elétrico ajustada para 37 graus Celsius.

Use fita adesiva para segurar o mouse na posição e, em seguida, aplique uma gota de gel quente à base de 2% de metilcelulose no crânio. Para evitar a secagem, coloque uma lamínula na área de imagem. Em seguida, use uma objetiva de imersão em água de 30 x com abertura numérica de 0,9 e o controlador do eixo XY, Z para detectar o sinal SHG dos ossos.

Para encontrar a superfície da calvície, identifique um local de referência crucial, como a interseção entre as suturas sagitais e as suturas coronais, e adquira uma imagem. Marque as coordenadas XY, Z do ponto de referência e continue a procurar a localização da lesão usando o SHG e os sinais fluorescentes como guias. Quando cada região de interesse for encontrada, adquira uma imagem do melhor plano focal contendo o SHG e os sinais fluorescentes das células de interesse.

Salve as coordenadas XY, Z e a distância até a interseção das suturas sagital e coronal para definir sua localização precisa para a próxima rodada de imagens. Em seguida, coletar estruturas celulares e ósseas 3D da lesão por fratura. Registre imagens em intervalos de pilha Z de aproximadamente dois a cinco mícrons com cerca de 100 mícrons de profundidade da superfície do osso endo.

Finalmente, após a imagem de ambos os locais de lesão, use várias gotas de solução salina estéril para remover o gel de metilcelulose a 2% do crânio. Agora cubra a superfície com antibióticos e cubra o crânio com as abas de pele, feche novamente o couro cabeludo com fio de sutura hipoalergênico e mantenha o animal em uma câmara de recuperação quente até que ele recupere a consciência suficiente. Após três a cinco dias, repita as etapas de imagem intravital para rastrear a alteração celular durante a cicatrização da fratura.

Neste experimento representativo, duas microfraturas foram geradas nos ossos frontais de camundongos gênicos MX um tomate osteocalcina, GFP após irradiação e substituição da medula óssea sequencial 3D intra vital das microfraturas mostraram uma realocação da haste osteogênica positiva do tomate e das células progenitoras dentro do local da fratura no segundo dia, bem como sua expansão no quinto dia. Embora nenhum osteoblasto positivo para GFP tenha sido detectado neste momento, no dia 12, um subconjunto de osteoprogenitores próximo à superfície da fratura iniciou a diferenciação de osteoblastos positivos para GFP em tomate, conforme indicado pela seta, o acúmulo de novos osteoblastos e nova formação óssea no dia 21 indica que a migração e proliferação das células progenitoras osteogênicas foi um mecanismo importante para fornecer novos osteoblastos para a cicatrização da fratura. Para testar se este método fornece uma saída consistente e quantitativa do número de osteoprogenitores durante a consolidação da fratura, células-tronco osteogênicas e progenitoras positivas para MX um YFP foram rastreadas por 14 dias após a lesão.

Um pequeno número de progenitores foi consistentemente detectado no local da lesão por três dias. O número de células aumentou continuamente no sétimo dia, atingindo um pico populacional no dia 10 que foi sustentado em 14 dias. A cinética da geração dos osteoprogenitores foi quantificada pela medição da intensidade do sinal YFP ao longo do tempo e correlacionada com a observada por microscopia intravital.

Os progenitores foram observados pela primeira vez no terceiro dia, atingiram o pico no dia 10 e permaneceram em uma intensidade igualmente alta até o dia 14. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que técnicas de sutura habilidosas e sangramento mínimo podem reduzir a formação de cicatrizes e diminuir a autofluorescência de fundo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter imagens e rastrear a migração, proliferação e diferenciação de células-tronco progenitoras osteogênicas endógenas no processo de reparo de fraturas.