Name: Utilização de uma caspase Multiplexing ensaio para determinar a apoptose em um modelo de célula hipotalâmica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-16T15:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Aprenda a realizar um ensaio multiplex de caspase-3/7 para avaliar apoptose em neurônios hipotalâmicos expostos a ácido palmítico. Este método rápido e de alto rendimento permite medir viabilidade celular e atividade de caspase simultaneamente.

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O trabalho aqui descrito foi financiado pelo Departamento de Assuntos de Veteranos EUA Biomédica Laboratório de Pesquisa e Desenvolvimento BX001686-1A1 e VA Reabilitação de Investigação e Desenvolvimento.

1. Chapeamento e manutenção da cultura celular <ol><li> Quente de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) meio de cultura (DMEM + 10% FBS + 1% de Penicilina / Estreptomicina / Neomicina) a 37 ° C. </li><li> Obter estoque da A12 células congeladas de -80 ° C. </li><li> Descongelar rapidamente células em 37 ° C num banho de água; uma vez descongelado, suavemente as células de pipeta para transferir para um frasco de cultura ventilada 75 centímetros 2 e adicione 10 ml de meio de cultura. </li><li> Incubar balão durante a noite em 5% de CO2 a 37 ° C. Aspirar a mídia após 24 horas e substitua-o por meios frescos. Continuar as células crescer até 70-80% de confluência é obtido (2-3 dias de crescimento). </li></ol> 2. Contando e cultivo de células <ol><li> DMEM quente e solução de 1x-tripsina-EDTA a 37 ° C. </li><li> Aspirar a partir de meios de células e lava-se duas vezes com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS). </li><li> Adicionar 500 ul de solução de tripsina e incubar a 37 ° C durante 2-5 min. </li><li> Separarcélulas de balão, utilizando um raspador e suspender as células em 5 ml de meio. Passe células através de filtro e passar por filtro de células em um tubo de 50 ml limpo. Que precisa passar células através de filtro mais de uma vez, mas não repetir mais do que três vezes. </li><li> Contagem de células utilizando um hemocitómetro para determinar a quantidade de células de cultura para semear 6000 células / poço numa placa de preto ou branco 96 poços de fundo claro com paredes em um volume final de 100 ul de meio. Incubar a placa em 5% de CO 2, a 37 ° C durante 24 hr. </li></ol> 3. Determinação Viabilidade celular e caspase-3/7 Actividade <ol><li> Transferir PA para um frasco de 5 ml estéril de vidro e solubilizar em 100% de dimetilsulfóxido (DMSO). Diluir solução estoque PA 1:10 em DMSO e adicioná-lo ao pré-aquecido DMEM para obter uma concentração final de trabalho de 0,1 mM de PA. Para meios de controle, adicione a mesma concentração de DMSO que é adicionado à mídia contendo PA. </li><li> Remova a mídia em cada poço e substituir com 50 ul media + / -PA. Incubar a placa durante 2 horas em 5% de CO 2, a 37 ° C. Em seguida, adicionam-se 5 ul de reagente de resazurina e incubar durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Usando um leitor de microplacas multimodo, ficha de fluorescência (560 EX / 590 EM) para medir a viabilidade celular. Os resultados são apresentados como unidades de fluorescência relativas (RFU). </li><li> Para a mesma placa, adicionar 55 ul de reagente de caspase e incubar à temperatura ambiente durante 2 horas. </li><li> Novamente usando o leitor de microplacas, ficha luminescência para medir a atividade da caspase-3/7. Os resultados são apresentados como unidades de luminescência relativa (RLU), com luminescência directamente proporcional à caspase-3/7 actividade. </li><li> Para normalizar a atividade da caspase-3/7 para contagem de células, divida a viabilidade celular (RFU) por caspase-3/7 atividade (RLU). </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm conflitos de divulgar.

O ensaio multiplex é uma técnica bem aceite que tem sido utilizado por cientistas em numerosas aplicações tais como PCR, microarrays de imunodetecção, e outros métodos de detecção baseados em proteínas de 13, 14. Recentemente, ensaios de multiplexagem tornaram-se cada vez mais utilizado em experiências in vitro, baseados em placa e foram validados como um método acurado para avaliar a citotoxicidade e viabilidade 12. No protocolo anterior, que demonstram a eficácia de lâmpadas fluorescente...

Dietas ricas em ácidos graxos saturados, como o ácido palmítico (PA) têm sido associados a obesidade e outras comorbidades, como doenças cardiovasculares e diabetes 1, 2. Dietas ricas em gordura também foram mostrados para aumentar o estresse oxidativo, apoptose e degeneração neuronal no hipotálamo, um importante regulador do apetite e gasto energético 3-7. Compreender o mecanismo através do qual a exposição dieta rica em gordura induz desregulação hipotalâmica é, portanto, importante para o desenvolvimento de tratamentos farmacológicos para a obesidade. No entanto, os mecanismos celulares pelos quais a gordura na dieta afeta a função neuronal permanecem obscuros. Uma melhor compreensão de como gorduras, como PA pode desencadear o início de vias apoptóticas hipotálamo é um primeiro passo necessário em direção a esse objetivo. O objetivo deste artigo é descrever um ensaio multiplex para testes in vitro de resposta neuronal à exposição PA, desenvolvido para uso em estudos de hneurodegeneração ypothalamic. Fornecemos uma descrição detalhada de um formato de 96 poços de ensaio multiplex in vitro para medir a caspase 3/7 actividade por número total de células de uma linha imortalizada diferenciadas célula hipotalâmica do rato adulto (designado A12) após o desafio oxidativo com PA 8. Resumidamente, a viabilidade celular é determinada após o desafio com PA através de um ensaio baseado resazurina. Resazurina é um composto permeável célula que sofre redução enzimática em células metabolicamente activas, um processo que se pensa ocorrer por meio da mitocôndria 9. As células viáveis ​​converter continuamente resazurina a resorufina, a produção de um sinal fluorescente proporcional à quantidade de células viáveis. Actividade da caspase-3/7 é então analisado utilizando um ensaio baseado lumogenic-DEVD. DEVD é uma sequência de aminoácidos (Asp-Glu-Val-Asp) clivada pela caspase-3. Quando esta sequência é acoplado a uma substância lumogenic, aquando da activação intracelular de caspase-3/7 e subsequente clivagemde substrato DEVD, o produto luminescente é liberada. Esta reacção é proporcional à actividade da caspase e, consequentemente, para a indução de apoptose. Como as células mortas não podem produzir caspase, caspase-3/7 atividade é de natureza transitória; portanto, a análise deve ser concluída entre 30 minutos a 4 horas após o desafio, dependendo da eficácia do estressor celular. A viabilidade das células é inversamente proporcional à actividade da caspase-3/7 e pode ser usado para determinar os mecanismos de morte celular. Por exemplo, este método tem sido utilizado para demonstrar que o pré-tratamento com a hormona peptídica orexina reduz a apoptose em células do hipotálamo desafiados com peróxido de hidrogénio, o que sugere que os mecanismos afectadas por este tratamento são importantes para a protecção contra danos oxidativos 10. É importante notar estes ensaios são linha e células dependente de tecido, uma vez que dependem de actividade mitocondrial para reduzir os reagentes do ensaio. Este protocolo foi otimizado para rato adulto hipotálamo (A12) células; no entanto,métodos descritos podem ser alterados para se ajustar dentro do âmbito da investigação semelhante. Os ensaios de multiplexação de um único poço de cultura proporciona uma vantagem em relação ao método tradicional de realização de ensaios individuais para várias razões. Além da economia de tempo, amostras de células, e os reagentes de cultura, ensaios de multiplexação também pode proporcionar conhecimentos sobre a sobrevivência das células e a morte, fornecem controlos internos, e eliminar a necessidade de experiências repetidas 11, 12. Métodos alternativos têm invocado borrões ou ELISAs ocidentais, que são ensaios de confiança, mas é dispendioso e consome tempo (1-2 dias), especialmente quando se utiliza um formato de 96 poços. Excluindo o tempo que leva para as células de cultura para o ensaio de multiplexagem, o tempo total é menos do que 3 horas. Embora este protocolo foi optimizado para utilização com células A12, pode ser alterada para uso em outros modelos, mantendo em mente os fatores que podem influenciar a integridade celular. Determineração se este protocolo iria trabalhar para uma série de experimentos depende do número de amostras ou condições experimentais e em experimentos a jusante planejadas.

<table><tbody><tr><td>Linha Celular de Hipotálamo de Camundongo Adulto mHypoA-1/2&nbsp;</td><td>Cellutions Biosystems Inc.</td><td>CLU172</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águia Modificada' s Medium</td><td>Invitrogen</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>PAA Labs</td><td>A15-751</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Palmítico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0500</td><td></td></tr><tr><td>Dimethy Sulfoxide&nbsp;</td><td>Reagente de</td><td></td> Viabilidade de Células PrestoBlue ><PrestoBlue <td></td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>A13262</td><td></td></tr><tr><td>Caspase-Glo 3/7 Sistemas de Ensaio</td><td>Promega</td><td>G8091</td><td></td></tr><tr><td>96 W, Poliestireno Preto, Tratamento para Cultura de Células, com tampa, Termoestéril</td><td>Fisher Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M5 Dispositivos Moleculares de Microplacas Multimodo</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

utilização de uma caspase multiplexing ensaio para determinar a apoptose em um modelo de célula hipotalâmica

Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

A capacidade de multiplexar os ensaios em estudos de mecanismos celulares complexas elimina a necessidade de experiências repetitivas, fornece os controlos internos, e diminui os custos e desperdícios de reagentes. Aqui descrevemos optimização de um ensaio multiplex para avaliar a apoptose após um ácido palmítico (PA) desafio em um modelo in vitro do hipotálamo, usando tanto fluorescentes e luminescentes baseados ensaios para medir a contagem de células viáveis ​​e caspase-3/7 em actividade de 96 poços formato de placa de microtitulação. A seguir ao desafio PA, as células viáveis ​​foram determinados por um ensaio fluorescente baseado em resazurina. A caspase-3/7 actividade foi determinada usando um substrato luminogenic, DEVD, e normalizada para o número de células, em seguida. Este ensaio de multiplexação é uma técnica útil para determinar as alterações na actividade da caspase após o estímulo por apoptose, tais como desafio ácido gordo saturado. O ácido gordo saturado PA pode aumentar o stress oxidativo e apoptose hipotalâmico, indicando o potencial importance de ensaios tais como os descritos aqui em estudar a relação entre os ácidos gordos saturados e função neuronal.

O protocolo acima descreve resultados na multiplexação de dois ensaios separados para determinar os mecanismos de morte celular. Figura 1 mostra uma visão geral do protocolo para determinar a viabilidade celular e caspase-3/7 atividade. Actividade de caspase foi significativamente aumentada em células desafiadas com PA após 2 horas de incubação (Figura 2A e na Tabela 1). A perda da integridade da membrana celular é uma alteração morfológica associada com a indução de ap...

Ensaios Multiplex pode fornecer informações úteis para os mecanismos celulares básicos e eliminar o desperdício de reagentes e experiências repetitivas desnecessárias. Descrevemos aqui um ensaio multiplex atividade caspase-3/7, usando métodos fluorescentes e luminescentes à base, para determinar a viabilidade celular em um modelo in vitro hipotálamo seguinte desafio oxidativo com ácido palmítico.

Utilização de uma caspase Multiplexing ensaio para determinar a apoptose em um modelo de célula hipotalâmica

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

O objetivo geral deste vídeo é demonstrar um ensaio multiplex de alto rendimento para determinar o início da apoptose medido pela caspase 3/7. Primeiramente, neurônios hipotalâmicos são desafiados com o ácido graxo saturado indutor de apoptose, ácido palmítico.Em seguida, a viabilidade celular dos neurônios é medida utilizando um reagente baseado em fluorescência e um leitor de microplacas após o início da apoptose. O substrato luminescente, DEVD, que é uma sequência de aminoácidos clivada pela caspase três, é adicionado às células. O passo final do procedimento é medir a luminescência utilizando um leitor de microplacas para determinar a atividade da caspase, que aumenta em células que estão passando por apoptose.No final, uma razão entre a atividade da caspase e as células viáveis pode ser obtida em menos de cinco a seis horas. Em um formato de 96 poços. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como western blot ou lise, é que se trata de um ensaio rápido e de baixo custo que pode medir diretamente a atividade da caspase 3 e 7 em formatos de múltiplos poços.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área, como a identificação dos pr

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JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Live-célula de imagem de caspase-3 apoptose mediada em imortalizado culturas N19-oligodendrócitos célula usando...

Monitoramento de Atividades de caspase-3 Clivadas e apoptose das células oligodendrogliais Imortalizado usando Live-célula Imaging and Cleaveable Fluorogênico-dye seguintes substratos de potássio induzida por despolarização da membrana

Este vídeo descreve um ensaio luminescente de Caspase-3/7 in vitro para quantificar a morte celular ou apoptose. O ensaio mede a luminescência produzida após a clivagem da caspase-3/7 de um substrato DEVD pró-luminescente. A luminescência gerada é proporcional à atividade da caspase-3/7.

Ensaio de Caspase-3/7: Um Ensaio Baseado em Luminescência para Quantificar a Apoptose Medindo as Atividades da Caspase-3/7 em Explantes de Pele de Rã

O termo anastase refere-se ao fenômeno no qual as células moribundas revertem um processo de suicídio celular em um estágio tardio, se reparam e, finalmente, sobrevivem. Aqui demonstramos protocolos para detectar e rastrear células que passam por anástase.

Estratégias para Rastreamento Anastasis, uma célula de sobrevivência Fenômeno que reverte apoptose

Para detectar células saudáveis em animais inteiros que contêm baixos níveis de actividade de caspase, o biossensor altamente sensível designado CaspaseTracker foi gerado para Drosophila. biossensor actividade dependente de caspase é detectado em células saudáveis ​​de vida longa ao longo dos órgãos internos dos animais adultos criados em condições optimizadas na ausência de estímulos de morte.

In Vivo Biosensor Tracks apoptótica não-Caspase Atividade em Drosophila

Anastasis é tecnicamente desafiador para detectar na vivo porque as células que reverteram o processo de morte celular podem ser morfologicamente indistinguíveis de células saudáveis normais. Aqui descrevemos os protocolos para detecção e monitoramento de células que passam por anastasis em animais vivos, usando nosso sistema de biosensor recentemente desenvolvido na vivo CaspaseTracker.

Detecção de Anastasis na Vivo por CaspaseTracker Biosensor

Este protocolo descreve caspase Bimolecular complementação de fluorescência (BiFC); um método baseado em imagens que pode ser usado para visualizar induzida proximidade das caspases de iniciador, que é o primeiro passo para sua ativação.

Iluminando os caminhos para a ativação de Caspase usando fluorescência Bimolecular complementação

Aqui, é apresentado um fluxo de trabalho experimental que permite a detecção do processamento caspase-8 diretamente no complexo de sinalização indutor de morte (DISC) e determina a composição desse complexo. Essa metodologia possui amplas aplicações, desde a desvendação dos mecanismos moleculares das vias de morte celular até a modelagem dinâmica das redes de apoptose.

Medição da Composição do Complexo de Sinalização e Processamento de Indução de Morte CD95 de Procaspase-8 neste Complexo

Este protocolo descreve o fluxo de trabalho para obter macrófagos derivados de monócitos (MDM) a partir de amostras de sangue humano, um método simples para introduzir eficientemente os repórteres de complementação de fluorescência bimolecular inflamatória (BiFC) em MDM humano sem comprometer a viabilidade e o comportamento celular, e uma abordagem baseada em imagens para medir a ativação inflamatória de caspase em células vivas.

Visualização de Caspases Inflamatórias Induzidas proximidade em macrófagos derivados de monócitos humanos

Este protocolo descreve um método abrangente para avaliar a ativação da caspase (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9 e caspase-11) em resposta a modelos in vitro e in vivo (em camundongos) de infecção, insultos estéreis e câncer para determinar o início de vias de morte celular, como piroptose, apoptose, necroptose e PANoptose.

Avaliação da ativação da caspase para avaliar a morte de células imunes inatas

O presente protocolo descreve dois métodos para medir a atividade da caspase através de um substrato fluorogênico usando citometria de fluxo ou um espectrofluorômetro.

Medindo a atividade da caspase usando um ensaio fluorométrico ou citometria de fluxo

Aprenda a realizar um ensaio multiplex de caspase-3/7 para avaliar apoptose em neurônios hipotalâmicos expostos a ácido palmítico. Este método rápido e de alto rendimento permite medir viabilidade celular e atividade de caspase simultaneamente.

Utilização de uma caspase Multiplexing ensaio para determinar a apoptose em um modelo de célula hipotalâmica

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