Elétrica Cell-substrato impedância Sensing para a quantificação do endotelial Proliferação, Barreira Function, e Motilidade

O objetivo geral do experimento a seguir é usar a detecção de impedância de substrato de célula elétrica conhecida como eis para caracterizar comportamentos celulares. Isso é conseguido cultivando células em eletrodos em uma matriz e fazendo medições em diferentes modos para quantificar a formação da barreira endotelial, maturação e manipulações de função, como ferimento elétrico e adição de estimulantes, são feitas para testar a motilidade celular e a função de barreira. São obtidos resultados que descrevem a ligação celular, proliferação, migração, detecção de permeabilidade endotelial e avaliação de contatos celulares, celulares e substratos celulares com base na esis.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia celular, como fornecer geração on-line de dados quantitativos, caracterizando as células em seu estado natural de confluência em suas condições padrão de cultura de células. Geralmente, os indivíduos novos neste método têm dificuldade porque a teoria subjacente parece complexa e você precisa estar ciente de várias considerações básicas antes de iniciar um experimento. Para começar, as matrizes devem ser limpas e estabilizadas para evitar o desvio do eletrodo, melhorar a reprodutibilidade e aumentar a taxa de intensidade do sinal.

Portanto, adicione 200 microlitros de EL ine 10 milimolar a cada poço de uma matriz de oito poços após 15 minutos Em temperatura ambiente, remova a cistina EL com duas lavagens com água ultrapura, não tampões de fosfato. Além disso, não exponha os eletrodos a soluções contendo soro antes do revestimento, pois eles podem interferir na absorção de proteínas. Em seguida, adicione 200 microlitros de gelatina a 1% aquecida a cada poço e incube a matriz por meia hora a 37 graus Celsius.

Para remover a gelatina, use água ultrapura e não deixe as superfícies dos eletrodos secarem. Em seguida, encha os poços com 400 microlitros de meio de cultura completo, que agora pode conter soro. Carregue a matriz no suporte.

Verifique os nove quadrados dourados. Eles devem entrar em contato com os pinos POGO. Prenda cuidadosamente a matriz no lugar com a mão, apertando o parafuso de ajuste no computador.

Abra o software de medição. Pressione configurar e verifique na seção coletar dados para realizar uma medição rápida de impedância de cada poço na frequência padrão de 4.000 hertz. Os valores serão armazenados na seção de comentários.

Certifique-se de que a verificação escolheu com precisão o tipo de matriz EISs em uso na seção de configuração do poço no diagrama de matriz. Vermelho e verde indicam a funcionalidade das conexões. Se a limpeza e a codificação forem bem-sucedidas, oito matrizes W one E sys devem registrar cerca de cinco a seis matrizes NANOFARAD e oito matrizes W 10 E.

A resistência basal de 50 a 60 nanofarad antes da semeadura celular é, portanto, de cerca de 2000 ohms. Para modelar os dados usando RB alfa e cm, inicie uma gravação MFT com a matriz com falha média. Pegue 15 minutos de dados sem células e termine o experimento para adicionar as células.

Agora remova a matriz e semeie 400 microlitros de suspensão de célula única em cada poço. Para estudar sementes de crescimento celular, 10.000 células por centímetro quadrado para começar com uma semente populacional quase confluente, 60.000 células por centímetro quadrado. Depois de carregar a matriz no suporte, na seção de configuração do poço, selecione os poços a serem medidos.

Em seguida, vá para as opções de coleta de dados e selecione um modo de medição para uma série temporal em uma frequência fixa, selecione SFT e escolha a frequência de medição para medir a cobertura do eletrodo e o modelo RB e alfa selecione MFT e o dispositivo fará medições automaticamente em todas as frequências disponíveis. Execute a medição no modo multifrequência sempre que possível. Isso requer dados em todas as frequências disponíveis e, portanto, fornece a maioria dos insights.

Para análise de micromovimento, selecione RTC e ajuste a frequência de amostragem. A resolução temporal padrão é de um hertz, mas pode ser aumentada para rastrear mudanças rápidas na impedância. O valor pode ser aumentado para 25 hertz para o z theta.

Para medir o micromovimento sequencialmente de muitos poços, selecione o menu de ajuda. Em seguida, escolha mostrar itens de menu da barra de ferramentas do especialista e adquira um RTC de vários poços. Na seção de coleta de dados, certifique-se de especificar o limite de tempo em horas.

Ao usar essa configuração, o software solicitará o número de ciclos após o início da aquisição de dados. Ao coletar dados usando SFT ou MFT, selecione o intervalo de tempo entre as medições especificado em segundos. Para aquisição máxima de dados, deixe essa opção desmarcada.

Agora pressione iniciar e especifique onde os dados devem ser armazenados. A corrida é interrompida pressionando concluir. Ao pressionar pausar, a aquisição de dados será interrompida, mas o relógio experimental continuará funcionando.

Agora remova a matriz e, sob uma capela de fluxo laminar, manipule os poços. Depois de retornar a matriz ao suporte, clique em verificar conexão para verificar as conexões elétricas e, em seguida, retome o experimento para continuar coletando dados. Se as células não precisarem ser estéreis após a manipulação, um estímulo como a trombina pode ser adicionado diretamente a um poço durante a aquisição de dados.

Essas variações introduzidas podem ser marcadas no relógio experimental pressionando mark e adicionando um comentário. Outra opção é enrolar eletricamente as células. As configurações para isso precisam de alguns ajustes para chegar ao tempo de ferimento curto e não é eficaz por muito tempo, e você pode danificar os eletrodos.

Basta começar com as configurações padrão que o software fornece e partir daí. Vá para a seção de configuração do desfile elétrico da ferida e ative a ferida. Agora selecione os poços a serem enrolados na configuração do poço.

Apenas os poços verificados serão feridos. Clicar em ativar abre uma janela pop-up para solicitar ferimentos. Após a ferida, verifique se o sinal cai para um valor de um eletrodo quase livre de células.

Se não repetiu o ferimento geralmente para trabalhar com os dados, use a opção exportar dados e selecione Excel. A modelagem RB e alfa, no entanto, pode ser feita de dentro do software. A partir dos dados do MFT, lembre-se de que a modelagem só é válida em camadas de células de confluência.

E não se esqueça de adicionar a referência sem células. Comece selecionando automaticamente uma referência livre de células usando a função find na seção de modelagem e análise de varredura de frequência. Aceite o valor com set.

Em seguida, pressione model para iniciar os cálculos. Não se assuste se isso demorar vários minutos. Durante um experimento típico, as células passam de uma fase de crescimento para uma fase de platô.

Quando atingem a confluência, as imagens são adquiridas diretamente do eletrodo durante esse processo. A próxima fase é a formação e maturação da barreira EC. O ferimento elétrico é então usado para estudar a migração celular.

Uma queda característica do sinal para a linha de base é seguida pelo restabelecimento do estado de confluência. Finalmente, a resposta aos estímulos é acompanhada em tempo real. Aqui, o agente vasoativo trombina foi aplicado.

Isso causou contração celular e, portanto, uma abertura transitória de pequenas lacunas na barreira, o que causou uma queda na resistência à impedância e as medições de capacitância fornecem informações complementares sobre a adesão celular e a resistência ao crescimento na medição mais sensível. A frequência representa a qualidade e a função da barreira celular e leva em consideração a resistência ao fluxo de corrente paracelular e transcelular. Quando as células se ligam aos eletrodos, elas restringem o fluxo de corrente e a capacitância cai proporcionalmente.

Esta fase fornece uma medição geral da cobertura do eletrodo e é melhor quantificada ao registrar a capacitância em uma frequência superior a 40 kilohertz. A resistência dá uma ideia clara de como as células boas podem bloquear o fluxo de corrente e, portanto, a qualidade da barreira celular. Portanto, células de diferentes passagens e diferentes tipos têm diferentes resistências.

Nosso RB e alfa ajudam a distinguir entre as aderências da célula celular e da matriz celular. RB é a resistividade dos contatos das células celulares ao fluxo de corrente, ou uma medida inversa da permeabilidade. Alfa é uma medida para contribuições de impedância das junções de eletrodos celulares.

Os valores RB e alfa podem ser calculados a partir do software ISIS. Pequenas flutuações no sinal de resistência podem ser devidas a movimentos sutis na camada de células de confluência ou micromovimento. Eles podem ser medidos com uma matriz E na frequência mais sensível e analisados por rápida transformação de Fourier dentro dos EISs, as manipulações de software que fornecem informações sobre o comportamento celular podem ser feitas com precisão.

Por exemplo, é possível fazer uma ferida elétrica de 250 mícrons que fechará em poucas horas para estudar a migração celular. A espectroscopia de impedância também é adequada para analisar o efeito de substâncias adicionadas. Como observado anteriormente, a trombina torna a barreira celular hiperpermeável, diminuindo a tensão das células basais com inibidor de ARO quinase, o efeito da trombina pode ser diminuído Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a ESIS é extremamente sensível a mudanças no ambiente celular, como temperatura, pH, depleção média e assim por diante.

Depois de seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de ologia estudarem as tendências e efeitos de agentes vasoativos em culturas de células de confluência em tempo real.