Name: Expressão, isolamento e purificação do solúveis e insolúveis biotinilados Proteínas de Tecido Nervoso Regeneração (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-22T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Aprenda a expressão, isolamento e purificação de proteínas biotiniladas recombinantes usando células bacterianas e cromatografia de afinidade. Este método permite obter altos rendimentos para aplicações em biotecnologia e engenharia de tecidos.

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Os autores gostariam de agradecer a Universidade de Akron para o financiamento que apoiaram este trabalho.

<ol><li>Itakura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+in+Escherichia+coli+of+a+chemically+synthesized+gene+for+the+hormone+somatostatin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin.</a> Science. 198 (4321), 1056-1063 (1977).</li>
<li>Goeddel, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+in+Escherichia+coli+of+chemically+synthesized+genes+for+human+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Expression in Escherichia coli of chemically synthesized genes for human insulin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 (1), 106-110 (1979).</li>
<li>Romano, N. H., Sengupta, D., Chung, C., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-engineered+biomaterials%3A+nanoscale+mimics+of+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Protein-engineered biomaterials: nanoscale mimics of the extracellular matrix.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1810 (3), 339-349 (2011).</li>
<li>Sengupta, D., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-engineered+biomaterials%3A+highly+tunable+tissue+engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Protein-engineered biomaterials: highly tunable tissue engineering scaffolds.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 16 (3), 285-293 (2010).</li>
<li>Kamionka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+therapeutic+proteins+production+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering of therapeutic proteins production in Escherichia coli.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 12 (2), 268-274 (2011).</li>
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<li>Wen, F., Nair, N. U., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+engineering+in+designing+tailored+enzymes+and+microorganisms+for+biofuels+production%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Protein engineering in designing tailored enzymes and microorganisms for biofuels production.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 20 (4), 412-419 (2009).</li>
<li>Singh, R. K., Tiwari, M. K., Singh, R., Lee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+protein+engineering+to+immobilization%3A+promising+strategies+for+the+upgrade+of+industrial+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">From protein engineering to immobilization: promising strategies for the upgrade of industrial enzymes.</a> Int. J. Mol. Sci. 14 (1), 1232-1277 (2013).</li>
<li>Bernaudat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+expression+of+membrane+proteins%3A+choosing+the+appropriate+host%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host.</a> PLoS One. 6 (12), (2011).</li>
<li>McCormick, A. M., Wijekoon, A., Leipzig, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+immobilization+of+biotinylated+fusion+proteins+NGF+and+Sema3A+utilizing+a+photo-cross-linkable+diazirine+compound+for+controlling+neurite+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific immobilization of biotinylated fusion proteins NGF and Sema3A utilizing a photo-cross-linkable diazirine compound for controlling neurite extension.</a> Bioconjug. Chem. 24 (9), 1515-1526 (2013).</li>
<li>Studier, F. W., Daegelen, P., Lenski, R. E., Maslov, S., Kim, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+differences+between+genome+sequences+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22B+strains+REL606+and+BL21%28DE3%29+and+comparison+of+the+E.+coli+B+and+K-12%22%5BJournal%5D)">Understanding the differences between genome sequences of Escherichia coli.</a> B strains REL606 and BL21(DE3) and comparison of the E. coli B and K-12. 394 (4), 653-680 (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Novagen+pET+System+Manual%22">Novagen pET System Manual</a>. Merck KGaA, , 11, User Protocol TB055 Rev. C 0611JN. Darmstadt, Germany. 1-63 (2011).</li>
<li>Balbas, P., Bolivar, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Back+to+basics%3A+pBR322+and+protein+expression+systems+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Back to basics: pBR322 and protein expression systems in E. coli.</a> Methods Mol. Biol. 267, 77-90 (2004).</li>
<li>Studier, F. W., Moffatt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bacteriophage+T7+RNA+polymerase+to+direct+selective+high-level+expression+of+cloned+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol.%22%5BJournal%5D)">Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes.</a> J. Mol. Biol.. 189 (1), 113-130 (1986).</li>
<li>Dubendorff, J. W., Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+basal+expression+in+an+inducible+T7+expression+system+by+blocking+the+target+T7+promoter+with+lac+repressor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor.</a> J. Mol. Biol. 219 (1), 45-59 (1991).</li>
<li>Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Dubendorff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+T7+RNA+polymerase+to+direct+expression+of+cloned+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes.</a> Methods Enzymol. 185, 60-89 (1990).</li>
<li>Tucker, J., Grisshammer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+a+rat+neurotensin+receptor+expressed+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J.%22%5BJournal%5D)">Purification of a rat neurotensin receptor expressed in Escherichia coli.</a> Biochem. J.. 317, 891-899 (1996).</li>
<li>Schatz, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+peptide+libraries+to+map+the+substrate+specificity+of+a+peptide-modifying+enzyme%3A+a+13+residue+consensus+peptide+specifies+biotinylation+in+Escherichia+coli%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Use of peptide libraries to map the substrate specificity of a peptide-modifying enzyme: a 13 residue consensus peptide specifies biotinylation in Escherichia coli).</a> Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).</li>
<li>Anfinsen, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+that+govern+the+folding+of+protein+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Principles that govern the folding of protein chains.</a> Science. 181 (4096), 223-230 (1973).</li>
<li>Villaverde, A., Carrio, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+in+recombinant+bacteria%3A+biological+role+of+inclusion+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation in recombinant bacteria: biological role of inclusion bodies.</a> Biotechnol. Lett. 25 (17), 1385-1395 (2003).</li>
<li>Leipzig, N. D., Wylie, R. G., Kim, H., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+neural+stem+cells+in+three-dimensional+growth+factor-immobilized+chitosan+hydrogel+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Differentiation of neural stem cells in three-dimensional growth factor-immobilized chitosan hydrogel scaffolds.</a> Biomaterials. 32 (1), 57-64 (2011).</li>
<li>Tam, R. Y., Cooke, M. J., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+covalently+modified+hydrogel+blend+of+hyaluronan-methyl+cellulose+with+peptides+and+growth+factors+influences+neural+stem%2Fprogenitor+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem%22%5BJournal%5D)">A covalently modified hydrogel blend of hyaluronan-methyl cellulose with peptides and growth factors influences neural stem/progenitor cell fate.</a> J. Mater. Chem. 22, 19402-19411 (2012).</li>
<li>Li, H., Wijekoon, A., Leipzig, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Differentiation+of+Neural+Stem+Cells+in+Macroporous+Photopolymerizable+Hydrogel+Scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">3D Differentiation of Neural Stem Cells in Macroporous Photopolymerizable Hydrogel Scaffolds.</a> PLoS One. 7 (11), (2012).</li>
<li>McCormick, A. M., Leipzig, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+regenerative+strategies+incorporating+biomolecular+axon+guidance+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Neural regenerative strategies incorporating biomolecular axon guidance signals.</a> Ann. Biomed. Eng. 40 (3), 578-597 (2012).</li>
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<li>Bayer, E. A., Wilchek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+biotinylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Protein biotinylation.</a> Methods Enzymol. 184, 138-160 (1990).</li>
<li>Weber, P. C., Ohlendorf, D. H., Wendoloski, J. J., Salemme, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+origins+of+high-affinity+biotin+binding+to+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural origins of high-affinity biotin binding to streptavidin.</a> Science. 243 (4887), 85-88 (1989).</li>
<li>Chen, I., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+labeling+of+proteins+with+small+molecules+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Site-specific labeling of proteins with small molecules in live cells.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 16 (1), 35-40 (2005).</li>
<li>Howarth, M., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+proteins+in+live+mammalian+cells+with+biotin+ligase+and+monovalent+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging proteins in live mammalian cells with biotin ligase and monovalent streptavidin.</a> Nat. Protoc. 3 (3), 534-545 (2008).</li>
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<li>Marek, P., Senecal, K., Nida, D., Magnone, J., Senecal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+biotin+functionalized+QD+assay+for+determining+available+binding+sites+on+electrospun+nanofiber+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Application of a biotin functionalized QD assay for determining available binding sites on electrospun nanofiber membrane.</a> J. Nanobiotechnol. 9, 48 (2011).</li>
<li>Cull, M. G., Schatz, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylation+of+proteins+in+vivo+and+in+vitro+using+small+peptide+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Biotinylation of proteins in vivo and in vitro using small peptide tags.</a> Methods Enzymol. 326, 430-440 (2000).</li>
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<li>Tokatlian, T., Shrum, C. T., Kadoya, W. M., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease+degradable+tethers+for+controlled+and+cell-mediated+release+of+nanoparticles+in+2-+and+3-dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Protease degradable tethers for controlled and cell-mediated release of nanoparticles in 2- and 3-dimensions.</a> Biomaterials. 31 (31), 8072-8080 (2010).</li>
<li>Gill, R. T., Valdes, J. J., Bentley, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+global+stress+gene+regulation+in+response+to+overexpression+of+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Metab.+Eng%22%5BJournal%5D)">A comparative study of global stress gene regulation in response to overexpression of recombinant proteins in Escherichia coli.</a> Metab. Eng. 2 (3), 178-189 (2000).</li>
<li>Sivashanmugam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+protocols+for+production+of+very+high+yields+of+recombinant+proteins+using+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Practical protocols for production of very high yields of recombinant proteins using Escherichia coli.</a> Protein Sci. 18 (5), 936-948 (2009).</li>
<li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein production and purification.</a> Nat. Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Marston, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+purification+of+eukaryotic+polypeptides+synthesized+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">The purification of eukaryotic polypeptides synthesized in Escherichia coli.</a> Biochem. J. 240 (1), 1-12 (1986).</li>
<li>Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+expression+of+recombinant+proteins+in+the+cytoplasm+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli.</a> Microb. Cell Fact. 4 (1), (2005).</li>
<li>de Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone-based+procedure+to+increase+yields+of+soluble+recombinant+proteins+produced+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli.</a> BMC Biotechnol. 7, 32 (2007).</li>
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<li>Li, Y., Sousa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+E.+coli+BirA+biotin+ligase+for+in+vitro+biotinylation%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of E. coli BirA biotin ligase for in vitro biotinylation.</a> Protein Expr. Purif. 82 (1), 162-167 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Engenharia de proteínas recombinantes é uma técnica muito poderosa que se estende por muitas disciplinas. É rentável, sintonizável e um procedimento relativamente simples, permitindo a produção de altos rendimentos de proteínas personalizados. É importante notar que a concepção e expressão de proteínas-alvo nem sempre é directa. Expressão basal e estabilidade da proteína recombinante depender de escolhas específicas de vetoriais, E. estirpes de E. coli, células de adições marca peptídica e parâmetros d...

Proteínas de cobrir uma vasta gama de biomoléculas que são responsáveis ​​por muitas funções biológicas, levando à formação de tecido adequado e organização. Estas moléculas de milhares de iniciar as vias de sinalização que controlam a regulação positiva e / ou sub-regulação de genes e outras proteínas, mantendo o equilíbrio dentro do corpo humano. O rompimento de uma única proteína afeta toda esta teia de sinais, que podem levar ao aparecimento de distúrbios ou doenças devastadoras. Engenharia proteínas individuais no laboratório oferece uma solução para combater estes efeitos adversos e oferece uma alternativa aos medicamentos de pequenas moléculas. Em 1977, um gene que codifica a sequência de aminoácidos de somatostatina 14 foi um dos primeiros polipeptídeos engenharia criadas utilizando E. coli 1. Logo depois, em 1979, a insulina foi clonado no plasmídeo pBR322, transformada, expressa, purificada e 2. Desde então, as proteínas recombinantes têm expandido sua influência em vários campos da research como biomateriais, a entrega da droga, engenharia de tecidos, biofármacos, agricultura, enzimas industriais, biocombustíveis, etc (para revisões ver referências 3-8). Isto é principalmente devido à versatilidade que a técnica oferece através da adição de porções de aplicação de produtos químicos específicos ou sequências de proteínas para fins incluindo, mas não limitado a, a identificação das proteínas alvo, de estabilização e de purificação. Através da tecnologia de DNA recombinante, as proteínas recombinantes podem ser expressas em uma variedade de sistemas de hospedeiros eucariotas e procariotas, incluindo mamíferos, plantas, insectos, leveduras, fungos e bactérias. Cada host oferece diferentes vantagens e, normalmente, o melhor sistema é determinado com base na função da proteína, rendimento, estabilidade, custo total, e escalabilidade. Células de bactérias, muitas vezes não têm os mecanismos de modificação pós-traducionais que os anfitriões fornecem eucarióticas (ou seja, glicosilação, dissulfeto de transição, e<html> tc.) 5. Como resultado, os sistemas de mamífero e de insecto geralmente resultam em melhor compatibilidade e de expressão de proteínas eucarióticas, no entanto estes hospedeiros são geralmente mais caros e 9 demorado. Portanto, E. coli é o hospedeiro preferido para o nosso sistema de expressão, porque as células se expandem rapidamente em condições de crescimento de baixo custo e os mecanismos de expressão genética são bem compreendidos 5,9. Além disso, este sistema é de fácil aumento de escala para fins de produção e resulta em proteínas funcionais, apesar da ausência de modificações pós-translacionais 10. A E. coli K12 tensão é escolhida neste protocolo para a clonagem, porque esta estirpe oferece excelentes rendimentos plasmídeos baseados em alta eficiência de transformação. Além disso, uma E. coli estirpe BL21 utilizado para a expressão porque esta estirpe hospedeira contem o gene da RNA polimerase de T7, que proporciona a expressão da proteína e da estabilidade controlada 11. tenda &quot;&gt; Após a seleção anfitriã, mais cuidado deve ser tomado na escolha do vetor de expressão ideal para facilitar selecionados e controlados expressão da proteína. Sintetizando proteínas recombinantes começa com uma sequência de DNA alvo que é clonado sob a direção de transcrição bacteriófago T7 e sinais de tradução e expressão é induzida em células hospedeiras contendo cópias cromossómicas do gene da T7 ARN polimerase 12. Estes vectores, derivados de pBR322 plasmídeo vector (para uma revisão ver referência 13), é rigorosamente controlada pelo promotor T7 inicialmente desenvolvido por Studier e colegas 14 e fornecer adicional controlo por meio da inclusão do operador lac e o repressor lac (LAC1) 15,16. Para a engenharia de proteína recombinante, este sistema de expressão oferece a possibilidade de adaptar a uma sequência específica de aminoácidos de uma proteína desejada através da inserção de sequências de DNA alvo diferentes ou para criar proteínas de fusão composta de domínio combinados de proteínas individuais. Além disso, algumas séries de vetores incluem modificações tag peptídeo a ser colocados no N ou C terminal. Para os nossos propósitos de desenho, uma histidina (His) tag foi adicionado à sequência de ADN alvo para a purificação e uma sequência de 15 aminoácidos biotinylatable foi incluído para biotinilação 17,18. Neste protocolo de um plasmídeo contendo um gene de resistência à ampicilina, foi escolhido para realizar os nossos sequências de proteínas de fusão biotinylatable. A expressão é controlada por este vector, através do promotor lac de T7 e é facilmente induzida com isopropil β-D-1-tiogalactopiranosido (IPTG). Expressões de ensaio (culturas em pequena escala) são usados ​​para determinar a presença e a solubilidade da proteína alvo, que pode ser expresso numa forma solúvel ou insolúvel para formular os procedimentos de purificação. Uma proteína solúvel expressa dentro da célula bacteriana será submetido a dobragem espontânea para manter a sua estrutura nativa 19. Tipicamente, o nativoestrutura é termodinamicamente favorável. Em muitos casos, a actividade metabólica do hospedeiro não é favorável para a proteína alvo, colocando pressão no sistema que leva à produção de proteína insolúvel e a formação de corpos de inclusão na forma de agregados de proteínas insolúveis. Assim, a proteína alvo desnatura, tornando-os biologicamente inactivos, geralmente 20. Ambas as expressões de ensaio são incrementados, e os procedimentos de isolamento é determinada pela solubilidade da proteína alvo. Um adicional de renaturação ou redobramento etapa é necessária para as proteínas insolúveis. As proteínas recombinantes resultantes podem ser ainda purificado usando cromatografia de exclusão de tamanho. No casa de produção de proteína recombinante oferece vantagens de custo sobre os produtos comerciais desde miligramas de proteína alvo pode ser isolado por litro de cultura principal. A maior parte do equipamento necessário está disponível num laboratório biológico ou químico típico. Engenharia de proteínas permite a criaçãode proteínas de fusão de costume com funcionalidades adicionais que nem sempre estão disponíveis comercialmente. Figura 1 mostra os principais procedimentos envolvidos na engenharia de proteínas recombinantes. Com este sistema de expressão que criamos muitas proteínas biotinylatable, como o interferon-gama, fator de crescimento derivado das plaquetas e proteína morfogenética óssea-21-23, mas vamos nos concentrar em duas proteínas que nós projetamos para orientação do axônio, NGF (29 kDa ) e SEMA3A (91 kDa) 10 (para revisão ver referência 24). A biotinilação é uma técnica comum para a identificação, a imobilização e isolamento de proteínas marcadas utilizando a interacção biotina-estreptavidina bem conhecido 25-27. Sondas biofísicas 28,29, biossensores 30, e quantum dots 31 são alguns exemplos de sistemas que utilizam a alta afinidade de conjugação biotina-estreptavidina com um K d da ordem de 10 -15 M 27. A E. coli bioligase de estanho, BirA, auxilia na ligação covalente de biotina para a cadeia lateral de lisina encontrada no interior da sequência de biotina marcado 18,32. Tethering biotina aos materiais e biomoléculas produziu entrega sustentada de fatores de crescimento para a célula para múltiplas aplicações em engenharia de tecidos 21,33-35. Portanto, engenharia estas proteínas biotinylatable design personalizado é uma ferramenta poderosa que pode transcender a múltiplos interesses de pesquisa.

<table><tbody><tr><td>1,4-Ditio-DL-treitol, DTT, 99,5%</td><td>Chem-Impex International</td><td>127</td><td>100 g</td></tr><tr><td>2-Hidroxietilmercaptano &beta;-Mercaptoetanol</td><td>Chem-Impex International</td><td>642</td><td>250 ml</td></tr><tr><td>Ácido acético, glacial</td><td>EMD</td><td>AX0073-9</td><td>2,5 L</td></tr><tr><td>Ágar</td><td>Bioshop</td><td>AGR001.500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Sal de ampicilina sódica&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Antiespumante 204</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6426</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Barstar-NGF pET-21a(+)</td><td>GenScript USA Inc.</td><td></td><td>4 &micro; g</td></tr><tr><td>BL21(DE3) Células Competentes</td><td>Novagen</td><td>69450</td><td>1 ml; Expression Host</td></tr><tr><td>Bradford reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>BugBuster</td><td>Novagen</td><td>70922-3</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Filtração em gel padrão</td><td>Bio-Rad</td><td>151-1901</td><td>6 frascos</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Bioshop</td><td>GLY001.1</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Hidrodiorido de guanidina cloridrato de amioformamidina</td><td>Chem-Impex International</td><td>152</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Resina Ni-NTA His-Pur</td><td>Thermo Scientific</td><td>88222</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>EMD</td><td>HX0603-3</td><td>2.5 L</td></tr><tr><td>Imidazole&nbsp;</td><td>Chem-Impex International</td><td>418</td><td>250 g</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Chem-Impex International</td><td>194</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Tampão de amostra Laemmli</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td>30 ml</td></tr><tr><td>Lauril sulfato de sódio sal, Dodecil de sódio superfície</td><td>Chem-Impex International</td><td>270</td><td>500 g</td></tr><tr><td>LB Caldo&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>NovaBlue Células Competentes</td><td>Novagen</td><td>69825</td><td>1 ml; Clonagem de</td></tr><tr><td>Hospedeiro Fosfato tamponado solução salina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td>10 pacote</td></tr><tr><td>de Cloreto de Potássio</td><td>Chem-Impex International</td><td>01247</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Sema3A-pET-21a(+)</td><td>GenScript USA Inc.</td><td></td><td>4 &micro; g</td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886-1KG</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio diabásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136-500G</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5011</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Ótimo caldo</td><td>Bioshop</td><td>TER409.5</td><td>5 kg</td></tr><tr><td>Cloridrato de tetraciclina</td><td>Chem-Impex International</td><td>667</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Tris/Glicina/SDS Tampão, 10x</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Base Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Triptona, pancreática</td><td>EMD</td><td>1.07213.1000</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Extrato de levedura, EMD granulado</td><td></td><td>1.03753.0500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>&nbsp; &Auml; KTApurifier10</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4062-64</td><td>Inclui kits e acessórios</td></tr><tr><td>Agitador Orbital de Bancada</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE4000</td><td>MAXQ 4000</td></tr><tr><td>BirA500</td><td>Avidity</td><td>BirA500</td><td>Enzyme vem com tampões de reação e solução de biotina</td></tr><tr><td>Casette de Diálise</td><td>Thermo Scientific</td><td>66380</td><td>Slide-A-Lyzer (Força Extra)</td></tr> <tr><td>Tubo de Diálise</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>132127, 132129</td><td>MWCO: Válvula de desvio de fluxo de 25.000 e 50.000</td></tr><tr><td>FV-923</td><td>GE Healthcare</td><td>11-0011-70</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensaio de quantificação de biotina FluoReporter</td><td>Invitrogen</td><td>1094598</td><td></td></tr><tr><td>Frac-950 Tube Racks, Rack C</td><td>GE Healthcare</td><td>18-6083-13</td><td></td></tr><tr><td>Coletor de frações Frac-950</td><td>GE Healthcare</td><td>18-6083-00</td><td>Inclui kits e acessórios</td></tr><tr><td>Circulador Aquecido/Refrigerado&nbsp;</td><td>VWR</td><td>13271-102</td><td>Modelo 1156D</td></tr><tr><td>Forno de Aquecimento Série FD</td><td>Fichário</td><td></td><td>Modelo FD 115</td></tr><tr><td>HiLoad 16/60 Superdex 200 pg</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1069-01</td><td>Descontinuado--Produto de Substituição: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td></tr><tr><td>J-26 XPI Avanti Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>393126</td><td></td></tr><tr><td>JA 25.50 Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>363055</td><td></td></tr><tr><td>JLA 8.1 Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>969329</td><td>Inclui garrafas de poliporpileno de 1 L</td></tr><tr><td>JS 5.3 Rotor Beckman</td><td>Coulter</td><td>368690</td><td></td></tr><tr><td>Capuz de Fluxo Laminar</td><td>Themo Scientific</td><td>1849</td><td>Forma 1800 Series Clean Bench</td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>TECAN</td><td></td><td>infinite M200</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>165-8004</td><td>4-gel vertical sistema de eletroforese</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Géis Pré-moldados</td><td>Bio-Rad</td><td>456-9036</td><td>Qualquer kDa, pente de 15 poços</td></tr><tr><td>Coluna Ni-NTA</td><td>Bio-Rad</td><td>737-2512</td><td>49 ml&nbsp; Volume ECONO-Column</td></tr><tr><td>Plasmid Miniprep Kit</td><td>Omega Bio-Tek</td><td>D6943-01</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac HC Fonte de Alimentação</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5052</td><td>250 V, 3 A, 300 W</td></tr><tr><td>Tubos de Copolímero de Polipropileno de Fundo Redondo</td><td>VWR</td><td>3119-0050</td><td>50 ml&nbsp; tubos para rotor JA 25.50</td></tr><tr><td>Spin-X UF Concentrators</td><td>Corning</td><td>431488, 431483</td><td>&nbsp; 20 e 6 ml; MWCO: 10.000 Da</td></tr><tr><td>Serviço de Subclonagem</td><td>GenScript USA Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Processador Ultrassônico Protein Services</td><td>Cole-Parmer</td><td>18910445A</td><td>Modelo CV18</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Indústrias Científicas</td><td>SI-0236</td><td>Modelo G560</td></tr></tbody></table>

expressão, isolamento e purificação do solúveis e insolúveis biotinilados proteínas de tecido nervoso regeneração

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Engenharia de proteínas recombinantes utilizou Escherichia coli (E. coli) para sistemas de expressão de quase quatro décadas, e hoje E. coli é ainda o organismo hospedeiro mais utilizado. A flexibilidade do sistema permite a adição de porções tais como uma etiqueta de biotina (para interacção com estreptavidina) e proteínas funcionais maiores, como a proteína fluorescente verde ou proteína vermelho cereja. Além disso, a integração de aminoácidos não naturais como quelantes de iões de metais, grupos funcionais reactivos, exclusivamente sondas espectroscópicas, e as moléculas que conferem modificações pós-traducionais permitiu uma melhor manipulação de propriedades de proteína e funcionalidades. Como resultado desta técnica cria proteínas de fusão personalizáveis ​​que oferecem utilidade significativa para vários campos de pesquisa. Mais especificamente, a sequência da proteína biotinylatable foi incorporado em muitas proteínas alvo, devido à interacção de alta afinidade entre biotina com a avidina e estreptavidina. Esta adição tem ajudado no aumento da detecção e purificação de proteínas marcadas, bem como abrindo o caminho para aplicações secundárias, tais como separação de células. Assim, as moléculas marcadas com biotina mostram uma influência crescente e generalizada nos campos Bioindustrial e biomédicas. Para efeitos de nossa pesquisa, temos projetado proteínas de fusão biotinilado recombinantes contendo fator de crescimento do nervo (NGF) e semaphorin3A (SEMA3A) regiões funcionais. Nós temos descrito anteriormente como estas proteínas de fusão biotinilado, juntamente com outras sequências de proteínas activas, pode ser preso a biomateriais para a engenharia de tecidos e efeitos regenerativos. Este protocolo descreve os conceitos básicos de proteínas biotinylatable engenharia na escala miligrama, utilizando um vetor lac induzível T7 e E. hospedeiros de expressão de E. coli, a partir da transformação de aumento de escala e purificação.

<html> Clonagem e Expressão de teste Quando chapeamento é realizado corretamente, único colônias isoladas devem formar a aumentar as chances de arrancar bactérias clonal transformaram células (Figura 2A). No entanto, se demasiadas células são plaqueadas, as placas são incubadas por muito tempo, a 37 ° C ou a transformação é questionável, as colónias podem cobrir a placa de ágar ou de formar agregados maiores de células (Figuras 2B e 2...

Desenvolvimento de proteínas de fusão biotinylatable tem muitas aplicações potenciais em diversas áreas de pesquisa. Engenharia de proteínas recombinantes é um procedimento para a frente que é eficaz em termos de custos, rendimentos elevados de proteínas personalizados.

Expressão, isolamento e purificação do solúveis e insolúveis biotinilados Proteínas de Tecido Nervoso Regeneração

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

O objetivo geral deste procedimento é projetar, expressar e isolar com sucesso proteínas recombinantes biotiniladas que possam ser incorporadas em diversas aplicações, como sondas, sensores, entrega de fármacos e engenharia de tecidos. Isso é realizado primeiramente transformando o plasmídeo projetado sob medida em uma linhagem celular bacteriana utilizando culturas em pequena escala e, em seguida, induzindo a expressão da proteína alvo. Em seguida, determina-se a presença e a solubilidade da proteína alvo para formular procedimentos adequados de purificação.Em seguida, o procedimento é ampliado para produzir maiores quantidades da proteína alvo, que são então isoladas utilizando técnicas de cromatografia de afinidade. Por fim, as proteínas são purificadas e concentradas para aplicações e análises posteriores. Em última instância, os resultados de eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS e de FPLC confirmam que as proteínas recombinantes foram isoladas e purificadas com sucesso, e as proteínas são submetidas a testes adicionais para verificação de funcionalidade.A principal vantagem da engenharia de proteínas recombinantes é que ela nos permite criar quantidades em larga escal

expression-isolation-purification-soluble-insoluble-biotinylated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Este vídeo demonstra o isolamento de proteínas intracelulares e de superfície celular de uma cultura de astrócitos. A cultura de astrócitos é colocada no gelo para inibir a endocitose e, em seguida, as proteínas da superfície celular são marcadas com um reagente de biotinilação. As células são lisadas para liberar as proteínas da superfície celular biotiniladas e as proteínas intracelulares não biotiniladas. Finalmente, grânulos revestidos com estreptavidina são usados para separar as proteínas...

Isolamento de Proteínas de Superfície Celular e Intracelulares de uma Cultura de Astrócito

Tráfico de membrana neuronal controla dinamicamente membrana disponibilidade de proteína plasmática e significativamente impactos neurotransmissão. Até à data, tem sido um desafio para medir tráfico endocítico neuronal em neurônios adultos. Aqui, descrevemos um método altamente eficaz, quantitativo para medir as mudanças rápidas na expressão de proteínas de superfície ex vivo em fatias cerebrais agudas.

Cérebro Fatia Biotinilação: Uma<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Abordagem medir Região específicas do tráfego de proteínas de membrana plasmática em adultos Neurônios

O transporte axonal de BDNF, um factor neurotrófico, é crítico para a sobrevivência e função de várias populações neuronais. Algumas desordens degenerativas são marcadas pela ruptura da estrutura e função axonal. Nós demonstramos as técnicas utilizadas para examinar o tráfico ao vivo do QD-BDNF em câmaras microfluídicos usando neurônios primários.

Imagens em tempo real de axonal Transporte de Quantum Dot marcado BDNF na Primária Neurônios

Este protocolo apresenta um método para a recuperação morfológica dos neurónios durante patched registos electrofisiolicos utilizando biocitina de enchimento e de pós-processamento subsequente imuno-histoquímica. Mostramos que as seções encheu-biocitina grossas que estavam manchados e lamínulas pode ser restained com um segundo dia de anticorpos primários ou meses mais tarde.

Imunocoramento Secções biocitina-preenchidos e processados ​​para neuroquímicos Markers

Utilizou-se uma metodologia baseada em gradiente de centrifugação por densidade modificada para isolar células epiteliais do tecido intestinal de Rhipicephalus microplus . As proteínas ligadas à superfície foram biotiniladas e purificadas através de esferas magnéticas de estreptavidina para utilização em aplicações a jusante.

Purificação de proteínas de superfície de células biotiniladas de<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Células intestinais epiteliais

São apresentados neste relatório dois métodos baseados em biotinilação, projetados para determinar a expressão da superfície celular e a taxa endocítica de proteínas expressas na membrana plasmática.

Determinando a expressão da superfície celular e a taxa endocítica de proteínas em culturas primárias de astrocitos usando a biotinilação

Aqui nós apresentamos um protocolo para murino na vivo rotulagem das proteínas de superfície celular glomerular com biotina. Este protocolo contém informações sobre como perfundir os rins do rato, isolar glomérulos e executar endógena imunoprecipitação da proteína de interesse.

Isolamento de glomérulos e In Vivo de rotulagem das proteínas de superfície celular Glomerular

Aqui apresentamos um protocolo que combina um sistema de cocultura neural-endotelial in vitro e incorporação metabólica de sialoglicano com grupos funcionais bioortogonais para expandir as células primárias de tronco neural e progenitoras e rotular sua superfície sialoglycoproteínas para a análise da imagem latente ou da massa-espectrometria de marcadores da superfície da pilha.

Identificando marcadores de superfície celular da haste neural primária e células progenitoras por rotulagem metabólica de Sialoglycan

São apresentados aqui protocolos para ensaios bioquímicos in vitro usando rótulos de biotina que podem ser amplamente aplicáveis para o estudo de interações ácido proteína-nucleico.

Ensaios bioquímicos in vitro utilizando rótulos de biotina para estudar interações ácido proteína-nucleico

BDNF recombinante contendo uma sequência de Avi (BDNFAvi) é produzido em células HEK293 de forma econômica e é purificado por cromatografia de afinidade. BDNFavi é então diretamente mono-biotiningado com a enzima BirA em um tubo. BDNFavi e BDNFavi mono-biotiniladas mantêm sua atividade biológica quando comparadas com bdnf disponíveis comercialmente.

Um protocolo aprimorado para purificar e diretamente mono-biocombinado recombinante BDNF em um tubo para estudos de tráfico celular em neurônios

O protocolo apresenta um método para ligação covalente in vivo de biotina a proteínas com base em sua proximidade a uma biotina ligase fundida a uma proteína de interesse. Essa modificação permite um enriquecimento seletivo das proteínas usando grânulos de estreptavidina, conforme necessário em estudos de interação proteica.

In vivo Biotinilação de proximidade para estudos de interação proteica em Paramecium tetraurelia

Aprenda a expressão, isolamento e purificação de proteínas biotiniladas recombinantes usando células bacterianas e cromatografia de afinidade. Este método permite obter altos rendimentos para aplicações em biotecnologia e engenharia de tecidos.

Expressão, isolamento e purificação do solúveis e insolúveis biotinilados Proteínas de Tecido Nervoso Regeneração

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