Imagens ao vivo da mitose no desenvolvimento Cortex embrionárias de camundongos

O objetivo geral deste procedimento é realizar imagens e análises da mitose do progenitor neural em fatias de cérebro de camundongos vivos. Isso é feito primeiro dissecando cérebros de embriões. O segundo passo é preparar fatias de cérebro com um vibrato.

Em seguida, é realizada a imagem ao vivo de fatias de cérebro. A etapa final é extrair informações dos filmes para analisar os parâmetros de mitose de interesse. Em última análise, a microscopia de lapso de tempo é usada para mostrar como as populações progenitoras do cérebro se dividem em tempo real.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a análise fixa, é que se pode obter uma visão significativa da dinâmica temporal da divisão do neuroprogenitor em fatias de cérebro vivas. Também pode ser usado para entender como as perturbações genéticas podem influenciar a divisão do neuroprogenitor. Embora usemos esse método para entender o desenvolvimento cortical, a análise que descrevemos pode ser aplicada ao estudo da mitose de células-tronco em outras regiões do cérebro ou mesmo fora do cérebro.

Demonstrando este procedimento estará Louis y, um pós-doutorado do meu laboratório. Comece este procedimento coletando os embriões de camundongos e disseque os cérebros embrionários, incluindo os cérebros posteriores e os quatro cérebros com os dois hemisférios cerebrais. Em um balde de gelo, crie um buraco no gelo para os moldes de embutimento.

Em seguida, despeje 3% de aros médio em um molde de plástico e coloque esse molde no buraco no gelo. Mexa o meio aros com a ponta de um termômetro digital até que a temperatura atinja 35 graus Celsius. Em seguida, transfira imediatamente o cérebro para o meio de incorporação para remover o excesso de HBSS na interface entre o cérebro e o aros.

Gire o cérebro com cuidado e cuidado repetidamente na solução de incorporação. Com a pinça, uma almofada de aros gelificado se formará na parte inferior do molde em contato com o gelo. Uma vez que a almofada pode ser sentida com a ponta da pinça enquanto mexe o cérebro, posicione o cérebro com o lado dorsal para cima, o cérebro não deve afundar até o fundo do molde.

Deixe o aros endurecer no gelo por pelo menos cinco minutos antes de cortar os cantos do molde com uma lâmina de barbear. Esculpir cuidadosamente um bloco de aros ao redor do cérebro e tentar minimizar o número de cortes para evitar perturbar o cérebro incorporado. Com o VT 1000 s Viome gerar fatias de 200 a 250 mícrons.

Agora dilua o cyto 11 até uma concentração final de 0,5 a um micromolar no meio de cultura de fatias suplementado com fatores de crescimento e uma placa de 12 poços incube fatias de um cérebro em 2,5 mililitros da solução de coloração em cada poço por uma hora a 37 graus Celsius. Em seguida, lave as fatias em 2,5 mililitros de meio de cultura sem solução de coloração por 20 minutos. Para montar as seções cerebrais, coloque uma gota de solução de colágeno no fundo de um prato de micropoços com fundo de vidro de 35 milímetros.

Espalhe com uma ponta de pipeta para combinar com o tamanho da fatia. Em seguida, transfira uma fatia para uma gota de colágeno. Deixe as fatias incubarem em temperatura ambiente por 10 minutos antes de transferi-las para uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.

Após 20 minutos, em um total de 1,2 mililitros de meio de cultura de fatia no micro fundo de vidro, coloque 600 microlitros de meio de cada vez e espalhe-o com uma ponta de pipeta. Deixe as fatias se recuperarem na incubadora por pelo menos uma hora e 30 minutos a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono antes de transferi-las para a câmara de incubação do microscópio confocal de disco giratório com as mesmas condições. Quanto à imagem ao vivo, use uma objetiva de óleo de silício 60 x com uma distância de trabalho de 300 mícrons e uma abertura numérica de 1,3.

Para imagens de imagens celulares, as células em uma pilha Z de 30 mícrons com o centro da pilha Z, localizada cerca de 40 mícrons abaixo da superfície da fatia. Se necessário, ajuste a potência do laser e os tempos de exposição para limitar o fotobranqueamento e use o tempo de exposição variando de 30 a 200 milissegundos, dependendo da intensidade do sinal cyto 11. Aqui estão os dados representativos que podem ser obtidos a partir desta análise para identificar as figuras mitóticas na imagem J.Depois de abrir o conjunto de dados para uma posição como uma hiperpilha, selecione um plano Z onde o tecido e as células pareçam saudáveis.

Volte no tempo para identificar o ponto no tempo em que a célula entra em mitose. A célula pode se mover através de planos Z, mas a resolução temporal e os parâmetros Zack descritos anteriormente foram otimizados para permitir esse processo. Em uma planilha, registre as quatro coordenadas D da célula na hiperpilha quando ela entra na mitose.

Conhecer essas coordenadas impedirá a contagem da mesma célula várias vezes. Role para frente no tempo e registre o tempo em que a célula progride de uma fase para outra. Documente a duração de cada fase mitótica de uma determinada célula para realizar a reconstrução 3D das células e a quantificação da rotação durante a metáfase.

Depois que várias células mitóticas forem identificadas, use as coordenadas de uma célula e role para frente no tempo até o início. A metáfase gira toda a hiperpilha para que a borda ventricular fique mais plana. Use a ferramenta de ângulo para determinar o ângulo a ser aplicado a essa rotação.

Identifique o plano Z onde a célula de interesse é mais visível nesse plano. Use a ferramenta de seleção de retângulo para desenhar uma seleção que inclua a célula inteira. Em seguida, identifique os planos Z que incluem a célula de interesse e use o comando image duplicate para criar uma subpilha.

Na caixa de diálogo, deixe a hiperpilha duplicada marcada nas fatias. O parâmetro Z corresponde aos planos Z, incluindo toda a célula e o parâmetro T dos quadros corresponde ao ponto de tempo atual. Depois disso, gere uma reconstrução 3D da célula.

No momento atual. O espaçamento entre fatias corresponde ao intervalo entre cada uma das imagens do plano Z em mícrons. Usando a barra de rolagem, gire a reconstrução 3D resultante para que a borda da placa metafásica fique visível.

O número do quadro corresponde ao ângulo beta. Registre esse número. Em seguida, meça o ângulo entre os bys horizontal e alinhe.

Dissecando a placa metafásica perpendicularmente. Este é o registro alfa do ângulo. Esses ângulos para todos os pontos de tempo da metáfase da célula de interesse.

O ângulo de rotação entre os pontos de tempo t e t menos um é igual ao valor absoluto da diferença entre um ângulo em t e este ângulo em T menos um ao longo do eixo ventral dorsal. A mitose é mais facilmente visualizada em regiões dorsais de fatias cerebrais porque o processo basal de R GCs é mais curto e, portanto, menos provável de ser cortado por um vioma. Ao longo do eixo do mimo ROS, fatias nas regiões do córtex dorsal fornecem os resultados mais consistentes.

Estes são exemplos de uma região boa e uma região ruim para imagens. Em uma boa região. Os núcleos são de forma elíptica e muitas células mitóticas são observadas na borda do ventrículo antes da imagem de lapso de tempo em uma região ruim, muito poucas células mitóticas são observadas na borda do ventrículo e os núcleos são redondos.

Aqui está um exemplo de uma boa fatia observada com um microscópio de baixa ampliação antes da imagem ao vivo, e aqui estão alguns exemplos de células marcadas com cito-11 em diferentes fases da mitose. Aqui é mostrada uma montagem de uma região na borda do ventrículo onde dois progenitores neurais passam pelas diferentes fases da mitose marcadas em cores diferentes Seguindo este procedimento. Outros métodos, como a eletroporação neutra de construções de DNA, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, incluindo qual é o destino das células em divisão e como o citoesqueleto se comporta?

Também é melhor usar métodos secundários além do CY 11 para seguir a mitose, como H dois camundongos transgênicos VGFP. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como manipular fatias de cérebro, quais parâmetros correspondentes são melhores e como analisar os dados.