Name: Usando RNA-interferência para investigar a imunitário inatas de resposta em macrófagos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Aprenda a usar RNA de interferência para investigar a resposta imune inata em macrófagos murinos. Este método permite silenciar genes candidatos e avaliar a produção de citocinas após estimulação com LPS.

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Agradecimentos a Brad Lackford pela ajuda na otimização de algumas das técnicas descritas neste manuscrito.

1. A manutenção de linhas celulares de macrófagos <ol><li> Cresça RAW264.7 e linhas de células J774A.1 em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) a 37 ºC na presença de 5% de CO 2. Para ajudar a manter a esterilidade, adicione 1% de penicilina / estreptomicina (pen / strep) para a mídia (embora este não é estritamente necessário). </li><li> Passo crítico: Certifique-se que os macrófagos estão crescendo em um estado saudável para transfecção eficiente e knockdown gene induzida por siRNA. Use células entre as passagens 3 e 10 após o descongelamento fresco, uma vez que estas linhas de macrófagos apresentam a melhor eficiência de transfecção e manter robusta sobrevivência pós-transfecção nesta fase; não use um número de passagens maior (&gt; 20), como a eficiência de transfecção e gene knockdown tanto diminuir significativamente. </li><li> Para a transfecção siRNA optimizado, células da placa em 20% de confluência e crescer um ou dois dias até as células atingirem confluência não superior a 80%. As células crescidas não irá transfectar efficiently. </li></ol> 2. Sistema de Programação do vaivém 96 poços para a transfecção <ol><li> Inicie o software de transporte de 96 poços no computador conectado à nave. Selecione o novo arquivo de parâmetro a partir do topo do menu arquivo esquerda. </li><li> Realce os poços que vai ser exibido transfectadas na placa de 96 poços esquemática. A caixa verde indicará que os poços são selecionados. </li><li> Seleccionar o programa que corresponde à linha celular de macrófagos sendo usado (DS-136 para RAW264.7 ou DS-130 para J774A.1) e seleccionar aplicar, localizado abaixo da diagramado placa de 96 poços. Note-se que depois de seleccionar um programa, os poços na placa esquemática será de cor azul escura. Círculos vazios indicam poços que não foram atribuídos um programa e não vai ficar chocado. </li></ol> 3. Preparação dos reagentes para transfecção <ol><li> Preparar a solução de trabalho Nucleofector ™ misturando SF linha celular de 96 bem-solução Nucleofector ™com a totalidade do conteúdo do tubo de suplemento fechado. Permitir que os reagentes misturados a equilibrar à temperatura ambiente antes de usar. Armazenar o excesso de solução Nucleofector ™ completa a 4 ºC por até 3 meses para uso futuro. </li><li> Pré-aquecer a solução salina DMEM, RPMI-1640, 0,25% de tripsina / EDTA, e fosfato tamponada (PBS) a 37 ºC antes de preparar os macrófagos para a transfecção. </li><li> Prepare o siRNA para a transfecção por degelo em gelo. A fim de minimizar o número de degelos congelamento do siRNA, congelar novos siRNAs em alíquotas a primeira vez que eles são usados. </li><li> Em experiências iniciais, utilizar siRNA a uma dose relativamente elevada de 2 uM (diluído 1:10 a partir de 20? M stocks). Posteriormente titular siRNAs que induzem gene robusto knockdown para baixo para doses mais baixas, embora sejam necessárias doses normalmente mais elevados para knockdown gene eficiente em macrófagos em comparação com outros tipos de células. NOTA: Os siRNAs estão disponíveis a partir de muitas fontes; knockdown bastante robusta gene pode ser obtidousando SMARTPOOLs siGenome, que são grupos de quatro siRNAs segmentação cada gene. Como controle negativo, use qualquer um dos vários conjuntos não-alvo siRNA ou siRNAs. </li><li> Para controlar a eficiência da transfecção, transfectar ou o plasmídeo controlo pmaxGFP (fornecida nos kits Amaxa) ou siRNAs fluorescentemente marcadas em paralelo com os siRNAs experimentais. Esperar 30-50% de transfecção do plasmídeo GFP (ensaiado por microscopia ou por citometria de fluxo no dia após a transfecção) e&gt; 99% de transfecção fluorescentemente marcado siRNA (ensaiada por citometria de fluxo imediatamente após a transfecção e recuperação). </li></ol> 4. Preparando os macrófagos para transfecção <ol><li> Separar macrófagos aderentes provenientes das placas de cultura de células por tripsinização. Aspirar a mídia e lave as células duas vezes com 10 ml de PBS. Após a remoção do PBS, incubar as células com pré-aquecida até 0,25% de tripsina / EDTA (1 ml / placa de 10 cm) durante 1-2 min até que as células comecem a separar. Bata suavemente na placa e mover a solução durante a incubação para maximizar a tripsinização. </li><li> Após a incubação, adicionar 9 ml de meio DMEM + FBS, misture suavemente para cima e para baixo, e recolher as células por pipetagem em um tubo estéril. </li><li> Contar o número de macrófagos isolados, utilizando um hemocitómetro. Espere cerca de 10 milhões de macrófagos por placa de 10 cm. Calcule o número total de macrófagos necessários; cada poço na 96 poços vaivém requer 200.000 células. Lembre-se de adicionar valor de alguns poços adicionais de células para permitir perdas de pipetagem. </li><li> Pipetar o número calculado de células para um tubo de centrífuga. Centrifuga-se as células durante 10 min a 150 xg à temperatura ambiente. Não centrifugar muito rapidamente, pois isso vai diminuir saúde macrófagos e eficiência de transfecção. </li></ol> 5. Nucleofection de macrófagos com siRNA <ol><li> Usando uma placa de 96 poços de fundo redondo estéril (o que facilita a mistura, enquanto minimiza a perda de reagentes), adicionar 2 mL de cada siRNA para cada poço a ser transfected. Nota: Dependendo do número de siRNAs, isto pode ser realizado durante o passo de centrifugação de macrófagos. </li><li> Aspirar a mídia a partir de células centrifugadas. Delicadamente ressuspender as células em solução Nucleofector ™ SF (contendo a solução suplemento), utilizando-se 20 ul por 200.000 células peletizadas. Uma vez ressuspensa, utilizar as células imediatamente para a transfecção óptima. </li><li> Transferir as células ressuspensas para uma calha estéril; utilizando uma pipeta de canais múltiplos, a transferência de 20 mL da mistura de células ressuspenso em cada poço da placa de 96 poços contendo o siRNAs. Misture delicadamente por pipetagem cima e para baixo. </li><li> Transferir 20 uL da mistura de célula / siRNA para a placa com 96 poços Nucleocuvette ™ passo crítico:. Evitar a geração de bolhas durante o passo de transferência como este pode induzir erros durante Nucleofection. </li><li> Depois de colocar todas as amostras experimentais na placa de transfecção, cobrir a placa de 96 poços, com a tampa fornecida e seey bater suavemente sobre uma superfície dura para remover quaisquer bolhas a partir das amostras. </li><li> Coloque placa de 96 poços com tampa para o de 96 poços de transporte Nucleofector e selecione &quot;carregar e iniciar &#39;no canto inferior direito da tela do programa. Antes Nucleofection, siga o prompt programa para salvar os resultados. Nota: Durante o processo de Nucleofection, poços transfectadas com sucesso será representado no 96 poços esquemática na tela por um círculo verde com um sinal de mais. Um círculo vermelho com sinais de menos indica um erro, provavelmente devido a bolhas ou mis-pipetagem do volume correto de reagentes. </li></ol> 6. Recuperação e chapeamento de macrófagos <ol><li> Imediatamente após Nucleofection, utilizando uma pipeta multicanal, adicionar 80 ul de pré-aquecido (37 ºC) RMP1-1640 meios de comunicação a cada poço. Adicionar os meios de comunicação para o lado de cada poço, permitindo que os meios de comunicação para misturar lentamente com as células transfectadas, as quais são muito delicado nesta fase. Não adicione a mídia muito rápido, pois isso irádiminuir consideravelmente a viabilidade. </li><li> Colocar as placas de 96 poços com amostras transfectadas e meio RPMI-1640 numa incubadora de 37 ºC, com 5% de CO 2 durante 2 min; esta é crítica para permitir que as células para recuperar antes da manipulação posterior. </li><li> Remova a placa de 96 poços da incubadora e transferir cuidadosamente a mistura de cada poço para uma placa de 96 poços de cultura de tecidos utilizando uma pipeta multicanal. </li><li> Usando uma pipeta de canais múltiplos, adicionar 100 ul de pré-aquecido (37 ºC) DMEM + FBS a cada poço. </li><li> Incubar a placa de cultura de tecidos de 96 poços com amostras em uma incubadora de 37 ºC, com 5% de CO 2 durante 24-36 hr (optimizar o momento exacto para siRNAs individuais, embora este intervalo de tempo, geralmente funciona bem). </li></ol> 7. Estimulação de macrófagos com LPS <ol><li> Após a 24-36 horas pós-Nucleofection incubação, preparar LPS (ou outro PAMPs) em meio fresco. Prepare meio fresco o suficiente para todos os poços (200 mL mEDIA / poço da placa de 96 poços e um pouco mais para a pipetagem). Dilui-se LPS para uma concentração final de 20 ng / mL em DMEM + FBS. </li><li> Media cuidadosamente aspirado a partir da placa de 96 poços e adicionar o meio fresco contendo os LPS às células. </li><li> Monitorar a resposta ao LPS ou outros MMAPs em vários momentos após a estimulação. 6 horas é suficiente para gerar uma resposta de citocinas inflamatórias robusto para citocinas tais como IL-6 ou TNFa. </li></ol> 8. Acompanhamento da Induzida imunitário inatas Response, Gene Knockdown e Viabilidade de macrófagos <ol><li> Para monitorizar a produção de citocinas induzida por LPS, pipeta-se o sobrenadante das células para uma placa de armazenamento de 96 poços. A produção de citocinas pode ser então medido por ELISA. </li><li> Uma vez que o sobrenadante é removido, monitorar a viabilidade celular utilizando diacetato de fluoresceína (quando clivada por esterases celulares em células vivas, este composto se torna fluorescente). Identificar os siRNAs que têm como alvo os genes que controlam a viabilidade celular usando tsua abordagem. Nota: o processo de transfecção em si deve ter pouco efeito sobre a viabilidade se for realizada correctamente. <ol><li> Adicionar diacetato de fluoresceína (5 mg estoque / mL em acetona) a cada poço (1: 100 de diluição final em PBS). </li><li> Incubar à temperatura ambiente durante 1-5 min e, em seguida, monitorar fluorescência nas células, utilizando um leitor de placas (460 nm de excitação, 515 nm de emissão). </li><li> Opcional: Para assegurar que a fluorescência nos poços é uniforme, lisar as células, utilizando tampões tais como RIPA; isto proporciona um sinal fluorescente uniforme no poço, como alguns leitores de placas estão configurados para monitorar apenas uma pequena porção do poço; se as células não são colocadas de maneira uniforme, o diacetato de fluoresceína pode dar uma leitura imprecisa. </li></ol></li><li> Como uma alternativa para monitorar a viabilidade celular, monitorar gene induzida por siARN knockdown por qPCR utilizando ARN derivado a partir das células aderentes. <ol><li> Após o sobrenadante é removido a partir das células (passo 8.1), o anúnciod tampão RLT (que é usado para a lise e preservação de ARN) directamente para as células aderentes para lisar-los. </li><li> Isolar ARN utilizando um kit de preparação de RNA tais como o mini-kit RNeasy, e usar qPCR com iniciadores específicos do gene para monitorar gene relativa knockdown para controlar o tratamento de siRNA. Use Βactin ou iniciadores para GAPDH para normalização. </li></ol></li><li> Como uma outra alternativa para controlar outros aspectos da resposta imune inata, monitorar a capacidade fagocitica dos macrófagos adicionando marcado com FITC E. coli partículas directamente sobre as células aderentes utilizando um kit. Seguindo o protocolo do fabricante, o que leva apenas algumas horas, monitorizar a absorção fagocítica utilizando um leitor de placas ou microscopia. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes. Este artigo foi patrocinado pela Lonza, Inc.

Numerosos estudos têm sido publicados em que genes individuais têm sido alvo de siRNA em macrófagos murinos. Enquanto a transfecção mediada por lípidos foi usado para entregar siRNA para linhas celulares de macrófagos, numa base individual, estes métodos sofrem de efeitos potenciais sobre a viabilidade, knockdown gene limitada, e variabilidade de gene para gene. Para desenvolver ensaios mais robustos que poderiam ser usados ​​para direcionar genes na forma de médio ou de alto rendimento, nós otimizamos técnicas que util...

Neste protocolo, descrevemos métodos eficientes para inibir genes em linhagens de células de rato macrófagos utilizando siRNAs e monitorar os efeitos desses tratamentos sobre a resposta imune inata. Estes procedimentos são realizados no formato de 96 poços, permitindo para telas de ARNi em forma de médio ou alto rendimento. Em resposta a infecção, os humanos montar uma resposta imune inata imediata e uma resposta imune adaptativa mais lento, mas mais específico. Esta resposta imune inata rápida envolve o recrutamento e activação de células imunitárias inatas fagocíticas incluindo macrófagos 1. Classicamente macrófagos activados são envolvidos em respostas inflamatórias agudas e produzem proteínas antimicrobianas e compostos, citocinas e quimiocinas, e apresentam antígenos 2,3. Alternativamente macrófagos activados desempenham um papel na regulação da imunidade, manutenção da tolerância, a reparação de tecidos, a cicatrização de feridas e 4-8. Devido à sua ampla gama de funções, Os macrófagos podem desempenhar um papel em numerosas doenças, incluindo a aterosclerose, artrite, cancro e 9. Assim, o estudo dos macrófagos tem sido uma importante área de pesquisa por algum tempo em uma grande variedade de campos de doença. Apesar da sua importância na resposta imune inata, os macrófagos podem ser um desafio células para trabalhar. Em particular, é difícil a obtenção de transfecção eficiente, utilizando reagentes de lípidos nos macrófagos sem toxicidade associada 10,11. Além disso, mesmo quando siRNA é eficientemente entregues aos macrófagos, a robustez do gene induzida por ARNi knockdown pode muitas vezes ser bastante moderado e pode variar de gene para gene. Para superar estes desafios técnicos, nós otimizamos transfecção e técnicas knockdown 16/12 em duas linhas de células de rato macrófagos, RAW264.7 17 e 18 J774A.1. Esta abordagem utiliza o Sistema de Transporte de 96 poços Amaxa Nucleofector para transfecção; este sistemautiliza uma combinação de reagentes e electroporação para transfectar células especializadas em formato de 96 poços 19. Após transfecção, descrevemos métodos para maximizar a recuperação e viabilidade celular e para maximizar subseqüente knockdown gene induzida por siRNA. Para ilustrar a utilidade desta abordagem, os autores descrevem um protocolo para a entrega de siRNA para estas linhas celulares de macrófagos, estimular essas células com lipopolissacarídeo (LPS), e monitorizar a resposta imune inata no nível de produção de várias citocinas pró-inflamatórias. Nós fornecemos os dados da amostra em que têm como alvo a família de receptores Toll-like (TLR), cujos membros sentem LPS e outros padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), para regular a imunidade inata.

<table><tbody><tr><td>Sistema de transporte de 96 poços de nucleofector Amaxa</td><td>Lonza</td><td>AAM-1001S</td> Linha celular Amaxa SF Kit de nucleofector de 96 poços <td></td></tr><tr><td></td><td>Lonza</td><td>V4SC-2096</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 linha celular de macrófagos de camundongo</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>J774A.1 linha celular de macrófagos de camundongo</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td></td></tr><tr><td>siGenome smartpool siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>varia dependendo no gene</td><td></td></tr><tr><td>Pool de siRNA de controle não direcionado</td><td>Dharmacon</td><td>D-001206-13-20</td><td></td></tr><tr><td>Oligo fluorescente Block-iT para eletroporação</td><td>Invitrogen</td><td>13750062</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure E. coli O111:B4 LPS</td><td>Lista Laboratórios Biológicos</td><td>421</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glicose alta</td><td>Invitrogen</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Solução de penicilina-estreptomicina (Pen/Strep)</td><td>Fisher</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>placas de cultura de tecidos de 96 poços</td><td>Fisher</td><td>07-200-89 &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Placas estéreis de fundo redondo de 96 poços (não revestidas)</td><td>Fisher</td><td>07-200-745</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL-6 Duoset ELISA kit</td><td>R& D Biosystems</td><td>DY406</td><td></td></tr><tr><td>Mouse TNF&alpha; Kit ELISA Duoset</td><td>R& D Biosystems</td><td>DY410</td><td></td></tr><tr><td>Diacetato de fluoresceína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7378</td><td></td></tr><tr><td>Tampão RLT</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant Kit de ensaio de fagocitose</td><td>Invitrogen</td><td>V-6694</td><td></td></tr></tbody></table>

usando rna-interferência para investigar a imunitário inatas de resposta em macrófagos

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Os macrófagos são células-chave do sistema imunológico inato fagocítico. Quando os macrófagos encontram um patógeno, eles produzem proteínas e compostos antimicrobianos para matar o patógeno, produzem várias citocinas e quimiocinas para recrutar e estimular outras células imunes e apresentam antígenos para estimular a resposta imune adaptativa. Assim, ser capaz de manipular macrófagos com eficiência com técnicas como RNA-interferência (RNAi) é fundamental para nossa capacidade de investigar essa importante célula imune inata. No entanto, os macrófagos podem ser tecnicamente desafiadores para transfectar e podem exibir knockdown de genes induzido por RNAi ineficiente. Neste protocolo, descrevemos métodos para transfectar eficientemente duas linhagens celulares de macrófagos de camundongo (RAW264.7 e J774A.1) com siRNA usando o Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System e descrevemos procedimentos para maximizar o efeito do siRNA no knockdown do gene. Além disso, os métodos descritos são adaptados para trabalhar no formato de 96 poços, permitindo estudos de médio e alto rendimento. Para demonstrar a utilidade dessa abordagem, descrevemos experimentos que utilizam RNAi para inibir genes que regulam a produção de citocinas induzida por lipopolissacarídeo (LPS).

Para demonstrar a eficiência de transfecção usando esta abordagem, foi monitorada a absorção de siARN marcado com FITC utilizando um citómetro de fluxo (Figura 1). Para ilustrar a utilidade da nossa abordagem para o controlo da resposta imune inata, que transfectadas siRNAs dirigidos conhecidos genes reguladores da imunidade inata para a linha celular RAW264.7 de macrófagos, as células estimuladas com LPS, em seguida, monitorizada a produção de citocinas pró-inflamatórias IL...

Neste protocolo, descrevemos métodos para transfectar eficientemente linhagens celulares de macrófagos murinos com siRNAs usando o Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, estimular os macrófagos com lipopolissacarídeo e monitorar os efeitos na produção de citocinas inflamatórias.

Usando RNA-interferência para investigar a imunitário inatas de resposta em macrófagos

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

O objetivo geral deste procedimento é utilizar a interferência por RNA para investigar o efeito de genes candidatos na resposta imune inata. Em macrófagos de camundongo, para isso, linhagens celulares de macrófagos de camundongo são tripsinizadas e combinadas com solução de transfeção e os siRNAs de interesse; a mistura é então transferida para uma placa de 96 poços Nucleo VETE e um sistema de transfeção 96 Well Maxa é utilizado para transfectar o siRNA nos macrófagos. Após uma incubação com meio de cultura celular, LPS ou outros ativadores da imunidade inata são aplicados aos macrófagos transfectados para estimulá-los. Por fim, ELIZAs são realizadas para monitorar a produção de citocinas e avaliar o efeito do tratamento com siRNA na resposta imune inata.A principal vantagem desta técnica em relação à transfeção mediada por lipídeos é que nosso ensaio é robusto e pode ser aplicado a muitos genes em alto rendimento. A chave para este método é trabalhar com células saudáveis, manipulá-las com cuidado e atuar de forma eficiente durante o processo de transfeção. Como demonstraremos, este protocolo utiliza a linhagem celular de macrófagos murinos 264.7, que é cultivada conforme descrito no documento complementar.Como preparação para a placa de transfeção INA, semeie as células com 20% de confluência e cultive por um ou dois dias até que as células atinjam no máximo 80% de confluência. É importante lembrar de utilizar células entre a terceira e a décima passagem. Após o descongelamento, inicie este procedimento programando o sistema shuttle de 96 poços que será usado para a transfeção.Para fazer isso, inicie o software do shuttle de 96 poços no computador conectado ao shuttle, a partir do menu de arquivos no canto superior esquerdo. Selecione um novo arquivo de parâmetros. Destaque os poços que serão transfectados no esquema do placa de 96 poços exibido.Uma caixa verde indicará as poças selecionadas. Escolha o programa que corresponde à linhagem celular de macrófago utilizada para as células brutas 2 64 0,7. Escolha DS 1 36, selecione e aplique.Observe que, após selecionar um programa, os poços no esquema da placa serão coloridos. Círculos vazios azul-escuros indicam poços que não foram atribuídos a nenhum programa e que não receberão choque. Em seguida, prepare a solução efetora de trabalho misturando a solução efetora para linha celular SF em placa de 96 poços com todo o conteúdo do tubo de suplemento incluso.Deixe os reagentes misturados equilibrarem à temperatura ambiente. Aqueça o D-M-E-M-R-P-M-I 1640, tripsina 0,25% EDTA e PBS a 37 graus Celsius. Prepare o plasmídeo controle S-I-R-N-A-P max GFP experimental ou siRNAs marcados fluorescentemente descongelando-os no gelo para destacar macrófagos aderentes dos recipientes de cultura celular.Aspire o meio e lave as células duas vezes com 10 mililitros de PBS. Em seguida, após a remoção do PBS, incube as células com um mililitro de tripsina 0,25% EDTA previamente aquecida por placa até que as células comecem a se desprender. Isso leva de um a dois minutos.Toque suavemente na placa e movimente a solução durante a incubação para maximizar a ação da tripsina. Após as células se desanatarem, adicione nove mililitros de DMEM acrescido de FBS, misturando suavemente por pipetagem para cima e para baixo, e então recolha as células por pipetagem em um tubo estéril. Conte o número de macrófagos isolados utilizando um Hema Cytometer.Espera-se cerca de 10 milhões de macrófagos por placa de 10 centímetros. Calcule o número total de macrófagos necessário, considerando que cada poço da placa de 96 poços requer 200.000 células. Pipete o número calculado de células em um tubo de centrífuga.Centrifugue as células por 10 minutos a 150 G à temperatura ambiente em uma placa estéril de 96 poços com fundo redondo, o que facilita a mistura enquanto minimiza a perda de reagentes. Adicione dois microlitros de cada IRNA a cada poço a ser transfectado. Observe que, dependendo do número de siRNAs, isso pode ser realizado durante a etapa de centrifugação dos macrófagos.O aspecto mais difícil deste procedimento é a eletroporação, cujas chaves são tratar as células com muita delicadeza e trabalhar com muita rapidez. Assim que as células estiverem em uma solução de transfeção tóxica, aspire o meio das células centrifugadas e, em seguida, ressuspenda-as suavemente na solução efetora nucleica SF contendo a solução suplemento.Transfira imediatamente as células para uma cuba estéril usando uma pipeta multicanal, transferindo 20 microlitros da mistura celular re-suspensa para cada poço de uma placa de 96 poços contendo os siRNAs, misturando suavemente por pipetagem para cima e para baixo. Em seguida, transfira 20 microlitros da mistura celular INA para a placa de nucleo vete de 96 poços. É fundamental evitar a formação de bolhas durante este passo, pois isso pode induzir erros durante a nucleação.Após posicionar todas as amostras experimentais na placa de transfeção, cubra-a com a tampa fornecida e bata suavemente na superfície dura. Para remover quaisquer bolhas, coloque a placa de 96 poços no suporte 96 poços do nucleo efetor e, no canto inferior direito da tela do programa, selecione carregar e iniciar. Em seguida, siga as instruções do programa para salvar os resultados durante o processo de nucleoefecção nos poços com sucesso.Os poços transfectados serão representados no esquema de 96 poços na tela por um círculo verde com um sinal de adição. Um círculo vermelho com um sinal de subtração indica um erro, provavelmente devido a bolhas ou à pipetagem de um volume incorreto de reagentes imediatamente após a nucleofecção. Utilize uma pipeta multicanal para adicionar 80 microlitros de RPMI 1640 pré-aquecido.Adicione o meio suavemente ao lado de cada poço. Deixe o meio misturar-se lentamente com as células transfectadas, que estão muito delicadas nesta fase. Adicionar o meio muito rapidamente reduzirá drasticamente a viabilidade.Coloque a placa de 96 poços com as amostras transfectadas e o meio RPMI 1640 em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de CO₂ por dois minutos ou mais. É fundamental permitir que as células se recuperem antes de qualquer manipulação adicional. Após remover a placa da incubadora, utilize uma pipeta multicanal para transferir cuidadosamente a mistura de cada poço para uma placa de cultura de tecidos de 96 poços.Em seguida, utilizando a pipeta multicanal, adicione 100 microlitros de DMEM com FBS a cada poço. Incube por 24 a 36 horas e, imediatamente após a transfeção e recuperação, realize citometria de fluxo. Para avaliar a eficiência de transfeção do siRNA marcado com fluoróforo, mais de 99% das células devem estar transfectadas no dia seguinte à transfeção. Para a eficiência de transfeção do plasmídeo GFP, 30 a 50% das células devem expressar GFP. Após a incubação de 24 a 36 horas, prepare o LPS ou outros ativadores da imunidade inata em meio fresco, diluindo o LPS para uma concentração final de 20 nanogramas por mililitro em DMEM com FBS.Em seguida, aspire cuidadosamente o meio da placa de 96 poços e adicione o meio fresco contendo o LPS às células. Coloque a placa em uma incubadora para monitorar a resposta ao LPS ou a outros estimuladores da imunidade inata em diversos momentos após a estimulação. Pipete o sobrenadante das células para uma placa de armazenamento de 96 poços para análise por Eliza.Após remover o sobrenadante para monitorar a viabilidade celular, adicione 100 microlitros de fluoresceína diacetato na proporção de um para 100 em PBS a cada poço e incube à temperatura ambiente por um a cinco minutos. Monitore a fluorescência nas células utilizando um leitor de placas quando clivada por esterases celulares em células vivas. Esse composto torna-se fluorescente para ilustrar a utilidade dessa abordagem para monitorar a resposta imune inata.siRNAs direcionados a genes reguladores imunes inatos conhecidos foram transfetados na linhagem celular de macrófagos RAW 264.7. As células foram então estimuladas com LPS e a produção dos citocinas pró-inflamatórios IL-6 e TNF-α foi monitorada por ELISA, conforme mostrado aqui.Inibição do receptor tipo toll quatro, o receptor para LPS, mas não outros TLRs. Utilizando SIR, observou-se uma produção fortemente reduzida de IL seis e TNF alfa induzida por LPS. Observe que a inibição de IL seis com irna diminuiu a produção de IL seis, mas não afetou a produção de TNF alfa.Esses dados sugerem boa eficácia e boa especificidade do silenciamento mediado por siRNA de reguladores candidatos da imunidade inata. É importante lembrar que a chave para uma boa transfeção e boa recuperação celular é trabalhar com células muito saudáveis, tratá-las com cuidado durante o processo de transfeção e recuperação, e trabalhar rapidamente assim que as células estiverem em uma solução efetora nucleo. Após este procedimento, muitos outros ensaios podem ser realizados, incluindo QPCR para monitorar o silenciamento gênico e diversos outros ensaios para investigar a resposta imune inata.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra um ensaio baseado em células repórter para triagem de nanopartículas bioativas potenciais que inibem a sinalização do receptor do tipo Toll (TLR). O ensaio envolve a introdução de lipopolissacarídeos (LPS) misturados com híbridos de nanopartículas peptídeo-ouro para macrófagos repórteres que expressam as proteínas repórter - fosfatase alcalina embrionária secretada (SEAP) e luciferase. A redução do sinal TLR induzido por LPS mediado pelos híbridos é determinada pela medição...

Um ensaio para rastrear nanopartículas bioativas para inibição de sinalização de receptores do tipo Toll

Nós descrevemos um protocolo para medir a produção de citocinas antiviral em camundongos infectados com um vírus do herpes modelo murino herpesvírus gama 68 (γ HV68) que está intimamente relacionada ao sarcoma-associado herpesvírus de Kaposi humana (SKHV) e vírus Epstein-Barr (EBV). Utilizando linhagens de camundongos geneticamente modificados e fibroblastos de rato embrionárias (MEFs), avaliou-se a produção de citocinas anti-viral in vivo e ex vivo. "Reconstituição" a expressão de componentes...

Dissecando imunitário inatas Sinalização em Evasion Viral da produção de citocinas

Descrevemos aqui um protocolo simples para isolar macrófagos peritoneais murinos. Este procedimento é seguido pela extração de RNA para realizar a análise da expressão gênica após a estimulação de receptores do tipo Toll.

Isolamento de Murino macrófagos peritoniais de Cumprir a análise de expressão gênica Após Toll-like receptors Estimulação

Descrevemos a detecção de ativação de inflammasome NLRP3 em bases celulares usando microscopia de fluorescência e mancha para ativa a caspase-1 e o adaptador, ASC. Um ensaio de liberação de lactato desidrogenase é apresentado para detectar pyroptotic lise em uma base de população. Estas técnicas podem ser adaptadas para estudar muitos aspectos da biologia de inflammasome.

Deteção de ativação de Inflammasome e morte celular de Pyroptotic nos macrófagos da medula óssea-derivado murino

Nós descrevemos um método de usar polyethyleneimine (PEI)-revestido de nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético para macrófagos transfecting com siRNA. Essas nanopartículas podem eficientemente entregar siRNA expressão macrófagos gene-alvo em vitro e in vivo e silêncio.

Nanopartículas de óxido de ferro revestido de Polyethyleneimine como um veículo para a entrega de RNA de interferência pequeno para macrófagos In Vitro e In Vivo

Uma abordagem é descrita para a detecção em tempo real da resposta imune inata de ferimento cutâneo e Staphylococcus aureus infecção de ratos. Por LysM-EGFP comparando os ratos (que possuem fluorescentes neutrófilos) com um LysM-EGFP mestiços cepa de rato imunodeficientes, avançamos nossa compreensão da infecção e o desenvolvimento de abordagens para combater a infecção.

Um modelo do rato para avaliar a resposta imune inata à infecção de Staphylococcus aureus

Macrófagos, especialmente macrófagos primários, são um desafio para transfect como eles se especializam na detecção de moléculas de não-origem auto. Descrevemos um protocolo que permite a transfecção altamente eficiente de macrófagos primários com mRNA gerado a partir de modelos de DNA, como plasmídeos.

Transfecção altamente eficiente de macrófagos primários com mRNA Transcrito in vitro

Para testar o efeito de um quimiocina no recrutamento do macrófago in vivo, a hibridação in situ da montagem inteira foi usada para detectar a expressão ectópica do quimiocina, e a imunomarcação foi usada para etiquetar macrófagos. A imagem latente viva foi usada para a observação tempo real da migração do macrófago.

Um modelo de expressão de Quimiocina ectópica para testar o recrutamento de macrófago in vivo

Este protocolo fornece aos pesquisadores um método rápido e indireto de medição de atividade de fator de transcrição NF-кB/AP-1 dependente de TLR em uma linha de células de macrófagos de urina em resposta a uma variedade de superfícies poliméricas e camadas de proteína adsorbed que modelam o microambiente de implante biomaterial.

Um ensaio celular do repórter do macrófago para examinar a sinalização nf-kB/AP-1 mediada pelo receptor em macrófagos em camadas de proteína adsorbed em superfícies poliméricas

Demonstramos um protocolo passo a passo para a investigação da função gênica em macrófagos residentes no tecido peritoneal in vivo, usando vetores lentivirais.

Preparação de vetor lentiviral para modulação eficiente de genes e microRNAs de macrófagos residentes no tecido da cavidade peritoneal in vivo em camundongos

Aprenda a usar RNA de interferência para investigar a resposta imune inata em macrófagos murinos. Este método permite silenciar genes candidatos e avaliar a produção de citocinas após estimulação com LPS.

Usando RNA-interferência para investigar a imunitário inatas de resposta em macrófagos

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