Usando RNA-interferência para investigar a imunitário inatas de resposta em macrófagos

O objetivo geral deste procedimento é usar a interferência de RNA para investigar o efeito de genes candidatos na resposta imune inata. Em macrófagos de camundongos para fazer isso, as linhagens celulares de macrófagos de camundongos são tripsinizadas e combinadas com solução de transfecção e os RNAs SI de interesse, a mistura é então transferida para uma placa VETE de núcleo de 96 poços e um sistema de transfecção de 96 poços Maxa é usado para transfectar siRNA nos macrófagos e após uma incubação com cultura de células, LPS ou outros ativadores da imunidade inata são aplicados aos macrófagos transfectados para estimulá-los. Finalmente, os Eliza são então realizados para monitorar a produção de citocinas e avaliar o efeito do tratamento com siRNA na resposta imune inata.

A principal vantagem desta técnica sobre a transfecção mediada por lipídios é que nosso ensaio é robusto e pode ser aplicado a muitos genes em profissão de alto rendimento. A chave para esse método é trabalhar com células saudáveis, tratá-las com cuidado e trabalhar com eficiência durante o processo de transfecção. Como demonstraremos, este protocolo usa a linha celular bruta de macrófagos de camundongo 2 64 0.7, que é cultivada conforme descrito no documento anexo.

Em preparação para a placa de transfecção INA, as células em 20%co fluência e crescem um ou dois dias até que as células não sejam mais do que 80% confluentes. É importante lembrar de usar células que estão entre as passagens três e 10. Após o descongelamento, inicie este procedimento programando o sistema de transporte de 96 poços que será usado para transfecção.

Para fazer isso, inicie o software do ônibus espacial de 96 poços no computador conectado ao ônibus no menu de arquivos superior esquerdo. Selecione o novo arquivo de parâmetro. Destaque os poços que serão transfectados no esquema de placa de 96 poços exibido.

Uma caixa verde indicará os poços selecionados. Escolha o programa que corresponde à linha celular de macrófagos que está sendo usada para 2 64 0,7 células brutas. Escolha DS 1 36 selecione aplicar.

Observe que depois de selecionar um programa, os poços na placa esquemática serão coloridos. Círculos vazios azuis escuros indicam poços que não receberam um programa e não ficarão chocados. Em seguida, prepare a solução efetora nucleo de trabalho misturando a solução efetora nucleo de 96 poços da linha celular SF com todo o conteúdo do tubo suplementar incluído.

Deixar os reagentes misturados equilibrarem à temperatura ambiente. Aqueça o D-M-E-M-R-P-M-I 1640 0,25% tripsina EDTA e PBS a 37 graus Celsius. Prepare o plasmídeo experimental de controle S-I-R-N-A-P max GFP ou siRNAs marcados com fluorescência, descongelando-os em gelo para separar macrófagos aderentes das placas de cultura de células.

Aspire o meio e lave as células duas vezes com 10 mililitros de PBS. Em seguida, depois de remover o PBS, incube as células com um mililitro de EDTA a 0,25% pré-avisado por placa até que as células comecem a se desprender. Isso leva de um a dois minutos.

Bata suavemente na placa e mova a solução durante a incubação para maximizar a tripsina. Depois que as células se separarem, adicione nove mililitros de DMEM mais FBS misture suavemente pipetando para cima e para baixo e, em seguida, colete as células pipetando em um tubo estéril. Conte o número de macrófagos isolados usando um citômetro Hema.

Espere cerca de 10 milhões de macrófagos por placa de 10 centímetros. Calcule o número total de macrófagos necessários para cada poço no ônibus espacial de 96 poços requer 200.000 células. Pipetar o número calculado de células para um tubo de centrífuga.

Gire as células por 10 minutos a 150 G em temperatura ambiente até uma placa inferior redonda estéril de 96 poços, o que facilita a mistura e minimiza a perda de reagente. Adicione dois microlitros de cada IRNA a cada poço a ser transfectado. Observe que, dependendo do número de siRNAs, isso pode ser realizado durante a etapa de centrifugação dos macrófagos.

O aspecto mais difícil deste procedimento é a eletroporação, as chaves que tratam as células com muita delicadeza e funcionam muito rapidamente. Uma vez que as células estejam em uma solução tóxica de transfecção, aspire o meio das células centrífugas e, em seguida, ressuspenda-as suavemente em solução nucleoefetora. SF contendo a solução suplementar.

Transfira imediatamente as células para uma calha estéril usando uma pipeta multicanal, transfira 20 microlitros da mistura de células ressuspensas para cada poço da placa de 96 poços contendo os siRNAs suavemente misturados pipetando para cima e para baixo. Em seguida, transfira 20 microlitros da mistura de células INA para a placa nucleovete de 96 poços. É fundamental evitar a geração de bolhas durante esta etapa, pois isso pode induzir erros durante o acometimento do núcleo.

Depois de colocar todas as amostras experimentais na placa de transfecção, cubra-a com a tampa fornecida e bata suavemente em uma superfície dura. Para remover quaisquer bolhas, coloque a placa de 96 poços no lançador efetor de 96 poços e, no canto inferior direito da tela do programa, selecione carregar e iniciar. Em seguida, siga o prompt do programa para salvar os resultados durante o processo de afeto do núcleo com sucesso.

A transfecção será representada no esquema de 96 poços na tela por um círculo verde com um sinal de mais. Um círculo vermelho com um sinal de menos indica um erro provavelmente devido a bolhas ou pipetagem do volume incorreto de reagentes imediatamente após a afecção do núcleo. Use uma pipeta multicanal para adicionar 80 microlitros de RPMI 1640 pré-aquecido.

Médio ao lado de cada um. Bem, permita que o meio se misture lentamente com as células transfectadas, que são muito delicadas nesta fase. Adicionar o meio muito rápido diminuirá muito a viabilidade.

Coloque a placa de 96 poços com amostras transfectadas e RPMI 1640 em uma incubadora de 37 graus Celsius com 5% de CO2 por dois ou mais minutos. É fundamental permitir que as células se recuperem antes de uma manipulação posterior. Depois de remover a placa da incubadora, use uma pipeta multicanal para transferir cuidadosamente a mistura de cada poço para uma placa de cultura de tecidos de 96 poços.

Então, novamente, usando a pipeta multicanal, adicione 100 microlitros de DMEM com FBS a cada um. Poço incubar por 24 a 36 horas imediatamente após a transfecção e recuperação realizar citometria de fluxo. Para avaliar a eficiência de transfecção de IRNA SI marcado com fluorescência, mais de 99% das células devem ser transfectadas no dia seguinte ao ensaio de transfecção Para a eficiência de transfecção do plasmídeo GFP, 30 a 50% das células devem expressar GFP Após a incubação de 24 a 36 horas, prepare LPS ou outros ativadores da imunidade inata em meio fresco dilua o LPS até uma concentração final de 20 nanogramas por mililitro em DMEM com FBS.

Em seguida, aspire cuidadosamente o meio da placa de 96 poços e adicione o meio fresco contendo o LPS às células. Coloque a placa em uma incubadora para monitorar a resposta ao LPS ou outros estimuladores da imunidade inata em vários momentos após a estimulação. Pipete o sobrenadante das células para uma placa de armazenamento de 96 poços para análise por Eliza.

Depois de remover o sobrenadante para monitorar a viabilidade celular, adicione 100 microlitros de um a 100 diacetato de fluoresceína em PBS a cada poço incubar em temperatura ambiente por um a cinco minutos. Monitore a fluorescência nas células usando um leitor de placas quando clivado por esterases celulares em células vivas. Este composto torna-se fluorescente para ilustrar a utilidade desta abordagem para monitorar a resposta imune inata.

siRNAs direcionados a genes reguladores imunológicos inatos conhecidos foram transfectados na linha celular bruta de macrófagos 2 64 0,7. As células foram então estimuladas com LPS e produção de citocinas pró-inflamatórias. IL seis e TNF alfa foram monitorados por Eliza, conforme mostrado aqui.

Inibição do receptor toll-like quatro, o receptor para LPS, mas não para outros TLRs. Usando SIR, uma produção fortemente diminuída de LPS induziu IL seis e TNF alfa. Observe que a inibição de IL seis com irna diminuiu a produção de IL seis, mas não afetou a produção de TNF alfa.

Esses dados sugerem boa eficácia e boa especificidade do knockdown mediado por siRNA de candidatos a reguladores da imunidade inata. É importante lembrar que a chave para uma boa transfecção e boa recuperação celular é trabalhar com células muito saudáveis, tratá-las suavemente durante o processo de transfecção e recuperação e trabalhar rapidamente quando as células estiverem em uma solução efetora de núcleo. Após este procedimento, muitos outros ensaios podem ser realizados, incluindo QPCR para monitorar o knockdown do gene e muitos outros ensaios para investigar a resposta imune inata.