Utilização de uma caspase Multiplexing ensaio para determinar a apoptose em um modelo de célula hipotalâmica

O objetivo geral deste vídeo é demonstrar um ensaio multiplex de alto rendimento para determinar o início da apoptose medida pela caspase. Três sete. Primeiro, os neurônios hipotalâmicos são desafiados com o ácido graxo saturado indutor de apoptótico, o ácido palmítico.

Em seguida, a viabilidade celular dos neurônios é medida usando um reagente à base de fluorescência e um leitor de microplacas após o início da apoptose. O substrato de lúmen, DEVD, que é uma sequência de aminoácidos clivada pela caspase três, é adicionado às células. A etapa final do procedimento é medir a luminescência usando um leitor de microplacas para determinar a atividade da caspase, que aumenta nas células que estão sofrendo apoptose.

Em última análise, uma proporção de atividade de caspase por células viáveis pode ser obtida em menos de cinco a seis horas. Em um formato de 96 poços. A principal vantagem desta técnica de nossos métodos existentes, como western blots ou lise, é que é um ensaio rápido e barato que pode medir diretamente a atividade da caspase três sete em vários formatos de poços.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo, como determinar moduladores primários da apoptose. A utilidade dessa técnica é que essa multiplexação pode ser usada como um método preciso de avaliação de citotoxicidade e viabilidade. Embora o ensaio seja bastante simples, uma demonstração visual desse método é fundamental porque garantirá que o ensaio seja concluído com sucesso.

Embora esse método possa fornecer informações sobre a neurodegeneração, ele também pode ser aplicado a outras doenças e modelos in vitro, como os usados na pesquisa do câncer. Indivíduos novos neste método precisarão otimizar essa técnica porque os pontos finais são dependentes da linha celular e do agonista. A atividade da caspase três sete é transitória.

Portanto, dependendo da eficácia do estressor celular, determinar o momento apropriado para testar a atividade da base fundida pode exigir algum esforço para começar rapidamente. Descongele 12 células congeladas em banho-maria a 37 graus Celsius. Depois de descongelado, canalize suavemente as células em um frasco de cultura ventilado de 75 centímetros quadrados e adicione 10 mililitros de delcos quentes, águias modificadas, médio ou DMEM, incube o frasco durante a noite em uma incubadora de dióxido de carbono a 5% a 37 graus Celsius.

Após 24 horas, aspirar o meio e substituir por meio fresco pode continuar crescendo células até entre 70 e 80%Confluência é obtida após dois a três dias de crescimento. Para contar as células primeiro DMEM quente e uma x tripsina, solução de EDTA a 37 graus Celsius. Aspirar o meio do balão e lavar duas vezes com solução salina tamponada com fosfato estéril.

Adicione 500 microlitros de solução de tentina antes de incubar a 37 graus Celsius por entre dois e cinco minutos. Separar as células do balão com um raspador e suspender as células em cinco mililitros de meio. Passe as células por um filtro de células para um tubo limpo de 50 mililitros.

Pode ser necessário passar as células pelo filtro mais de uma vez, mas não repita mais de três vezes após a contagem das células usando uma semente de hemocitômetro. 6.000 células por poço em uma placa de parede preta ou branca de fundo claro de 96 poços em um volume final de 100 microlitros de meio, incubar a placa a 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius por 24 horas. Transfira o ácido palmítico para um frasco de vidro estéril de cinco mililitros e solubilize em 100% de DMSO.

Depois de diluir a solução de ácido palmítico estoque de um a 10 em DMSO, adicione-a ao PREWARM DMEM para obter uma concentração final de trabalho de 0,1 milimolar de ácido palmítico para meios de controle, adicione a mesma concentração de DMSO que foi adicionada ao meio contendo ácido palmítico. Remova a mídia em cada poço e substitua por 50 microlitros de ácido médio mais ou menos ácido e incube a placa a 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius por duas horas. Em seguida, adicione cinco microlitros de reagentes de resina e incube por 10 minutos em temperatura ambiente após a incubação, carregue a placa em um leitor de microplacas multimodo e registre a fluorescência em um comprimento de onda de excitação de 560 nanômetros e um comprimento de onda de emissão de 590 nanômetros.

Para medir a responsabilidade celular, os resultados são apresentados como unidades de fluorescência relativas à mesma placa. Adicione 55 microlitros de reagente fundido DEVD e incube em temperatura ambiente por duas horas. Novamente usando o leitor de microplacas, registre a luminescência para medir a caspase três, sete resultados de atividade, são apresentados como unidades de luminescência relativa com luminescência diretamente proporcional à caspase três sete para normalizar a caspase três, sete atividade para contagem de células, dividir a viabilidade celular pela caspase três sete atividade.

Este protocolo descreve os resultados da multiplexação de dois ensaios separados para determinar os mecanismos de morte celular por apoptose. A atividade da caspase foi significativamente aumentada nas células desafiadas com ácido palmítico. Após duas horas de incubação, a integridade da membrana celular é visivelmente alterada na presença de ácido palmítico.

Aqui é mostrada a via potencial na qual o ácido palmítico induz a apoptose. Compreender os mecanismos subjacentes do estressor usado para induzir a apoptose ajuda a determinar o período de tempo para a incubação do estressor. Uma vez que as enzimas caspases devem ser ativadas antes de interagir com o substrato DEVD Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de cinco a seis horas se for executada corretamente.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar um ensaio de caspase multiplex três sete atividades usando um modelo de cultura de células neuronais hipotalâmicas in vitro. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que os tempos de incubação dependem dos tipos de células e estressores ou agonistas usados. O desenvolvimento desta técnica permite que pesquisadores no campo da neurociência usem uma técnica confiável e que economiza tempo para estudos apoptóticos Após este procedimento, ensaios farmacológicos adicionais que visam proteínas específicas dentro do processo apoptótico podem ser realizados para delinear os mecanismos subjacentes que iniciam doenças degenerativas.