Split-and-piscina Síntese e Caracterização de Peptídeos Terciário Amide Biblioteca

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como sintetizar bibliotecas combinatórias contendo unidades de amida terciária peptídica ou PTA. Isso é realizado primeiramente preparando um submonômero PTA a partir de aminoácidos naturais. O segundo passo é sintetizar uma região de ligador peptídico em suporte sólido.

Em seguida, é sintetizada uma biblioteca combinatória contendo subunidades de PTA e peptídeos. O passo final é caracterizar a biblioteca sintetizada para garantir a qualidade da síntese. Em última instância, é obtida uma biblioteca combinatória contendo subunidades de PTA com restrição conformacional, a qual pode ser utilizada em triagens de alto rendimento para fornecer ligantes proteicos e contribuir para a descoberta de novos fármacos.

Assim, a química que é o tema deste artigo foi desenvolvida na tentativa de encontrar moléculas muito mais rígidas do que alguns dos peptídeos e outras substâncias com as quais havíamos trabalhado anteriormente. A ideia é que, ao identificar bibliotecas de moléculas mais rígidas, elas se ligarão a alvos proteicos com afinidades muito maiores, e consideramos isso extremamente importante para o desenvolvimento futuro de fármacos ou mesmo de moléculas marcadoras interessantes. A demonstração visual desta síntese da subordem PTA é realmente fundamental, pois a síntese é difícil de aprender, já que o controle de temperatura e do tempo é crucial para uma síntese bem-sucedida.

Primeiro, adicione 8,9 gramas de dine e 11,9 gramas de brometo de potássio a um balão de fundo redondo de 500 mililitros com tampa de três bocas e um bastão de agitação magnético. Em seguida, adicione 100 mililitros de uma solução previamente preparada de 30% de brometo de hidrogênio ao balão. Após colocar o balão em um banho de glicol de etileno e gelo seco a menos 10 graus Celsius, borbulhe argônio através de uma agulha longa a partir da parte inferior do balão durante 10 minutos.

Agite a solução com o bastão de agitação magnético a 300 rpm. Em seguida, adicione uma solução previamente preparada de nitrito de sódio a um funil de adição com equalização de pressão acoplado ao balão de fundo redondo de três bocas e feche-o com um septo. Abra lentamente a válvula do funil de adição, permitindo que a solução de nitrito de sódio goteje para dentro do balão.

Controle a válvula para ajustar a taxa de gotejamento a aproximadamente duas gotas por segundo. Após a adição de nitrito de sódio ser concluída, continue agitando a solução por mais três horas, permitindo que a temperatura aumente de menos 10 graus Celsius até a temperatura ambiente. Se a cor da solução estiver muito escura, aplique vácuo para remover os óxidos de nitrogênio em excesso e o possível bromo gerado durante a reação.

Uma vez que a solução tenha sido transferida para um funil de separação, extraia o produto três vezes com 35 mililitros de éter dietílico. Após combinar a fase orgânica e lavá-la com solução saturada de salmoura, recolha-a em um frasco e seque sobre sulfato de sódio por seis horas. Após a filtração do sulfato de sódio, evapore o solvente sob vácuo para obter um óleo incolor a amarelo-pálido.

Purifique o produto bruto por cromatografia em coluna de gel de sílica com uma mistura de hexano e acetato de etila na proporção de três para um. Para marcação isotópica, dissolva 300 miligramas de L-alanina com 10 mililitros de água deuteriorada em um tubo de polietileno de 50 mililitros. Após adicionar 10 miligramas de alfa-cetoglutato como co-substrato, aqueça o tubo a 37 graus Celsius. Quando finalizado, ajuste o pH para 8,5 a 8,7 utilizando uma solução de óxido de sódio 1 molar e tiras de teste de pH.

Em seguida, adicione 0,1 miligramas de alanina transaminase à solução. Coloque o tubo em um incubador a 37 graus Celsius e incube durante a noite com agitação suave a 10 a 30 RPM. Neste ponto, hidrate um grama de microesferas de 90 mícrons, com porosidade de 10 a gel, com ligante Ram em 10 mililitros de dimetilformamida por três horas em um reator de seringa de 12 mililitros com agitação suave, drene a dimetilformamida do reator e adicione 10 mililitros de solução de 20%pi Perina em dimetilformamida para desproteger o grupo FOC do ligante tipo amida de Rink.

Após agitar as esferas com a solução a 20% de Pepperdine por 30 minutos, lave-as cinco vezes com dimetilformamida para remover todo o Pepperdine. Em seguida, retire algumas esferas da seringa e teste-as com um teste de cloral. Adicione dois mililitros de uma solução de ácido bromoacético 2 M em dimetilformamida às esferas e agite suavemente.

Em seguida, adicione dois mililitros de uma solução de diop propil carbo diamina dimetilformamida dois molares aos grânulos. Após selar a seringa com um êmbolo, agite os grânulos em agitador durante 10 minutos. Uma vez que os grânulos tenham sido lavados completamente com dimetilformamida, adicione dois mililitros de uma solução de metóxi etil dimetilformamida um molar previamente preparada a eles.

Após agitar as esferas e lavá-las cinco vezes com dimetilformamida, verifique algumas das esferas com um teste de cloral. Em seguida, adicione 10 mililitros de uma solução de diclorometano-dimetilformamida na proporção um para um à seringa previamente utilizada. Divida igualmente todas as esferas de um grama em três reatores de seringa de cinco mililitros usando uma pipeta de 1000 microlitros com ponteira truncada.

Após lavar as três seringas três vezes com cloreto de metila, lave as seringas marcadas com r e s três vezes com tetrahidrofuran anidro e a seringa marcada com B três vezes com dimetilformamida. Para o acoplamento da ácido bromopropanóico com tristina, adicione aproximadamente 200 miligramas de tristina a um frasco em uma capela. Após o frasco ter sido tampado, pese a quantidade de tristina no frasco.

Em seguida, adicione a quantidade apropriada de tetra hidro ferrano anidro ao frasco para obter uma solução de trifenilfosgeno em tetra hidro ferrano a 20 miligramas por mililitro. Para preparar a mistura de ácidos bromados com trifenilfosgeno, adicione 89 microlitros de ácido R-2-bromopropanóico e ácido S-2-bromopropanóico-D4 em dois frascos pequenos separadamente; a cada frasco, adicione cinco mililitros da solução de trifenilfosgeno em tetra hidro furano. Após selar os frascos, coloque-os em um congelador a -20 graus Celsius por 20 minutos.

Enquanto isso, adicione 1.125 microlitros de uma solução de tetrahidrofuranodietilamina na proporção de dois para um às seringas r e s. Separadamente, adicione 356 microlitros de 2,4,6-trimetilpurina a cada um dos frascos contendo as misturas resfriadas de ácidos bromo e fosgênio, obtendo precipitados brancos. Aplique imediatamente a suspensão correspondente diretamente nas esferas ativadas e, em seguida, coloque-as em um agitador para agitar a 120 rpm durante duas horas.

Para o acoplamento do ácido bromoacético com diisopropilcarbodiamina, adicione cinco mililitros de uma solução de ácido bromoacético em dimetilformamida 2 molar à seringa B. Após agitação, adicione cinco mililitros de uma solução de diisopropilcarbodiamina em dimetilformamida 2 molar à mesma seringa e agite suavemente. Em seguida, coloque a seringa B no mesmo agitador que as seringas R e S. Agite as seringas por duas horas após lavar cuidadosamente as seringas com diclorometano e dimetilformamida. Reúna todas as perolas das seringas R, S e B em um único reator de seringa de 12 mililitros.

Após as esferas terem sido lavadas cinco vezes com dimetilformamida, adicione 10 mililitros de uma solução de diclorometano e dimetilformamida na proporção um para um à seringa. Divida todas as esferas uniformemente em sete seringas individuais de dois mililitros utilizando uma pipeta de 1000 microlitros com ponteira truncada para a liberação, e adicione cinco mililitros das sete soluções de amina previamente preparadas a dois molar às seringas correspondentes. Incube as sete seringas durante a noite em um incubador a 60 graus Celsius com agitação. Após a incubação.

Lave as esferas que precisam ser clivadas cinco vezes com diclorometano. Após agitar as esferas por 15 minutos e lavá-las novamente com diclorometano, drene o diclorometano da seringa. Em seguida, transfira cada esfera individualmente para uma placa de 96 poços.

Usando um microscópio óptico e uma pipeta com ponteira de ponta truncada, cubra a placa de 96 poços com uma lamínula e coloque-a no congelador a menos 20 graus Celsius por 15 minutos. Após a remoção da placa do congelador, adicione 20 microlitros de uma solução previamente preparada e resfriada, em proporção um para um, de TFA DI clorometano a cada poço que contém uma esfera. Substitua a lamínula e coloque a placa de 96 poços em um agitador, devolvendo-a ao congelador a menos 20 graus Celsius.

Após agitar por 20 minutos, retire a placa de 96 poços do congelador e remova o lamínula. Seque o diclorometano de cada poço soprando ar sobre ele. Quando clivado à temperatura ambiente usando uma solução de TFA 50% em diclorometano, observa-se degradação significativa.

Os picos 593 e 484 correspondem ao ligador e ao trímero de PTA, respectivamente, indicando que toda a molécula foi sintetizada com sucesso na resina, mas degradou-se durante a clivagem. Quando a clivagem é realizada em condições de baixa temperatura, conforme descrito acima, a quantidade de degradação induzida por TFA é grandemente suprimida. O mecanismo de clivagem já foi descrito na literatura anterior e acredita-se que ocorra por meio de um intermediário olefínico. As moléculas de PTA podem ser sequenciadas por MS/MS, e o padrão de fragmentação é semelhante ao de peptídeos e peptídeos.

Moléculas de PTA sintetizadas com ácido S dois bromo propólico D quatro geralmente apresentam picos mais amplos em MS e msm. Espectros de MS devido à presença de produtos de duração incompleta, como S dois bromo propanoico ácido D três, o que pode ser usado como um indicativo da presença do centro quiral R durante o procedimento de sequenciamento. As moléculas de PTA também tendem a formar mais adutos que os peptídeos. Portanto, são preferidas água com baixo teor de sódio e equipamentos de plástico.

Outro subproduto potencial é a acrilamida formada pela eliminação de bromo durante a aminação. Uma vez formada a acrilamida, a sequência é interrompida. Isso pode ser resolvido reduzindo a concentração da amina primária para um molar, a fim de diminuir a solução.

Basicidade Uma vez dominada, uma biblioteca de bom tamanho pode ser preparada em dois dias, se realizada corretamente. Agora que essa química foi totalmente desenvolvida e a síntese é bastante eficaz, espero que outros pesquisadores adotem essa tecnologia poderosa para produzir miméticos peptídicos com restrição conformacional para o desenvolvimento de fármacos e sondas.