Medição Longitudinal de Matriz Extracelular Rigidez em 3D tumorais modelos com o uso de rastreamento de partículas Microrheology

O objetivo geral deste procedimento é medir mudanças longitudinais nas propriedades mecânicas da matriz extracelular em modelos tridimensionais de câncer. Isso é feito primeiro colhendo células cancerígenas e cultivando o esteróide tumoral por um método apropriado até que atinjam o tamanho desejado. O segundo passo é incorporar o esteróide tumoral no colágeno ou outra matriz extracelular apropriada.

Em seguida, a grade de pontos de amostragem é construída e um vídeo é feito em cada ponto. A etapa final é analisar os dados de vídeo e calcular e corregistrar propriedades lógicas reais em cada ponto espacial. Em última análise, este protocolo usa a análise das trajetórias da sonda traçadora para quantificar longitudinalmente as mudanças espaciais na mecânica da matriz extracelular de maneira não destrutiva.

A ideia é que, ao reunir medições baseadas em imagens de radiologia de matriz extracelular com modelos tumorais 3D in vitro, que restauram as interações da matriz extracelular, essa abordagem pode fornecer informações quantitativas sobre as mudanças dependentes do tempo no microambiente mecânico que acompanham os processos de invasão do crescimento tumoral e a resposta ao tratamento. O método mostrado neste vídeo adota uma abordagem de sobreposição aros para gerar OIDs 3D não aderentes a partir da linha de células de câncer de pâncreas estabelecida. Para começar, misture 10 mililitros de água de grau de cultura de células com 0,1 grama de aros para obter uma solução de 1% de aros.

Aqueça a solução de aros acima de 70 graus Celsius antes de Ali. Citando 40 microlitros da solução em cada poço de uma placa de 96 poços, incube a placa a 37 graus Celsius por uma hora, colha células cancerígenas via tripsina e prepare uma suspensão de célula única antes de diluir a suspensão celular para 1000 células por mililitro. Adicione 100 microlitros desta diluição ao poço que contém o leito de aros curado.

Coloque a amostra em um shaker durante a noite em uma incubadora ajustada a 37 graus Celsius e 5% de CO2 após a incubação. Remova a amostra do agitador e adicione 100 microlitros de meios de cultura de células e prossiga para incubar o esteróide resultante até que o diâmetro desejado seja alcançado. Por exemplo, após nove dias, uma panela, um esteróide terá aproximadamente 450 mícrons de diâmetro.

Para começar, prepare uma estação de trabalho dentro de uma capela de fluxo laminar com dois frascos de dois mililitros. O frasco um conterá o esteróide tumoral e o frasco dois será um controle livre de células. Prepare uma mistura diluída de sondas traçadoras fluorescentes de um mícron de diâmetro modificadas com carboxilato adicionando duas partes de sondas de estoque a 25 partes de água estéril.

Remova um frasco de 3,1 miligramas por mililitro de colágeno bovino da geladeira e coloque-o em uma alíquota de gelo de 125 microlitros de colágeno, seguido por 50 microlitros de solução diluída de sonda traçadora no frasco um vórtice brevemente para distribuir as sondas. Em seguida, adicione 235 microlitros de meios de cultura de células apropriados contendo vermelho de fenol para um volume total de 410 microlitros e vórtice brevemente antes de remover 205 microlitros e colocá-lo no frasco dois. Em seguida, adicione aproximadamente dois microlitros de hidróxido de sódio molar ao frasco.

Um para trazer a solução de volta ao vórtice de pH neutro brevemente para misturar. Em seguida, retorne imediatamente à prateleira de gelo para que a mistura não comece a curar. Remova suavemente 40 microlitros de meio do poço que contém o esteróide tumoral.

Retenha esses 40 microlitros enquanto conduz a próxima etapa. Verifique o poço para ver se o esteróide foi removido na etapa anterior. Caso contrário, coloque os 40 microlitros de volta no poço e repita a etapa anterior.

Se estiver, adicione os 40 microlitros contendo o esteróide ao frasco. Um frasco de agitação suave antes de transferir a mistura em porções de 60 microlitros para três poços separados de uma placa de 96 poços, inspecione cada poço com um microscópio após adicionar a mistura para determinar qual poço contém o esteróide. Em seguida, adicione aproximadamente dois microlitros de hidróxido de sódio molar e 40 microlitros de meio de cultura celular ao frasco dois e ao vórtice antes de Ali.

Citando 60 microlitros dessa mistura para um poço vazio na placa de 96 poços e rotulando-a como um controle livre de células. Coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius para curar por pelo menos uma hora para construir uma grade de pontos de amostragem. Primeiro, transfira a placa de amostra da incubadora para o estágio de microscópio.

Aguarde 10 minutos para que a amostra atinja a temperatura ambiente se não estiver disponível uma fase aquecida. Observe a amostra com lentes objetivas de baixa potência para certificar-se de que está intacta e pronta para a imagem. Determine a posição do tumor dentro do poço e documente isso com uma imagem de luz transmitida para posterior co-registro espacial.

Normalmente, 20 pontos de amostragem em cada poço distribuídos em anéis concêntricos ao redor do esferóide S produzirão resultados adequadamente detalhados. Mova a platina para cada posição desejada e use o software de interface do microscópio para registrar as coordenadas XNY. Mude o microscópio para uma lente objetiva de alta potência e selecione o cubo de filtro apropriado para o comprimento de onda x citação das sondas traçadoras.

Usando a lista de pontos criados, vá para o primeiro ponto na grade. Ajuste o foco para encontrar o fundo do poço antes de subir. Para encontrar um campo de visão contendo várias sondas rastreadoras em foco.

Observe o histograma de intensidade e ajuste a intensidade e o tempo de exposição para obter a maior faixa dinâmica possível, garantindo que a imagem não fique saturada. Obtenha uma sequência de vídeo a uma taxa de quadros de 20 a 30 milissegundos por quadro e salve com uma convenção de nomenclatura apropriada. Durante a gravação, não toque no microscópio ou na mesa.

Repita a gravação para cada ponto de amostra na grade. Em seguida, repita o processo para construir uma grade para cada poço no experimento e repita todo o processo para cada vez. Ponto ao longo da duração do monitoramento longitudinal.

Para iniciar a análise de dados. Copie todos os dados de vídeo para uma pasta de análise. Importe dados de imagem para o MATLAB ou outro software de análise.

Calibre o software analisando vários quadros do vídeo para determinar adequadamente os parâmetros de seleção e rejeição para identificar as posições do centro da sonda. Em seguida, use o software para determinar automaticamente cada posição da sonda para todos os quadros de vídeo e, em seguida, vincule essas posições em trajetórias. Use os dados de trajetória para calcular o deslocamento quadrado médio ou MSD em função do tempo de latência, certificando-se de aplicar o fator de calibração espacial apropriado para a lente objetiva específica ou para qualquer pixel benning.

Calcule G Star usando a relação generalizada de Stokes Einstein, levando em consideração os limites de aplicabilidade da relação generalizada de Stokes Einstein para uma amostra específica. Repita as etapas de análise para cada campo de visão no experimento. Registre os dados de posição com o viscoelástico mod I em uma frequência específica de interesse, dependendo do fabricante do microscópio usado.

Esta etapa pode ser facilitada por uma rotina personalizada, que lê os metadados do microscópio ou os dados de posição podem ser tabulados manualmente. As sequências de vídeo são adquiridas em várias posições espaciais dentro de um poço representativo contendo um nódulo tumoral 3D e vinculadas para fornecer um mapa de microrradiologia espacial da amostra quando monitoradas longitudinalmente populações de células na periferia da panela. Um esteróide usado neste exemplo degradará espontaneamente as fibras de colágeno circundantes e invadirá a matriz extracelular em poucos dias.

Neste exemplo, o co-registro de micro O monitoramento longitudinal dessas regiões espaciais díspares mostra uma queda no componente real do complexo módulo de cisalhamento viscoelástico de aproximadamente quatro ordens de magnitude concomitante com a invasão. Dados dependentes da frequência total são mostrados contrastando as propriedades teológicas do material na região um e na região dois no dia quatro.

Ao tentar esse procedimento, é importante lembrar que deve-se tomar cuidado para evitar armadilhas comuns durante a análise das trajetórias da sonda que levam a conclusões inadequadas. Encorajamos os leitores a consultar a literatura PTM aqui citada, que aborda considerações como desvio amostral e interpretação da heterogeneidade. Este procedimento pode ser combinado com imagens de fluorescência longitudinais ou terminais adicionais para responder a outras perguntas, como como a remodelação mecânica se correlaciona com os principais eventos de sinalização ou resposta citotóxica a uma intervenção.