Usando RNA-interferência para investigar a imunitário inatas de resposta em macrófagos

O objetivo geral deste procedimento é utilizar a interferência por RNA para investigar o efeito de genes candidatos na resposta imune inata. Em macrófagos de camundongo, para isso, linhagens celulares de macrófagos de camundongo são tripsinizadas e combinadas com solução de transfeção e os siRNAs de interesse; a mistura é então transferida para uma placa de 96 poços Nucleo VETE e um sistema de transfeção 96 Well Maxa é utilizado para transfectar o siRNA nos macrófagos. Após uma incubação com meio de cultura celular, LPS ou outros ativadores da imunidade inata são aplicados aos macrófagos transfectados para estimulá-los. Por fim, ELIZAs são realizadas para monitorar a produção de citocinas e avaliar o efeito do tratamento com siRNA na resposta imune inata.

A principal vantagem desta técnica em relação à transfeção mediada por lipídeos é que nosso ensaio é robusto e pode ser aplicado a muitos genes em alto rendimento. A chave para este método é trabalhar com células saudáveis, manipulá-las com cuidado e atuar de forma eficiente durante o processo de transfeção. Como demonstraremos, este protocolo utiliza a linhagem celular de macrófagos murinos 264.7, que é cultivada conforme descrito no documento complementar.

Como preparação para a placa de transfeção INA, semeie as células com 20% de confluência e cultive por um ou dois dias até que as células atinjam no máximo 80% de confluência. É importante lembrar de utilizar células entre a terceira e a décima passagem. Após o descongelamento, inicie este procedimento programando o sistema shuttle de 96 poços que será usado para a transfeção.

Para fazer isso, inicie o software do shuttle de 96 poços no computador conectado ao shuttle, a partir do menu de arquivos no canto superior esquerdo. Selecione um novo arquivo de parâmetros. Destaque os poços que serão transfectados no esquema do placa de 96 poços exibido.

Uma caixa verde indicará as poças selecionadas. Escolha o programa que corresponde à linhagem celular de macrófago utilizada para as células brutas 2 64 0,7. Escolha DS 1 36, selecione e aplique.

Observe que, após selecionar um programa, os poços no esquema da placa serão coloridos. Círculos vazios azul-escuros indicam poços que não foram atribuídos a nenhum programa e que não receberão choque. Em seguida, prepare a solução efetora de trabalho misturando a solução efetora para linha celular SF em placa de 96 poços com todo o conteúdo do tubo de suplemento incluso.

Deixe os reagentes misturados equilibrarem à temperatura ambiente. Aqueça o D-M-E-M-R-P-M-I 1640, tripsina 0,25% EDTA e PBS a 37 graus Celsius. Prepare o plasmídeo controle S-I-R-N-A-P max GFP experimental ou siRNAs marcados fluorescentemente descongelando-os no gelo para destacar macrófagos aderentes dos recipientes de cultura celular.

Aspire o meio e lave as células duas vezes com 10 mililitros de PBS. Em seguida, após a remoção do PBS, incube as células com um mililitro de tripsina 0,25% EDTA previamente aquecida por placa até que as células comecem a se desprender. Isso leva de um a dois minutos.

Toque suavemente na placa e movimente a solução durante a incubação para maximizar a ação da tripsina. Após as células se desanatarem, adicione nove mililitros de DMEM acrescido de FBS, misturando suavemente por pipetagem para cima e para baixo, e então recolha as células por pipetagem em um tubo estéril. Conte o número de macrófagos isolados utilizando um Hema Cytometer.

Espera-se cerca de 10 milhões de macrófagos por placa de 10 centímetros. Calcule o número total de macrófagos necessário, considerando que cada poço da placa de 96 poços requer 200.000 células. Pipete o número calculado de células em um tubo de centrífuga.

Centrifugue as células por 10 minutos a 150 G à temperatura ambiente em uma placa estéril de 96 poços com fundo redondo, o que facilita a mistura enquanto minimiza a perda de reagentes. Adicione dois microlitros de cada IRNA a cada poço a ser transfectado. Observe que, dependendo do número de siRNAs, isso pode ser realizado durante a etapa de centrifugação dos macrófagos.

O aspecto mais difícil deste procedimento é a eletroporação, cujas chaves são tratar as células com muita delicadeza e trabalhar com muita rapidez. Assim que as células estiverem em uma solução de transfeção tóxica, aspire o meio das células centrifugadas e, em seguida, ressuspenda-as suavemente na solução efetora nucleica SF contendo a solução suplemento.

Transfira imediatamente as células para uma cuba estéril usando uma pipeta multicanal, transferindo 20 microlitros da mistura celular re-suspensa para cada poço de uma placa de 96 poços contendo os siRNAs, misturando suavemente por pipetagem para cima e para baixo. Em seguida, transfira 20 microlitros da mistura celular INA para a placa de nucleo vete de 96 poços. É fundamental evitar a formação de bolhas durante este passo, pois isso pode induzir erros durante a nucleação.

Após posicionar todas as amostras experimentais na placa de transfeção, cubra-a com a tampa fornecida e bata suavemente na superfície dura. Para remover quaisquer bolhas, coloque a placa de 96 poços no suporte 96 poços do nucleo efetor e, no canto inferior direito da tela do programa, selecione carregar e iniciar. Em seguida, siga as instruções do programa para salvar os resultados durante o processo de nucleoefecção nos poços com sucesso.

Os poços transfectados serão representados no esquema de 96 poços na tela por um círculo verde com um sinal de adição. Um círculo vermelho com um sinal de subtração indica um erro, provavelmente devido a bolhas ou à pipetagem de um volume incorreto de reagentes imediatamente após a nucleofecção. Utilize uma pipeta multicanal para adicionar 80 microlitros de RPMI 1640 pré-aquecido.

Adicione o meio suavemente ao lado de cada poço. Deixe o meio misturar-se lentamente com as células transfectadas, que estão muito delicadas nesta fase. Adicionar o meio muito rapidamente reduzirá drasticamente a viabilidade.

Coloque a placa de 96 poços com as amostras transfectadas e o meio RPMI 1640 em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de CO₂ por dois minutos ou mais. É fundamental permitir que as células se recuperem antes de qualquer manipulação adicional. Após remover a placa da incubadora, utilize uma pipeta multicanal para transferir cuidadosamente a mistura de cada poço para uma placa de cultura de tecidos de 96 poços.

Em seguida, utilizando a pipeta multicanal, adicione 100 microlitros de DMEM com FBS a cada poço. Incube por 24 a 36 horas e, imediatamente após a transfeção e recuperação, realize citometria de fluxo. Para avaliar a eficiência de transfeção do siRNA marcado com fluoróforo, mais de 99% das células devem estar transfectadas no dia seguinte à transfeção. Para a eficiência de transfeção do plasmídeo GFP, 30 a 50% das células devem expressar GFP. Após a incubação de 24 a 36 horas, prepare o LPS ou outros ativadores da imunidade inata em meio fresco, diluindo o LPS para uma concentração final de 20 nanogramas por mililitro em DMEM com FBS.

Em seguida, aspire cuidadosamente o meio da placa de 96 poços e adicione o meio fresco contendo o LPS às células. Coloque a placa em uma incubadora para monitorar a resposta ao LPS ou a outros estimuladores da imunidade inata em diversos momentos após a estimulação. Pipete o sobrenadante das células para uma placa de armazenamento de 96 poços para análise por Eliza.

Após remover o sobrenadante para monitorar a viabilidade celular, adicione 100 microlitros de fluoresceína diacetato na proporção de um para 100 em PBS a cada poço e incube à temperatura ambiente por um a cinco minutos. Monitore a fluorescência nas células utilizando um leitor de placas quando clivada por esterases celulares em células vivas. Esse composto torna-se fluorescente para ilustrar a utilidade dessa abordagem para monitorar a resposta imune inata.

siRNAs direcionados a genes reguladores imunes inatos conhecidos foram transfetados na linhagem celular de macrófagos RAW 264.7. As células foram então estimuladas com LPS e a produção dos citocinas pró-inflamatórios IL-6 e TNF-α foi monitorada por ELISA, conforme mostrado aqui.

Inibição do receptor tipo toll quatro, o receptor para LPS, mas não outros TLRs. Utilizando SIR, observou-se uma produção fortemente reduzida de IL seis e TNF alfa induzida por LPS. Observe que a inibição de IL seis com irna diminuiu a produção de IL seis, mas não afetou a produção de TNF alfa.

Esses dados sugerem boa eficácia e boa especificidade do silenciamento mediado por siRNA de reguladores candidatos da imunidade inata. É importante lembrar que a chave para uma boa transfeção e boa recuperação celular é trabalhar com células muito saudáveis, tratá-las com cuidado durante o processo de transfeção e recuperação, e trabalhar rapidamente assim que as células estiverem em uma solução efetora nucleo. Após este procedimento, muitos outros ensaios podem ser realizados, incluindo QPCR para monitorar o silenciamento gênico e diversos outros ensaios para investigar a resposta imune inata.