Análise das reacções de processamento de RNA utilizando células Sistemas gratuitas: 3 'Fim de clivagem de pré-mRNA Substratos In vitro
May 3rd, 2014
RNA polimerase II sintetiza um RNA precursor que se estende para além da extremidade 3 'do ARNm maduro. A fim de o RNA maduro é gerado cotranscriptionally, num local ditada por sequências de RNA, através da actividade de endonuclease do complexo de clivagem. Aqui, detalhamos o método para estudar as reações de clivagem in vitro.
O objetivo geral deste procedimento é examinar com sucesso três clivagens primárias de mRNA in vitro. Isso é feito primeiro fazendo extrato nuclear transcricionalmente ativo de células cultivadas em suspensão. A segunda etapa do procedimento é fazer substratos de RNA marcados com rádio por meio de transcrição in vitro.
O terceiro passo é purificar em gel os substratos de RNA marcados. A etapa final é montar a reação de clivagem, incluindo o extrato nuclear e o substrato de RNA marcado. Em última análise, os resultados podem mostrar três mRNA primário, substratos clivados UNC e produto clivado por meio de eletroforese em gel radioativo vertical.
A demonstração visual deste método é importante, embora seja realizada desde a década de 1980, não é facilmente executada, pois existem muitas etapas específicas ao longo do procedimento que são desafiadoras. Ter células lavadas, peletizadas e prontas para lisagem. Para iniciar este protocolo para o pellet da célula, adicione tampão com DTT fresco.
Adicionar cinco volumes do CPV estimado e utilizar uma pipeta para quebrar o pellet e permitir que a suspensão arrefeça no gelo. Após 10 minutos, gire as células para baixo a quatro graus Celsius em um balde oscilante. Centrifugue aspire cuidadosamente o sobrenadante.
O pellet terá absorvido alguma solução e aumentado de tamanho. Em seguida, adicione um CPV de tampão A e quebre suavemente o pellet com uma ponta de pipeta. Despeje a suspensão em um homogeneizador resfriado e, com cinco a 12 pinceladas, as células
sejam apertadas.Remova uma pequena alíquota, aplique azul trian e verifique as células para determinar a integridade de sua lise. Se necessário, continue homogeneizando as células até que estejam 90% lisadas, mas não exagere. Agora transfira o lisado para um tubo de ultracentrífuga ultra claro.
Registre o volume total e gire-o como feito anteriormente. Aspire o sobrenadante turvo e guarde-o no gelo. E para análise do citosol, tome cuidado para não perturbar o pellet.
Ele contém os núcleos. Em seguida, gire o pellet em alta velocidade por 15 minutos. Remova o pequeno volume de sobrenadante restante e agrupe-o com a coleção de citosol.
Em seguida, determine o volume nuclear do PACT. Adicione um volume equivalente ao buffer C ao pellet. Em seguida, desaloje o pellet usando a pipeta em um homogeneizador limpo.
Use cinco a 10 pinceladas apertadas para resus. Suspenda o pellet. Transferir o homogeneizado para um tubo refrigerado e misturar por inversão durante 30 minutos.
A quatro graus Celsius, uma placa de agitação pode ser usada. Se o volume for grande o suficiente, transfira o lisado para um tubo de ultracentrífuga UltraClear e, a quatro graus Celsius, gire-o para baixo por 30 minutos. Com cerca de 25.000 gs, o sobrenadante é o extrato nuclear.
Seguindo o protocolo de texto, complete a diálise com apenas um micrograma de molde. Preparar a sonda por transcrição in vitro utilizando um kit com um promotor compatível com SP seis ou T sete. Ao carregar a página, use três microlitros de marcador e todos os 25 microlitros da reação para cada substrato de RNA.
Evite também a contaminação cruzada espaçando as faixas de transcrições de tamanho semelhante. Execute o gel de forma que uma sonda de 600 nucleotídeos funcione a 25 watts por cerca de duas horas depois. Para marcar a localização das bandas de gel, ilumine o filme exposto com uma caixa de luz e coloque o gel embrulhado por cima.
Alinhe o marcador automático rad e o marcador exposto no filme. Em seguida, marque os locais das bandas com marcador preto para remover as bandas Desembrulhe o gel. E com uma lâmina limpa, extirpe as seções de banda do gel, transfira cada seção para seu próprio tubo e elua o RNA seguindo os procedimentos padrão.
Depois que todos os reagentes forem preparados, aqueça o RNA marcado a 80 graus Celsius por dois minutos. Em seguida, transfira o RNA para o vórtice de gelo, o 10% PVA, e depois gire-o em alta velocidade por alguns minutos para remover as bolhas e, em seguida, prossiga para fazer as misturas principais para cada reação. Para cada reação, dispense 5,25 microlitros de master mix um.
Em seguida, adicione 6,25 microlitros da mistura de extrato nuclear. Em seguida, adicione um microlitro de substrato de RNA marcado diluído a 50 anos molar ao todo. Cada reação usa menos de cinco RNA marcado com molar ano.
Agora, suavemente vórtice e gire rapidamente as misturas de reação. Deixe a reação ocorrer por até duas horas a 30 graus Celsius. Tomar um curso de tempo da reação fornecerá os melhores resultados Depois de usar a proteinase K para digerir a proteína na reação e, em seguida, purificar a reação Usando o método de clorofórmio fenol, execute os produtos em uma carga de página de 6%, três microlitros de marcador ou cinco microlitros por produto de reação por pista.
Em seguida, execute o gel e depois desmonte cuidadosamente o aparelho de gel. Para coletar o gel, pressione o papel de filtro firmemente contra ele e vire-o. Pressione firmemente o vidro para garantir que o gel esteja totalmente preso ao papel.
Em seguida, retire lentamente o papel de filtro com o gel acoplado. Enrole o lado exposto do gel em plástico e prenda o envoltório no papel de filtro do outro lado. Termine colocando o gel em uma secadora por 15 minutos com o papel de filtro voltado para o aspirador.
Posteriormente, analise o gel expondo-o a um filme ou gerador de imagens de fosfo. O clivado. O substrato de RNA é a banda migratória mais lenta na parte superior do gel.
O produto clivado específico marcado por uma seta em negrito, corre mais rápido no gel no tamanho esperado. Este produto está ausente do controle com uma mutação pontual na sequência do pollier. A quantificação da atividade de clivagem foi determinada com um gráfico métrico DS.
Comparando a proporção de RNA clivado para clivado, normalizado, para o controle de RNA clivado. Após este procedimento, outros métodos, como um ensaio de poliadenilação, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a atividade da poliA polimerase. Este ensaio é feito alterando as condições de reação, como adicionar magnésio e remover EDTA.
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Visão Geral
Este estudo concentra-se no exame da clivagem de três prime mRNA in vitro, um processo crucial na maturação do RNA. O método envolve o uso de extrato nuclear transcricionalmente ativo e substratos de RNA radiomarcados para analisar reações de clivagem.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia do RNA
- Biologia Molecular
- Bioquímica
Fundo
- A RNA polimerase II sintetiza RNA precursor que se estende além da extremidade 3' do mRNA maduro.
- O complexo de clivagem determina o local para geração de RNA maduro.
- Processos cotranscricionais são essenciais para a maturação do RNA.
- Entender as reações de clivagem pode fornecer insights sobre os mecanismos de processamento do RNA.
Objetivo do Estudo
- Examinar a clivagem de três prime mRNA in vitro.
- Compreender o papel dos extratos nucleares no processamento do RNA.
- Analisar os produtos das reações de clivagem usando eletroforese em gel.
Métodos Utilizados
- Preparação de extrato nuclear transcricionalmente ativo a partir de células cultivadas em suspensão.
- Síntese de substratos de RNA radiomarcados via transcrição in vitro.
- Purificação em gel de substratos de RNA marcados.
- Montagem de reações de clivagem com extrato nuclear e substratos de RNA marcados.
Principais Resultados
- Foi observada a clivagem bem-sucedida de substratos de três prime mRNA.
- Os resultados foram analisados através de eletroforese em gel radioativo vertical.
- Substratos UNC clivados e produtos clivados foram identificados.
- A metodologia fornece uma estrutura para estudar reações de clivagem de RNA.
Conclusões
- Este estudo descreve um método confiável para examinar a clivagem de mRNA in vitro.
- Compreender os mecanismos de clivagem pode aprimorar o conhecimento do processamento do RNA.
- Os resultados contribuem para o campo mais amplo da biologia do RNA.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Understanding RNA 3' end processing is critical for target validation in RNA-based therapeutics, where precise transcript maturation influences protein expression levels and functional outcomes. This in vitro cleavage assay enables mechanistic de-risking by isolating the biochemical requirements for accurate pre-mRNA processing, supporting predictive confidence in target engagement. The method provides a quantitative, reproducible system to evaluate how genetic or pharmacological perturbations affect RNA stability and function, informing early discovery decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of RNA processing mechanisms to validate transcript-specific targets involved in gene expression regulation.
- Operational Value: Provides a controlled system to assess how mutations in polyadenylation signals affect cleavage efficiency and RNA stability.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative readouts of cleavage products to support assay standardization for screening modulators of RNA processing factors.
- Operational Value: Uses gel-based detection to ensure reproducibility and scalability across multiple RNA substrates and experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant modeling by linking RNA processing defects to aberrant transcript isoforms observed in pathological states.
- Operational Value: Enables continuity from mechanistic discovery to preclinical validation by defining biochemical thresholds for functional RNA maturation.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery continuum, where RNA target validation precedes lead identification and preclinical evaluation by clarifying the functional impact of transcript processing on protein output.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of RNA regulatory elements and mechanistic de-risking of targets involved in mRNA maturation.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized substrate preparation and quantitative product detection via gel electrophoresis.
- Analytics: Enables comparison of cleavage efficiency across conditions using normalized product-to-substrate ratios for data-driven target prioritization.
- Translational Research: Connects to preclinical work by defining processing competence as a biomarker for RNA-based therapeutic suitability.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for evaluating RNA-targeting modalities across multiple programs and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in RNA target validation by reducing ambiguity in transcript processing mechanisms.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized nuclear extract preparation and labeled substrate quantification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking RNA processing fidelity to expected protein expression and functional outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by identifying targets with robust, regulatable RNA maturation profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, RNA biochemistry, and radioactive labeling techniques.
- Dependent on ultracentrifugation, gel electrophoresis, and autoradiography infrastructure for nuclear extract preparation and product detection.
- Necessitates cross-team standardization of substrate design, reaction conditions, and quantification methods to ensure comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the assay to diverse RNA substrates or disease-relevant systems.
- Limited by the technical complexity of nuclear extract isolation and the need for careful optimization to avoid nonspecific degradation.
