Medição Longitudinal de Matriz Extracelular Rigidez em 3D tumorais modelos com o uso de rastreamento de partículas Microrheology

O objetivo geral deste procedimento é medir alterações longitudinais nas propriedades mecânicas da matriz extracelular em modelos tridimensionais de câncer. Isso é realizado primeiramente colhendo células cancerígenas e cultivando o esteroide tumoral por um método apropriado até que atinjam o tamanho desejado. O segundo passo é incorporar o esteroide tumoral no colágeno ou em outra matriz extracelular apropriada.

Em seguida, constrói-se a grade de pontos de amostragem e é feito um vídeo em cada ponto. O passo final é analisar os dados dos vídeos e calcular e coregistrar propriedades lógicas reais em cada ponto espacial. Em última análise, este protocolo utiliza a análise das trajetórias de sondas traçadoras para quantificar longitudinalmente alterações espaciais na mecânica da matriz extracelular de maneira não destrutiva.

A ideia é que, ao reunir medições baseadas em imagem da radiologia da matriz extracelular com modelos tridimensionais de tumores in vitro que restauram as interações da matriz extracelular, essa abordagem possa fornecer uma compreensão quantitativa das alterações dependentes do tempo no microambiente mecânico que acompanham os processos de crescimento e invasão tumoral, bem como a resposta ao tratamento. O método mostrado neste vídeo adota uma abordagem de sobreposição de aros para gerar OID tridimensionais não aderentes a partir da linhagem celular de câncer pancreático estabelecida, pan one. Para começar, misture 10 mililitros de água grau cultura celular com 0,1 grama de aros para obter uma solução de aros a 1%.

Aqueça a solução de aros a mais de 70 graus Celsius antes da alíquota. Distribua 40 microlitros da solução em cada poço de uma placa de 96 poços e incube a placa a 37 graus Celsius por uma hora. Recolha as células cancerígenas por tripsinização e prepare uma suspensão simples de células antes de diluir a suspensão celular para 1000 células por mililitro. Adicione 100 microlitros dessa diluição ao poço contendo o leito de aros curado.

Coloque a amostra em um agitador durante a noite em um incubador ajustado a 37 graus Celsius e 5%CO2 após a incubação. Remova a amostra do agitador e adicione 100 microlitros de meio de cultura celular, prosseguindo com a incubação do esteroide resultante até que o diâmetro desejado seja atingido. Por exemplo, após nove dias, uma placa, um esteroide terá aproximadamente 450 mícrons de diâmetro.

Para começar, prepare uma estação de trabalho dentro de uma cabine de fluxo laminar com dois frascos de dois mililitros. O frasco um conterá o esteroide tumoral e o frasco dois será um controle livre de células. Prepare uma mistura diluída de sondas traçadoras fluorescentes modificadas com carboxilato e com diâmetro de um mícron adicionando duas partes da solução estoque das sondas a 25 partes de água estéril.

Retire um frasco de colágeno bovino a 3,1 miligramas por mililitro da geladeira e coloque-o no gelo. Aliquote 125 microlitros de colágeno, seguidos por 50 microlitros de solução diluída do marcador traçador no frasco um e vortexe brevemente para distribuir os marcadores. Em seguida, adicione 235 microlitros do meio de cultura celular apropriado contendo vermelho de fenol, para um volume total de 410 microlitros, e vortexe brevemente antes de remover 205 microlitros e colocá-los no frasco dois. A seguir, adicione aproximadamente dois microlitros de hidróxido de sódio um molar ao frasco.

Um para trazer a solução de volta ao pH neutro, vortexe brevemente para misturar. Em seguida, retorne imediatamente ao suporte de gelo para que a mistura não comece a curar. Remova cuidadosamente 40 microlitros de meio do poço contendo o esteroide tumoral.

Retenha esses 40 microlitros enquanto realiza o próximo passo. Verifique o poço para ver se o esteroide foi removido na etapa anterior. Caso contrário, coloque os 40 microlitros de volta no poço e repita a etapa anterior.

Se foi, adicione os 40 microlitros contendo o esteroide ao frasco. Agite suavemente o frasco um antes de transferir a mistura em porções de 60 microlitros para três poços separados de uma placa de 96 poços; inspecione cada poço com um microscópio após a adição da mistura para determinar qual poço contém o esteroide. Em seguida, adicione aproximadamente dois microlitros de hidróxido de sódio um molar e 40 microlitros de meio de cultura celular ao frasco dois e vortex antes da Ali.

Adicione 60 microlitros dessa mistura em um poço vazio da placa de 96 poços e rotule-o como controle livre de células. Coloque a placa em um incubador a 37 graus Celsius para curar por pelo menos uma hora, a fim de construir uma grade de pontos de amostra. Primeiro, transfira a placa de amostra do incubador para a platina do microscópio.

Aguarde 10 minutos para que a amostra atinja a temperatura ambiente, caso não esteja disponível uma platina aquecida. Observe a amostra com objetivas de baixo aumento para garantir que ela esteja íntegra e pronta para a aquisição de imagens. Determine a posição do tumor dentro do poço e documente isso com uma imagem em luz transmitida para posterior co-registro espacial.

Normalmente, 20 pontos de amostra em cada poço distribuídos em anéis concêntricos ao redor do esferoide S produzirão resultados adequadamente detalhados. Mova o estágio para cada posição desejada e utilize o software de interface do microscópio para registrar as coordenadas XNY. Altere o microscópio para uma lente objetiva de alta potência e selecione o cubo de filtro apropriado para o comprimento de onda de excitação das sondas marcadoras.

Usando a lista de pontos criados, mova-se até o primeiro ponto da grade. Ajuste o foco para encontrar o fundo do poço antes de mover para cima. Para encontrar um campo de visão contendo várias sondas traçadoras em foco.

Observe o histograma de intensidade e ajuste a intensidade e o tempo de exposição para obter a maior faixa dinâmica possível, garantindo que a imagem não fique saturada. Obtenha uma sequência de vídeo com uma taxa de quadros de 20 a 30 milissegundos por quadro e salve com uma convenção de nomenclatura apropriada. Durante a gravação, não toque no microscópio nem na mesa.

Repita a gravação para cada ponto da amostra na grade. Em seguida, prossiga para repetir o processo e construir uma grade para cada poço no experimento, repetindo todo o processo para cada momento ao longo do monitoramento longitudinal.

Para iniciar a análise dos dados, copie todos os dados de vídeo para uma pasta de análise. Importe os dados de imagem para o MATLAB ou outro software de análise.

Calibre o software analisando vários quadros do vídeo para determinar adequadamente os parâmetros de seleção e rejeição para identificar as posições centrais da sonda. Em seguida, use o software para determinar automaticamente a posição de cada sonda em todos os quadros do vídeo e, depois, vincular essas posições em trajetórias. Utilize os dados das trajetórias para calcular o deslocamento quadrático médio ou MSD em função do tempo de atraso, certificando-se de aplicar o fator de calibração espacial apropriado para a lente objetiva específica ou para qualquer pixel benning.

Calcule o G Estrela utilizando a relação generalizada de Stokes-Einstein, levando em consideração os limites de aplicabilidade dessa relação para uma amostra específica. Repita as etapas de análise para cada campo de visão do experimento. Realinhe os dados de posição com o módulo viscoelástico I em uma frequência específica de interesse, dependendo do fabricante do microscópio utilizado.

Esta etapa pode ser facilitada por uma rotina personalizada, que lê metadados do microscópio ou os dados de posição podem ser tabulados manualmente. Sequências de vídeo são adquiridas em múltiplas posições espaciais dentro de um poço representativo contendo um nódulo tumoral tridimensional e vinculadas para fornecer um mapa micro-radiológico espacial da amostra quando populações celulares são monitoradas longitudinalmente na periferia da placa. Um dos esteroides utilizados neste exemplo degradará espontaneamente as fibras de colágeno circundantes e invadirá a matriz extracelular em poucos dias.

Neste exemplo, a co-registração de micro-óptica fornece uma leitura quantitativa da invasão evidente na matriz ocorrendo à esquerda, mas não à direita do esteroide. O monitoramento longitudinal dessas regiões espaciais distintas mostra uma queda na componente real do módulo de cisalhamento viscoelástico complexo de aproximadamente quatro ordens de magnitude concomitante com a invasão. Dados completos dependentes da frequência são apresentados, contrastando as propriedades reológicas do material na região um e na região dois no quarto dia.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que é necessário ter cuidado para evitar armadilhas comuns durante a análise das trajetórias da sonda, as quais podem levar a conclusões inadequadas. Incentivamos os leitores a consultarem a literatura sobre PTM citada aqui, que aborda considerações como deriva da amostra e interpretação da heterogeneidade. Este procedimento pode ser combinado com imagens fluorescentes longitudinais ou terminais adicionais para responder outras questões, como a forma pela qual o remodelamento mecânico se correlaciona com eventos-chave de sinalização ou resposta citotóxica a uma intervenção.