4.15: Técnicas de Microinjeção de Zebrafish

A microinjeção de embriões de peixe-zebra permite que os pesquisadores forneçam soluções diretamente no animal em desenvolvimento, a fim de estudar a função gênica e a dinâmica do desenvolvimento. Embriões do estágio de 1 a 4 células são frequentemente usados para injeção. Como não há membranas separando as células e a gema neste estágio inicial, as soluções injetadas em uma célula ou na gema se espalharão uniformemente por todo o organismo. Usando microinjeção, os genes de produção de proteínas podem ser expressos ou desligados, dependendo do tipo de material injetado. Este vídeo demonstrará a preparação da pipeta, a coleta de embriões, o procedimento de microinjeção e discutirá algumas das maneiras pelas quais essa técnica é usada nos laboratórios hoje.

Primeiro, vamos cobrir os principais componentes do sistema de microinjeção: o estereoscópio, o microinjetor, o porta-pipetas e o micromanipulador.

O microinjetor fornece volume preciso através de pulsos de pressão de ar, que podem ser ajustados pelo usuário. O porta-pipetas prende a pipeta para uso durante o procedimento e a conecta à linha de ar do injetor. Normalmente, o porta-pipetas é colocado em um micromanipulador. Este instrumento permite que o pesquisador faça ajustes pequenos e precisos na localização da pipeta durante o procedimento de injeção. Um pedal é conectado ao injetor e permite que o pesquisador mantenha o uso de suas mãos enquanto ativa simultaneamente o pulso de pressão para entrega de material de injeção. Finalmente, o estereoscópio permite que o pesquisador veja os embriões e se concentre na localização da pipeta durante o procedimento de microinjeção.

Antes que a microinjeção possa começar, agulhas de vidro devem ser preparadas. As agulhas de microinjeção devem ser de tamanho consistente para permitir a entrega precisa dos materiais de injeção. Um extrator de pipetas ajuda a garantir que pipetas finas e afiadas sejam preparadas sempre. O extrator aquece um tubo capilar de vidro enquanto exerce força que puxa o tubo, resultando em duas agulhas de pipeta.

Sob o microscópio, usando uma pinça, a ponta é cortada de uma maneira que permite que um volume consistente de líquido seja entregue, mas mantém a nitidez da agulha para perfurar o embrião de peixe-zebra.

O vermelho de fenol, um corante usado para ajudar a visualizar o procedimento de injeção, pode ser misturado com a solução de injeção para rastrear a injeção bem-sucedida no embrião.

As agulhas podem ser carregadas com solução injetável do lado da ponta por ação capilar ou podem ser preenchidas com uma seringa microcarregadora. Uma vez que a agulha é carregada para injeção, ela pode ser inserida no porta-pipetas do micromanipulador.

Depois que as agulhas de injeção estão prontas, as configurações de pressão e tempo do microinjetor são ajustadas para calibrar cada agulha, o que garantirá que um volume consistente seja entregue a cada embrião. Sob o estereoscópio, uma pequena quantidade de solução é injetada em uma gota de óleo mineral em uma lâmina. O tamanho da gota é medido e o volume que a agulha dispersa pode ser calculado. Posteriormente, a pressão do microinjetor pode ser ajustada e o processo repetido até que uma gota do tamanho desejado seja obtida regularmente.

Uma vez que as agulhas são preparadas e calibradas, os embriões são obtidos e organizados para injeção.

Os embriões devem ser posicionados cuidadosamente e mantidos estacionários durante a injeção por uma câmara de microinjeção. Para criar uma câmara de microinjeção, os moldes são colocados em uma placa de Petri e a agarose derretida é despejada na placa e deixada endurecer. Depois de solidificado, o molde é removido e o meio embrionário é derramado por cima. Os embriões podem ser alinhados em calhas que foram criadas pelo molde usando uma pipeta de transferência. Uma alternativa para organizar os embriões em agarose é alinhá-los ao longo da borda de uma lâmina de microscópio, para que sejam posicionados em uma coluna para microinjeção

Uma vez posicionados, os embriões estão prontos para serem injetados.

Os embriões podem ser injetados na gema ou no citoplasma da célula. A injeção na gema é mais simples e requer uma técnica de injeção menos sofisticada, enquanto a injeção no citoplasma é mais difícil, mas produz resultados mais robustos. Para injetar na gema, use o micromanipulador para mover a agulha de modo que ela perfure o córion e depois a gema. O pedal é então batido para fazer com que o conteúdo da agulha seja expelido para a gema. O fluxo citoplasmático e a difusão permitem que a solução injetável flua para dentro da célula.

A injeção no citoplasma requer um posicionamento cuidadoso do embrião, para que o citoplasma possa ser efetivamente direcionado.

Após a injeção, os embriões são transferidos para um novo prato e incubados a 28,5 ° C. Eles são frequentemente verificados para remover embriões mortos.

Para determinar o sucesso da injeção, os embriões podem ser analisados com base em sua aparência geral, na presença de um marcador fluorescente e na busca de alterações em seu genoma usando genotipagem.

Agora que você entende como injetar embriões de peixe-zebra, vamos ver como os cientistas podem usar essa técnica para entender a função dos genes.

Primeiro, os cientistas podem injetar mRNA sintetizado para superexpressar certos genes e determinar sua função observando o fenótipo. Essa mesma técnica também pode ser usada para expressar proteínas que destacam eventos moleculares, como os rearranjos do citoesqueleto que ocorrem durante o desenvolvimento.

Em segundo lugar, os genes podem ser desligados pela injeção de morfolinos. Os morfolinos são análogos de ácidos nucleicos sintéticos estáveis que podem ser projetados para se ligar a sequências específicas de mRNA por emparelhamento padrão de bases de ácidos nucleicos e tradução em bloco. Por sua vez, isso leva à perda da proteína produzida por esse mRNA. Esse efeito permite que os pesquisadores entendam o papel de um determinado gene no desenvolvimento, vendo como o desenvolvimento é alterado em sua ausência.

A injeção pode ser usada para incorporar DNA estranho no peixe-zebra. Ao injetar sequências contendo locais de reconhecimento de enzimas modificadoras de DNA, os cientistas podem gerar eficientemente peixes "transgênicos" com genomas modificados, o que significa que genes estranhos serão transmitidos às gerações futuras. Dependendo do design da sequência, a expressão gênica pode ser confinada a tecidos específicos ou pontos de tempo de desenvolvimento específicos.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE à microinjeção de embriões de peixe-zebra precoces. Este vídeo apresentou a configuração de microinjeção, demonstrou como preparar agulhas de microinjeção, mostrou como preparar embriões para microinjeção, realizar a técnica de microinjeção e algumas aplicações de microinjeção. Como sempre, obrigado por assistir!