Imagens ao vivo da mitose no desenvolvimento Cortex embrionárias de camundongos

O objetivo geral deste procedimento é realizar a imagem e análise da mitose de progenitores neurais em fatias cerebrais vivas de camundongo. Isso é realizado primeiramente dissecando cérebros de embriões. O segundo passo é preparar fatias cerebrais com um vibrátomo.

Em seguida, realiza-se a imagem viva de fatias cerebrais. O passo final é extrair informações dos vídeos para analisar os parâmetros de mitose de interesse. Em última instância, a microscopia com lapso de tempo é utilizada para mostrar como as populações de progenitores do cérebro se dividem em tempo real.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a análise fixa, é que é possível obter uma compreensão significativa da dinâmica temporal da divisão de progenitores neurais em fatias cerebrais vivas. Também pode ser utilizada para compreender como perturbações genéticas podem influenciar a divisão de progenitores neurais. Embora utilizemos este método para compreender o desenvolvimento cortical, a análise que descrevemos pode ser aplicada ao estudo da mitose de células-tronco em outras regiões cerebrais ou mesmo fora do cérebro.

Demonstrará este procedimento Louis y, um pesquisador pós-doutorando do meu laboratório. Inicie este procedimento coletando os embriões de camundongo e removendo os cérebros embrionários, incluindo os mielencéfalos e os quatro ventrículos cerebrais com os dois hemisférios cerebrais. Em um recipiente com gelo, faça um orifício no gelo para os moldes de inclusão.

Em seguida, despeje o meio aros a 3% em um molde de plástico e coloque esse molde no orifício do gelo. Agite o meio aros com a ponta de um termômetro digital até que a temperatura atinja 35 graus Celsius. Em seguida, transfira imediatamente o cérebro para o meio de inclusão para remover o excesso de HBSS na interface entre o cérebro e o aros.

Gire cuidadosa e suavemente o cérebro repetidamente na solução de inclusão. Com a pinça, um coxim de aros gelificado se formará na parte inferior do molde, em contato com o gelo. Uma vez que o coxim possa ser sentido com a ponta da pinça enquanto se movimenta o cérebro, posicione o cérebro com o lado dorsal voltado para cima; o cérebro não deve afundar até o fundo do molde.

Deixe os blocos de aros endurecerem no gelo por pelo menos cinco minutos antes de cortar os cantos do molde com uma lâmina de barbear. Escolha cuidadosamente um bloco de aros ao redor do cérebro e tente minimizar o número de cortes para evitar perturbar o cérebro embutido. Com o VT 1000 s Viome, gere fatias de 200 a 250 mícrons.

Agora, dilua o cyto 11 até uma concentração final de 0,5 a um micromolar no meio de cultura de fatias suplementado com fatores de crescimento e, em uma placa de 12 poços, incube as fatias de um cérebro em 2,5 mililitros da solução de coloração em cada poço durante uma hora a 37 graus Celsius. Em seguida, lave as fatias em 2,5 mililitros de meio de cultura de fatias sem solução de coloração por 20 minutos. Para montar as seções cerebrais, coloque uma gota de solução de colágeno no fundo de um recipiente de micropoço com fundo de vidro de 35 milímetros.

Espalhe com a ponta de uma pipeta para ajustar ao tamanho do corte. Em seguida, transfira um corte para uma gota de colágeno. Incube os cortes à temperatura ambiente por 10 minutos antes de transferi-los para uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.

Após 20 minutos, adicione um total de 1,2 mililitro de meio de cultura de fatias ao prato microscópico com fundo de vidro, 600 microlitros de meio de cada vez, distribuindo-o com a ponteira de uma pipeta. Deixe as fatias se recuperarem no incubador por pelo menos uma hora e 30 minutos a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono antes de transferi-las para a câmara de incubação do microscópio confocal de disco giratório com as mesmas condições. Quanto à imagem em tempo real, utilize uma objetiva de óleo de silício de 60 x com uma distância de trabalho de 300 mícrons e uma abertura numérica de 1,3.

Para a imagem de células, as células em um Z stack de 30 mícrons com o centro do Z stack localizado cerca de 40 mícrons abaixo da superfície da fatia. Se necessário, ajuste a potência do laser e os tempos de exposição para limitar o fotodesbotamento e use o tempo de exposição variando de 30 a 200 milissegundos, dependendo da intensidade do sinal do cyto 11. Aqui estão dados representativos que se podem obter com esta análise para identificar as figuras mitóticas na ImageJ. Após abrir o conjunto de dados para uma posição como um hyper stack, selecione um plano Z no qual o tecido e as células pareçam saudáveis.

Role para trás no tempo para identificar o ponto temporal em que a célula entra em mitose. A célula pode se mover entre planos Z, mas a resolução temporal e os parâmetros Zack descritos anteriormente foram otimizados para permitir esse processo. Em uma planilha, registre as quatro coordenadas D da célula na pilha hipertridimensional conforme ela entra em mitose.

Conhecer essas coordenadas evitará a contagem da mesma célula várias vezes. Avance no tempo e registre o momento em que a célula progride de uma fase para outra. Documente a duração de cada fase mitótica para uma determinada célula para realizar a reconstrução tridimensional das células e a quantificação da rotação durante a metáfase.

Após identificar múltiplas células mitóticas, utilize as coordenadas de uma célula e avance no tempo até o início. Na metáfase, gire todo o hiper empilhamento para que a borda ventricular fique planar. Utilize a ferramenta de ângulo para determinar o ângulo a ser aplicado para essa rotação.

Identifique o plano Z em que a célula de interesse é mais visível nesse plano. Use a ferramenta de seleção retangular para desenhar uma seleção que inclua toda a célula. Em seguida, identifique os planos Z que contêm a célula de interesse e use o comando de duplicação de imagem para criar uma subpilha.

Na caixa de diálogo, mantenha a opção de hiper pilha duplicada marcada nas fatias. O parâmetro Z corresponde aos planos Z, incluindo toda a célula, e o parâmetro de quadros T corresponde ao ponto temporal atual. Em seguida, gere uma reconstrução tridimensional da célula.

No momento atual. O espaçamento entre cortes corresponde ao intervalo entre cada uma das imagens do plano Z em mícrons. Utilizando a barra de rolagem, gire a reconstrução 3D resultante de modo que a borda da placa metafásica fique visível.

O número do quadro corresponde ao ângulo beta. Anote este número. Em seguida, meça o ângulo entre a horizontal e os alinhamentos por.

Dissecando a placa metafásica perpendicularmente. Este é o registro do ângulo alfa. Esses ângulos para todos os pontos temporais da metáfase da célula de interesse.

O ângulo de rotação entre os pontos temporais t e t menos um equivale ao valor absoluto da diferença entre um ângulo no tempo t e esse ângulo no tempo t menos um ao longo do eixo dorsal-ventral. A mitose é mais facilmente visualizada nas regiões dorsais de cortes cerebrais porque o processo basal dos RGCs é mais curto e, portanto, menos propenso a ser seccionado por um vioma. Ao longo do eixo ROS coddle, cortes nas regiões coddle do córtex dorsal fornecem os resultados mais consistentes.

Estes são exemplos de uma região adequada e de uma região inadequada para a aquisição de imagens. Em uma região adequada, os núcleos têm formato elíptico e muitas células em mitose são observadas na borda do ventrículo antes da aquisição de imagens em lapso de tempo; em uma região inadequada, são observadas pouquíssimas células em mitose na borda do ventrículo e os núcleos são arredondados.

Aqui está um exemplo de uma boa fatia observada com microscopia de baixa ampliação antes da imagem em tempo real, e aqui estão alguns exemplos de células marcadas com cyto 11 em diferentes fases da mitose. É mostrado aqui um mosaico de uma região na borda do ventrículo onde dois progenitores neurais passam pelas diferentes fases da mitose, marcadas em cores diferentes, seguindo este procedimento. Outros métodos, como a eletroporação neutra de construtos de DNA, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, incluindo qual é o destino das células em divisão e como o citoesqueleto se comporta?

Também é recomendável utilizar métodos secundários além do CY 11 para acompanhar a mitose, como camundongos transgênicos H two VGFP. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como manipular fatias cerebrais, quais parâmetros de correspondência são os melhores e como analisar os dados.