Expressão, isolamento e purificação do solúveis e insolúveis biotinilados Proteínas de Tecido Nervoso Regeneração

O objetivo geral deste procedimento é projetar, expressar e isolar com sucesso proteínas biotiniladas recombinantes que podem ser incorporadas em uma variedade de aplicações, como sondas, sensores, administração de medicamentos e engenharia de tecidos. Isso é feito primeiro transformando o plasmídeo personalizado em uma linha de células hospedeiras bacterianas usando culturas em pequena escala e, em seguida, induzindo a expressão da proteína alvo. Em seguida, a presença e solubilidade da proteína alvo são determinadas para formular procedimentos de purificação adequados.

Em seguida, o procedimento é ampliado para produzir maiores rendimentos da proteína-alvo, que são então isoladas usando técnicas de cromatografia de afinidade. Finalmente, as proteínas são purificadas e depois concentradas para aplicações e análises a jusante. Em última análise, a página SDS e os resultados do FPLC verificam que as proteínas recombinantes foram isoladas e purificadas com sucesso, e as proteínas são testadas quanto à funcionalidade.

A principal vantagem da engenharia de proteínas recombinantes é que ela nos permite criar quantidades em grande escala ou em escala de miligramas de proteínas personalizadas para atender às nossas especificações científicas exatas. Por exemplo, podemos adicionar novas funcionalidades a porções dessas proteínas para permitir novas propriedades. Mostraremos hoje como você pode biotina nas extremidades de proteínas específicas, e usamos isso para imobilizar ou amarrar especificamente essas proteínas a superfícies para guiar funções celulares, como crescimento neuronal ou diferenciação neuronal.

Indivíduos novos nesta técnica não devem ter muita dificuldade ao seguir os procedimentos para isolamento de proteínas nativas ou não nativas. Muitas etapas são as mesmas, mas exigem um buffer específico formulado para condições nativas ou não nativas. Atenção cuidadosa aos detalhes durante o início.

Os estágios de transformação e expressão de teste garantirão alto rendimento de proteína durante o processo final de aumento de escala posterior. A demonstração visual desse método é importante porque mostra como as proteínas recombinantes podem ser feitas usando equipamentos e suprimentos de laboratório simples. Utilizando a reação em lote simples, equalizamos e os meios de crescimento são cultivados em escala líder, produzindo 10 miligramas de proteína por cultura principal.

Além disso, técnicas de cromatografia podem ser usadas e demonstradas para mostrar como as proteínas são purificadas para aplicação a jusante Hoje, Alicia, graduada do Cinema Lab, demonstrará o procedimento após a clonagem e o teste de expressão na proteína-alvo de interesse e o cultivo de uma cultura de 20 mililitros durante a noite. De acordo com o protocolo de texto, despeje a cultura durante a noite em 1,8 litros de meio de crescimento estéril com ampicilina e use uma pipeta de paster para adicionar seis a oito gotas de antiespuma estéril 2 0 4 coloque as culturas em um banho-maria a 37 graus Celsius através de um filtro de 0,2 mícron, borbulhe ar comprimido nas culturas através de pedras de aeração. Quando a cultura atinge uma DO 600 de 0,7 a 0,8 a um IPTG milimolar e o induz por quatro horas a 37 graus Celsius ou durante a noite a 18 graus Celsius, dependendo se a proteína foi encontrada na fração solúvel ou insolúvel na expressão do teste.

Experimentos para coletar as células, transferir a cultura para garrafas de centrífuga de um litro e girá-la por 15 minutos a 14.000 vezes a gravidade e quatro graus Celsius. Despeje o super natin e, usando uma espátula fina, coloque o pellet bacteriano em dois tubos de 50 mililitros. Pulverize as células novamente por centrifugação por alguns minutos antes de armazená-las a 80 graus Celsius negativos.

Para realizar proteína não nativa. Isolamento de uma proteína insolúvel para cada pellet de E coli congelado. Adicione 20 mililitros de lise, tampão de lavagem e vórtice e agite para ressuspender e eliminar quaisquer pedaços grandes.

Depois de incubar em um mutador durante a noite, a solução se parecerá com uma centrífuga de polpa viscosa. A pasta a 20, 500 vezes a gravidade e a temperatura ambiente por 30 minutos. Transfira o sobrenadante para um tubo novo e descarte o pellet para isolamento de proteínas nativas.

Resus suspende os pellets em tampão de lise a um volume final de 30 mililitros com o pellet ressuspenso no gelo. Defina o sonicado em uma amplitude de 30% com um pulso de 30 segundos em 30 segundos desligado e sonicate por cinco minutos. Balançando o tubo para cima e para baixo durante a sonicação para quebrar completamente o pellet celular.

Centrifugue a pasta a 20.500 vezes a gravidade e quatro graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo e descarte o pellet. Para realizar cromatografia de afinidade em uma proteína isolada não nativa, adicione um mililitro de solução de resina NTA de níquel a cada tubo de centrífuga e incube em um mutador ou agitador em temperatura ambiente por pelo menos uma hora.

Despeje a pasta em uma coluna de afinidade e deixe a solução escorrer completamente pela válvula da torneira de bloqueio para um copo de resíduos. Adicione 10 mililitros de tampão de lavagem ao tubo da centrífuga para remover a resina residual e adicione a solução à coluna depois que a solução pingar. Use uma vareta de vidro para mexer a resina e deixe-a terminar de pingar antes de adicionar outra lavagem.

Em seguida, use 10 mililitros de tampão de lavagem para repetir o enxágue do tubo da centrífuga e transferi-lo para a coluna. Em seguida, execute mais oito lavagens da coluna com 10 mililitros de tampão de lavagem de lise para cada lavagem. Após a conclusão das lavagens, feche a torneira de batente e substitua o copo de resíduos pelo tubo de centrifugação de 50 ml.

Adicione 15 mililitros de tampão eluciano à coluna, mexa a resina e deixe a solução descansar por cinco minutos. Em seguida, abra a torneira de parada e colete o EIT antes de repetir com mais 15 mililitros de tampão de eluição para purificar uma proteína nativa. Depois de adicionar a resina de níquel NTA à solução proteica, incubada em um mutador a quatro graus Celsius por pelo menos uma hora.

Depois de usar o tampão de lavagem para lavar a coluna 10 vezes, adicione cinco mililitros de tampão de eluição e incube a resina por cinco minutos antes de usar um tubo novo para coletar a maior parte do EIT enquanto o EIT está pingando da coluna, adicione 90 microlitros por poço de reagente de Bradford a uma placa transparente de 96 poços. Após cada elucian de cinco mililitros com tampão, deixe 10 microlitros de solução pingarem da coluna para um poço contendo 90 microlitros de reagente de Bradford. Continue com a EEU até que a proteína não seja mais detectada para diálise e / ou Rena.

As proteínas transferem cada TIE para o tubo de diálise e dialisam contra o tampão apropriado, um por quatro horas a quatro graus Celsius antes de serem substituídas pelo respectivo tampão. Dois durante a noite a quatro graus Celsius. Use concentradores de spin para concentrar as proteínas dialisadas em menos de cinco mililitros e purifique ainda mais usando cromatografia de exclusão de tamanho, se desejado até oito.

De acordo com o protocolo de texto durante a expressão do teste, NGF e SE três A foram induzidos pela primeira vez por quatro horas a 37 graus Celsius e a análise de página SDS determinou que ambas as proteínas estavam localizadas nesta fração solúvel. A expressão da proteína parecia razoável e, portanto, outra expressão de teste com indução noturna a 18 graus Celsius foi examinada. A expressão de NGF melhorou na fração solúvel, enquanto não houve diferença perceptível com SEMA três.

Um NGF foi isolado em condições nativas e não nativas e percorrido pela coluna FPLC para purificação. Embora o NGF estivesse na fração solúvel durante a expressão do teste, o isolamento nativo produziu um baixo rendimento nas induções de 37 graus Celsius e 18 graus Celsius. No entanto, uma maior produtividade de NGF foi obtida através do isolamento não nativo com renaturação.

Como resultado, o NGF foi isolado em condições não nativas. Após indução noturna a 18 graus Celsius, o isolamento não nativo resultou em nenhuma produção de SEMA três a com 8,61 mais ou menos 3,1 miligramas por cultura principal de dois litros para isolamento nativo. Portanto, o SEMA três A foi induzido por quatro horas a 37 graus Celsius e isolado usando parâmetros de isolamento nativos.

Os picos de FPLC foram coletados e as amostras de NGF e SEMA três A foram analisadas com a página SDS. Picos de proteína adicionais encontrados na saída de FPLC para SEMA três A foram coletados e analisados com página SDS e não foram localizados na região de peso molecular SEMA três a. Essas frações são provavelmente produtos de degradação porque não se comportaram funcionalmente em ensaios baseados em células, como fizeram os três SEMA.

Um pico indicado aqui. Uma vez estabelecida e dominada a proteína recombinante, o isolamento e a purificação devem levar apenas alguns dias se realizados corretamente. No entanto, os estágios iniciais de transformação de bactérias e teste de expressão de teste levam mais tempo para identificar adequadamente a solubilidade da proteína.

Uma vez que a solubilidade é determinada, uma biblioteca das bactérias transformadas pode ser armazenada em menos 80. Além disso, após a expressão da proteína, os pellets de E coli também podem ser armazenados no menos 80 até mais isolamento e experimentação. Ao tentar este procedimento, é importante certificar-se de que os tampões sejam esterilizados e frescos para evitar que as proteases se desnaturem e quebrem suas proteínas.

Os tampões de isolamento devem ser feitos e esterilizados a cada quatro a seis semanas, e os tampões de diálise devem ser feitos um dia antes do isolamento. As colunas N-I-N-T-A e FPLC devem ser limpas de acordo com os protocolos do fabricante, a fim de evitar a contaminação cruzada de várias proteínas biotiniladas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como expressar, isolar e purificar proteínas biotiniladas personalizadas usando um sistema de expressão do hospedeiro bacteriano.

Isso é semelhante ao que é feito científica e comercialmente em pequena e grande escala. Assim, isso tem ampla aplicação.