Name: Isolamento de CA1 Nucleares frações enriquecidas de fatias do hipocampo para o Estudo de dependentes de Atividade Nuclear Importação de Mensageiro Proteínas Synapto nucleares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Aprenda a isolar frações nucleares enriquecidas da região CA1 do hipocampo após indução de LTP em fatias agudas de ratos. Este método permite estudar o transporte de proteínas sinaptonucleares dependente de atividade em modelos de aprendizagem e memória.

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Este trabalho foi financiado pela DFG (SFB 779 TPB8, Kr1879/3-1 MRK), bolsa DIP (MRK), EU FP7 MC-ITN NPlast (MRK), Centro de Ciências Comportamentais do Cérebro (CBBS, Sahsen-Anhalt), (AK e SB), MM é um beneficiário da Bolsa de Longo Prazo da Organização Europeia de Biologia Molecular (EMBO) (EMBO ALTF 884-2011) e Marie-Curie IEF.

1 Preparação de Agudo fatias do hipocampo de ratos adultos Cérebro <ol><li> Anestesiar ratos com isoflurano. ATENÇÃO: Execute o procedimento usando um exsicador fechado, não inalar o isoflurano. Certifique-se de que o animal está completamente anestesiado. </li><li> Decapitar os ratos, isolar rapidamente o cérebro, e mergulhá-lo num precarbonated (95% de O2 / 5% 2 mistura de gás de CO) gelada solução de Gey (composição em mM: 130 de NaCl, 4,9 de KCl, 1,5 de CaCl 2 2H 2 O , 0,3 MgSO 4 2H 2 O, 11 de MgCl2 · 6H 2 O, 0,23 KH 2 PO 4, 0,8 de Na 2 HPO 4 · 7H 2 O, 5 de glucose-H2O, 25 HEPES, 22 de NaHCO3, pH 7,32) durante 30 min 1,2,10,16. </li><li> Remover o cerebelo e parte do córtex entorrinal. Separe os hemisférios corticais com um corte médio-sagital, em seguida, coloque cada hemisfério para baixo em sua superfície medial. A partir de então fazerum corte de 50-70 ° (50-70 ° transversal) ao longo da superfície dorsal de cada hemisfério 13,14. </li><li> Cole cada hemisfério com a superfície recém-cortada na plataforma de corte do sistema de corte. A plataforma deve ser coberto por solução precarbogenated de Gey gelada. </li><li> Cortar 350um 50-70 ° fatias transversais de anterior para posterior lateral usando um vibratome ajustado para minimizar a oscilação do eixo z. A formação do hipocampo, córtex entorrinal e subicular, bem como os córtices que estão localizados no hipocampo dorsolateral fará parte das fatias utilizados para experiências 13,14. </li><li> Transferir as fatias de hipocampo de uma forma de U e submerso tipo incubadora e incubar durante pelo menos 2 horas a 32 ° C com carbogenated fluido cerebroespinal artificial (ACSF contendo em mM: 110 de NaCl, 2,5 de KCl, 2,5 de CaCl2 2H 2 O, 1,5 MgSO 4 2H 2 O, 1,24 KH 2 PO 4, 10 Glicose · H 2S, 27,4 NaHCO3, pH 7,3) 1,2,10,16. </li></ol> 2. posicionamento dos eletrodos, Base de gravação, e indução de LTP <ol><li> Transferir a fatia de hipocampo de uma câmara de registo tipo submerso montado sob um microscópio. Perfundir (6-7 ml / min) com ACSF carbogenated durante pelo menos 30 min a 32 ° C. </li><li> Prepare microeletrodos capilares de vidro cheios de ACSF (resistência de ponta é de 3-5 mohms). </li><li> Coloque um microeléctrodos de vidro cheios com ACSF nas fibras Schaffer-CA1 colaterais para a estimulação e na radiatum CA1 estrato fEPSP gravação 1,2,10 (Figura 2). A distância entre os eléctrodos deve ser de cerca de 300 um. </li><li> Potenciais campo excitatórios pós-sinápticos (fEPSPs) evocar por estimulação das fibras Schaffer-colaterais com impulsos de corrente bifásica rectangulares (200 ms / polaridade) em uma gama de 3-4 V. </li><li> Realizar o teste máximo de estimulação através da medição do INPrelação ut-saída e definir a força de estimulação, como 40% dos valores máximos fEPSP-inclinação obtidos e mantê-la constante durante todo o experimento. </li><li> Comece a gravação da linha de base durante pelo menos 15 minutos após o teste de estimulação máxima. Medem-se as respostas a estímulos testar cada minuto durante todo o experimento. Realize gravações iniciais com estimulação de baixa freqüência. </li><li> Gravar a linha de base durante pelo menos 30 min. </li><li> Para indução Late-LTP aplicar de alta freqüência de 100 Hz tetanização que consiste em três trens de estímulo 1 seg a 100 Hz com um intervalo de 5 min intertrain. Para aumentar o campo de estimulação dentro região CA1 5 uM bicuculina pode ser lavada em 2 min antes de tetanização e deve ser lavada imediatamente após a última tetanização. </li></ol> 3 Coleção de fatias após a indução da LTP e snap Congelamento <ol><li> Parar LTP gravação 2 min ou 30 min depois de três trens de estimulação tetânica induzindo Late-LTP. </li><li&gt; Retirar os eléctrodos e rapidamente transferir a fatia em uma plataforma metálica precold colocada em gelo seco. Repita o procedimento para uma fatia de controle mantidos em incubadora em forma de U. CUIDADO: Use luvas ao trabalhar com gelo seco. </li><li> Recolhe cada fatia num tubo de 1,5 ml e armazenar a -80 ° C. </li></ol> 4 Isolamento de fracções nucleares enriquecidos a partir da região CA1 do hipocampo <ol><li> Tome 1,5 ml Eppendorf tubos com as fatias congeladas entre -80 ° C e mantê-los no gelo. </li><li> Adicionar 0,5 ml de tampão contendo a protease fresca fria TBS (PI) e inibidores de fosfatase (PS), para dentro do tubo. Incubar por 2-3 min e transferir para um microscópio estereoscópico. CUIDADO: Use luvas de proteção e um jaleco, enquanto trabalhava com PI e PS. </li><li> Dissecar região pyramidale CA1 do hipocampo estrato usando duas agulhas. Use uma agulha para a realização da fatia, ao microscópio estereoscópico ea segunda agulha para cortar a área de CA1. </li><li> Recolher o CA dissecadaUma região de 5 fatias (para cada grupo) para um novo tubo de 1,5 ml contendo 50 ul de tampão de lise (1x tampão de lise hipotónico contendo em mM: 10 HEPES, 1,5 de MgCl2, 10 KCl, pH 7,9, com IP e PS). Note-se que esta quantidade de material vai ser suficiente para executar 2-3 immunoblots. </li><li> Homogeneizar o tecido coletado por pipetagem up cuidadoso e para baixo. Usar uma pipeta de 200 uL. Incubar o ligado em gelo durante 5-7 minutos para permitir que as células inchar. </li><li> Tome 2 mL do lisado, cair sobre uma lâmina de microscópio, e visualizar o inchaço das células em um microscópio de campo claro. Com inchaço adequada das células dos núcleos aparecem como rodada estruturas intactas. </li><li> Recolha 20 ul de amostra para um novo tubo de 1,5 mL como &quot;fracção de homogenato. Adicionar 8 mL de tampão de desnaturação da amostra 4x SDS. </li><li> Centrifugar os lisados ​​restantes em 11.000 rpm durante 1 min. </li><li> Recolher cuidadosamente o sobrenadante a partir do topo (&#39;fracção citosólica&#39;), transfer para um novo tubo e adicionar 20 ul de tampão de amostra 4x. </li><li> Ressuspender o sedimento em 60 mL de tampão hipotónico e adicionar 20 ul de tampão de amostra 4x. Esta fracção é referido como uma &quot;fracção enriquecida nuclear&quot;. </li><li> Homogeneizado, citosólica, e fracções enriquecidas nucleares podem ser armazenadas a -20 ° C ou -80 ° C para posterior immunoblotting. </li></ol> 5. Immunoblotting semiquantitativa de proteínas nucleares Synapto <ol><li> Descongelar as amostras e ferve-las durante 5 min a 95 ° C. </li><li> Tirar 5 ul de cada fracção e determinar a concentração de proteína pelo teste de amido preto ou o teste de BCA. </li><li> Carga igual quantidade de amostras de proteína a partir de homogeneizado, fracções enriquecidas citoplasmáticos e nucleares em SDS-PAGE. As amostras de controle e fatias LTP deve ser colocado no mesmo gel para comparação direta. </li><li> Executar um procedimento de western-blot padrão (transferência molhado é recomendado). </li><li> Sondar as membranas com tque o anticorpo de escolha. Posteriormente as mesmas manchas (ou mesmas amostras são executados em paralelo) pode ser sondado com uma citoplasmática marcador - enolase2 neurônio específico (NSE2) e marcador nuclear - NeuN e um anticorpo actina como controle de carga. </li></ol> Análise de Dados 6. <ol><li> A eficiência de indução da LTP pode ser analisada pelo software Clampfit. A inclinação média de gravações de base foi comparado com as pistas após tetanização usando two-way ANOVA, p &lt;0,05 foi considerado significativamente diferente. Os valores de declive fEPSP foram representados em diagramas como a média ± SEM </li><li> Para a quantificação de immunoblots, digitalizar o filme de auto-radiografia e analisar a densidade integrada de bandas de proteínas por ImageJ ou bandas de fluorescência com um sistema de Licor. Valores de bandas imunorreactivas deve ser normalizada para o controle de carregamento e absorvente. Para a comparação dos grupos controle e LTP um nonparametrical Mann-Whitney U-teste pode ser usado. </li></ol><table border="0"cellpadding = &quot;0&quot; cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> Nome do buffer </td><td> Reagente </td><td> Concentração (mM) </td><td> Valor </td><td> Comentários / Descrição </td></tr><tr><td> Solução de Gey (pH: 7,3 ~ 7,4) </td><td> NaCl </td><td> 130 </td><td> 7,6 g </td><td> filtração estéril </td></tr><tr><td> 1000 ml </td><td> KCl </td><td> 4.9 </td><td> 0,37 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> CaCl 2 2H 2 O </td><td> 1.5 </td><td> 0,22 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> MgSO 4 2H 2 O </td><td> 0,3 </td><td> 0,0739 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> MgCl2 · 6H 2 O </td><td> 11 </td><td> 2,24 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> KH 2 PO 4 </td><td> 0,23 </td><td> 0,0313 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Na 2 HPO 4 · 7H 2 O </td><td> 0,8 </td><td> 0,2145 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Glicose · H2O </td><td> 5 </td><td> 0,9909 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> HEPES </td><td> 25 </td><td> 5,96 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> NaHCO3 </td><td> 22 </td><td> 1,85 g </td><td></td></tr><tr><td> ACSF (pH: 7,3 ~ 7,4) </td><td> NaCl </td><td> 110 </td><td> 6,428 g </td><td> filtração estéril </td></tr><tr><td> 1000 ml </td><td> KCl </td><td> 2,5 </td><td> 0,1865 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> CaCl 2 2H 2 O </td><td> 2,5 </td><td> 0,368 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> MgSO 4 2H 2 O </td><td> 1.5 </td><td> 0.370 g </td&gt; <td></td></tr><tr><td></td><td> KH 2 PO 4 </td><td> 1,24 </td><td> 0,169 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Glicose · H2O </td><td> 10 </td><td> 1,9817 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> NaHCO3 </td><td> 27.4 </td><td> 2,3 g </td><td></td></tr><tr><td> 1x tampão hipotónico (pH: 7.9) </td><td> HEPES </td><td> 10 </td><td> 0,23 g </td><td></td></tr><tr><td> 100 ml </td><td> MgCl2 · 6H 2 O </td><td> 1.5 </td><td> 0,0304 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> KCl </td><td> 10 </td><td> 0,07455 g </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1 Os tampões.

<ol><li>Behnisch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+translocation+of+Jacob+in+hippocampal+neurons+after+stimuli+inducing+long-term+potentiation+but+not+long-term+depression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Nuclear translocation of Jacob in hippocampal neurons after stimuli inducing long-term potentiation but not long-term depression.</a> PLoS One. 6 (2), e17276(2011).</li>
<li>Cai, F., Frey, J. U., Sanna, P. P., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+degradation+by+the+proteasome+is+required+for+synaptic+tagging+and+the+heterosynaptic+stabilization+of+hippocampal+late-phase+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protein degradation by the proteasome is required for synaptic tagging and the heterosynaptic stabilization of hippocampal late-phase long-term potentiation.</a> Neuroscience. 169 (4), 1520-1526 (2010).</li>
<li>Chapman, C. A., Perez, Y., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+GABA%28A%29+inhibition+on+the+expression+of+long-term+potentiation+in+CA1+pyramidal+cells+are+dependent+on+tetanization+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Effects of GABA(A) inhibition on the expression of long-term potentiation in CA1 pyramidal cells are dependent on tetanization parameters.</a> Hippocampus. 8 (3), 289-298 (1998).</li>
<li>Ch'ng, T. H., Uzgil, B., Lin, P., Avliyakulov, N. K., O'Dell, T. J., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+transport+of+the+transcriptional+coactivator+CRTC1+from+synapse+to+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent transport of the transcriptional coactivator CRTC1 from synapse to nucleus.</a> Cell. 150 (1), 207-221 (2012).</li>
<li>Dieterich, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caldendrin-Jacob%3A+a+protein+liaison+that+couples+NMDA+receptor+signalling+to+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Caldendrin-Jacob: a protein liaison that couples NMDA receptor signalling to the nucleus.</a> PLoS Biol. 6 (2), e34(2008).</li>
<li>Fainzilber, M., Budnik, V., Segal, R. A., Kreutz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+synapse+to+nucleus+and+back+again--communication+over+distance+within+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">From synapse to nucleus and back again--communication over distance within neurons.</a> J. Neurosci. 31 (45), 16045-16048 (2011).</li>
<li>Hardingham, G. E., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+versus+extrasynaptic+NMDA+receptor+signalling%3A+implications+for+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic versus extrasynaptic NMDA receptor signalling: implications for neurodegenerative disorders.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11 (10), 682-696 (2010).</li>
<li>Ivanov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+role+of+synaptic+and+extrasynaptic+NMDA+receptors+in+regulation+of+the+extracellular+signal-regulated+kinases+%28ERK%29+activity+in+cultured+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Opposing role of synaptic and extrasynaptic NMDA receptors in regulation of the extracellular signal-regulated kinases (ERK) activity in cultured rat hippocampal neurons.</a> J. Physiol. 57, 789-798 (2006).</li>
<li>Jordan, B. A., Kreutz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleocytoplasmic+protein+shuttling%3A+the+direct+route+in+synapse-to-nucleus+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nucleocytoplasmic protein shuttling: the direct route in synapse-to-nucleus signaling.</a> Trends Neurosci. 32 (7), 392-401 (2009).</li>
<li>Karpova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+and+transducing+the+synaptic+or+extrasynaptic+origin+of+NMDA+receptor+signals+to+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus.</a> Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).</li>
<li>Kim, M. J., Dunah, A. W., Wang, Y. T., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+NR2A-+and+NR2B-containing+NMDA+receptors+in+Ras-ERK+signaling+and+AMPA+receptor+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Differential roles of NR2A- and NR2B-containing NMDA receptors in Ras-ERK signaling and AMPA receptor trafficking.</a> Neuron. 46, 745-760 (2005).</li>
<li>Lai, K. O., Zhao, Y., Ch'ng, T. H., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importin-mediated+retrograde+transport+of+CREB2+from+distal+processes+to+the+nucleus+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Importin-mediated retrograde transport of CREB2 from distal processes to the nucleus in neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (44), 17175-17180 (2008).</li>
<li>Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LTP+in+cultured+hippocampal-entorhinal+cortex+slices+from+young+adult+%28P25-30%29+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats.</a> J. Neurosci. Methods. 130 (1), 19-32 (2003).</li>
<li>Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+activity-dependent+cyclic+AMP-responsive+element-binding+protein+phosphorylation+during+long-lasting+long-term+potentiation+in+area+CA1+of+mature+rat+hippocampal-organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of activity-dependent cyclic AMP-responsive element-binding protein phosphorylation during long-lasting long-term potentiation in area CA1 of mature rat hippocampal-organotypic cultures.</a> Neuroscience. 131 (3), 601-610 (2005).</li>
<li>Perlson, E., Hanz, S., Ben-Yaakov, K., Segal-Ruder, Y., Seger, R., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vimentin-dependent+spatial+translocation+of+an+activated+MAP+kinase+in+injured+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Vimentin-dependent spatial translocation of an activated MAP kinase in injured nerve.</a> Neuron. 45 (5), 715-726 (2005).</li>
<li>Xiang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+maintenance+of+mature+hippocampal+slices+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro.</a> J. Neurosci. Methods. 98 (2), 145-154 (2000).</li>
<li>Zhao, M., Adams, J. P., Dudek, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern-dependent+role+of+NMDA+receptors+in+actin+potential+generation%3A+consequences+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pattern-dependent role of NMDA receptors in actin potential generation: consequences on extracellular signal-regulated kinase activation.</a> J. Neurosci. 25 (30), 7032-7039 (2005).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Os passos descritos no protocolo acima fornecer orientações como preparar hipocampo aguda fatias de ratos jovens ou adultos, induzir e registro LTP, dissecar rapidamente área estimulada de fatia, e preparar fração enriquecida nuclear para estudar a atividade dinâmica de proteínas dependentes. Esta abordagem resulta da combinação de vários métodos diferentes utilizados independentemente um do outro. Nós otimizamos um fluxo de trabalho e fornecer detalhes suficientes para o iniciante a criar as suas próprias experiências ...

Synaptic N-metil-D-aspartato-receptores (NMDAR) desempenham um papel crucial na plasticidade sináptica e a sobrevivência das células de sinalização enquanto a activação de NMDAR extrasynaptic pode provocar neurodegeneração e morte celular. Essas mudanças dependem de expressão rigidamente controlado gene dependente / atividade regulamentada e, portanto, requerem uma comunicação constante entre sinapses ativadas ou dendritos e do núcleo 7. O MAP-quinases ERK1 / 2 são efectores a jusante de sinalização de NMDAR sinápticas e são envolvidos na expressão de genes induzidos por NMDAR-activação, enquanto que a sinalização através de NMDAR extrasynaptic não tem ou tem um efeito inibidor sobre a ERK1 / 2 atividade 8,11. Há um número de proteínas que têm sido mostrados para transporte entre dendritos distais e do núcleo. Muitas destas proteínas conter um sinal de localização nuclear e são activamente transportados ao longo de microtúbulos em uma maneira dependente da dineína e-importin 6,9 para o núcleo. Interestingly, alguns destes mensageiros trânsito apenas para o núcleo, em resposta a estímulos específicos sinápticos. Por exemplo, o transporte retrógrado de elemento de resposta cíclica AMP ligação às proteínas 2 (CREB2) é induzida por LTD química, mas não LTP 12. Localizada estimulação sináptica dependente de NMDAR impulsiona coactivador de transcrição regulada de CREB (CRTC1) para o núcleo, um processo de translocação, que está envolvida na plasticidade do hipocampo a longo prazo 4. Foi demonstrado recentemente que o mensageiro proteína Jacob transloca para o núcleo após tanto, a activação sináptica e extrasynaptic NMDAR e regula CREB gene dependente de transcrição 5. A origem sináptica ou extrasynaptic do sinal é codificado em uma modificação pós-tradução de Jacob. Actividade sináptica induz ERK1 / 2 dependente da fosforilação de serina-Jacob numa cruciais na posição 180 (pJacobS 180), que é um requisito necessário para a subsequente translocação para o núcleo, em cultura primária do hipocampo. Além disso, in neurônios CA1 de fatias de hipocampo agudas pJacobS 180 transloca para o núcleo após Schaffer garantia LTP mas não LTD 1,10. PS180 Jacob leva a um aumento da expressão de genes relacionados com a plasticidade e a expressão do gene realimenta a função sináptica. Em nítido contraste, Jacob que transloca para o núcleo após a ativação NMDAR extrasynaptic não é fosforilada na Ser180 e pode estar associada a diferentes complexos proteína no núcleo causando &#39;CREB desligado&#39; e uma retração de contatos sinápticos 10. A maioria dos estudos publicados sobre a importação nuclear de synapto-nuclear mensageiro proteína ter sido feito em culturas primárias de neurônios dissociados. Por isso, seria interessante ver se esses resultados podem ser reproduzidos em fisiologicamente mais relevante condições usando fatias de hipocampo onde a conectividade e função neuronal são muito mais bem preservado. Aqui apresentamos um protocolo otimizado para avaliação LTP-dependent translocação nuclear de mensageiros proteicos por imunotransferência. Este método também é adequado para a análise da actividade de fosforilação de proteínas dependentes de uma fracção nuclear em bruto. Especificamente, o protocolo atual envolve a preparação de fatias aguda CA1 do hipocampo, indução e gravação de LTP. Em seguida, a região CA1 é microscopicamente dissecados para isolar a região estimulada. Nós combinamos e modificou o protocolo para o isolamento nuclear fornecido pela CellLytic nuclear Extraction Kit com alterações introduzidas pela Zhao e seus colegas 17. O procedimento optimizado inclui a lise das regiões CA1 dissecados em tampão hipotónico permitindo inchaço celular e a libertação de núcleos. A lise celular e morfologia de núcleos pode ser determinado por exame microscópico. Enriquecimento nuclear é conseguida por um passo de centrifugação curta. Immunoblotting análise com anticorpos contra NeuN e NSE2, marcadores específicos de fracções nucleares ou citosólicas, indica que esta abordagem pode ser usada como um rápidoe protocolo reprodutível para isolar essas frações subcelulares e estudar modificações pós-tradução muito instáveis, como a fosforilação de proteínas. Além disso, este método é vantajoso para pequenas amostras de tecido derivadas de regiões CA1 dissecados de fatias do hipocampo e pode ser usado em combinação com imuno-histoquímica de fatias do hipocampo.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>CED 1401 AD/DA converter</td><td>Cambridge Electronics Design, UK</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>a href="http://www.iciba.com/stereomicroscope">Stereomicroscope</a></td><td>Leica S4E, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibrotome</td><td>Leica VT1000S, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estimulador de pulso isolado</td><td>A-M Sistemas, EUA</td><td></td><td>Modelo 2100</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema SDS-PAGE</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cooler</td><td>Julabo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de campo brilhante</td><td>Nikon Eclipse TS100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultura de células</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Luigs & Neumann, SM-5, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmara de mancha e fornecedor de energia elétrica</td><td>Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmara de gravação do tipo submerso</td><td>em</td><td></td><td></td></tr><tr><td>forma de U feito sob medida e incubadora do tipo submerso&nbsp;</td><td>Tesoura cirúrgica pequena feita sob medida</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espátula</td><td></td><td></td><td></td>fina</tr><tr>Pipeta <td></td><td></td><td></td><td>de plástico Pasteur Prato</td></tr><tr><td></td> de cultura de plástico&nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr> <tr><td>de Bunsen</td><td></td><td></td><td></td></tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>Art.-Nr.3957.1</td><td>&ge; 99,5%, p.a., ACS, ISO</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Roth</td><td>Art.-Nr.6781.1</td><td>&ge; 99,5%, a.a., ACS, ISO</td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Merck</td><td>1.02382.0500</td><td>pro análise</td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 2H2O</td><td>Merck</td><td>5886.05</td><td>pro análise</td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H2O</td><td>Aplicação</td><td>CAS-NO: 7791-18-6; EC-NO: 2320946</td><td>para biologia molecular</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>12034.025</td><td>para biologia molecular</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 2H2O</td><td>Merck</td><td>1.06574.1000</td><td>extra pure</td></tr><tr><td>Glucose&middot; H2O</td><td>Roth</td><td>Art.-Nr.6887.1</td><td>para biologia molecular</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Roth</td><td>Art.-Nr.9105.4</td><td>PUFFERAN, &ge; 99,5%, a.a.</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck</td><td>1.06329.1000</td><td>pro análise</td></tr><tr><td>Coquetel de inibidores de protease</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphostop</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bicuculline</td><td>Tocris Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Anticorpos</td></tr><tr><td>Anticorpos primários</td><td>Número de catálogo da</td><td>empresa</td><td>Espécie</td></tr><tr><td>pJac-s180</td><td>Biogenes</td><td></td><td>coelho (diluído 1:100)</td></tr><tr><td>NeuN</td><td>Milipore</td><td>MAB377</td><td>camundongo (diluído 1:1.000)</td></tr><tr><td>NSE</td><td>Cell Signaling</td><td>D20H2</td><td>coelho (diluído 1:1.000)</td></tr><tr><td>Beta-actina</td><td>Sigma</td><td>A-5441</td><td>camundongo (diluído 1:5.000)</td></tr><tr><td>Anticorpos secundários</td><td>Número de catálogo</td><td></td> <td>da empresa</td></tr><tr><td>Espécie IgG HRP conjugado</td><td>DAKO</td><td></td><td>cabra anti-rato (1:5,000)</td></tr><tr><td>IgG HRP conjugado</td><td>NEB</td><td></td><td>cabra anti-coelho (1:5,000)</td></tr></tbody></table>

isolamento de ca1 nucleares frações enriquecidas de fatias do hipocampo para o estudo de dependentes de atividade nuclear importação de mensageiro proteínas synapto nucleares

Isolation of CA1 Nuclear Enriched Fractions from Hippocampal Slices to Study Activity-dependent Nuclear Import of Synapto-nuclear Messenger Proteins

Estudar expressão atividade da proteína dependente, translocação subcelular, ou fosforilação é essencial para compreender os mecanismos celulares subjacentes à plasticidade sináptica. A potenciação de longa duração (LTP) e depressão a longo prazo (LTD) induzida em fatias de hipocampo agudas são amplamente aceites como modelos celulares de aprendizagem e memória. Existem inúmeros estudos que utilizam abordagens de imagiologia celular ou imunohistoquímica ao vivo para visualizar a atividade dinâmica de proteínas dependentes. No entanto, estes métodos dependem da adequação de anticorpos para imunocitoquímica ou superexpressão de proteínas marcadas com fluorescência em neurônios individuais. Immunoblotting de proteínas é um método alternativo que oferece confirmação independente dos resultados. O primeiro factor limitativo na preparação de fracções subcelulares de fatias de hipocampo tetanized individuais é a baixa quantidade de material. Em segundo lugar, o procedimento de tratamento é fundamental, porque manipulações muito curtos e menores de lumprir fatias pode induzir a ativação de algumas cascatas de sinalização. Aqui, descrevemos um processo de produção optimizado, a fim de obter uma quantidade suficiente de uma fracção enriquecida nuclear de pureza suficiente da região CA1 do hipocampo agudas fatias de cérebro de rato. Como um exemplo representativo, mostra-se que a ERK1 / 2 forma fosforilada da proteína mensageira synapto nuclear Jacob activamente transloca para o núcleo mediante indução da LTP e pode ser detectada numa fracção enriquecida nuclear de neurónios CA1.

Nós já anteriormente demonstrado que a proteína mensageira synapto nuclear Jacob acumula no núcleo após a indução da LTP, mas não LTD 1. Além disso, a translocação de Jacob após estimulação sináptica requer a activação de MAPK ERK1 / 2 e a fosforilação de Jacob em Ser180 (Figura 1). Fosforilada Jacob transloca para o núcleo de uma forma dependente da importin e o estado fosforilado pode ser conservada durante períodos de tempo prolongados, por associação com o filamento intermediário αinterne...

Nós fornecer um protocolo detalhado para a indução de potenciação de longo prazo na região CA1 do hipocampo e o subsequente isolamento de fracções enriquecidas nucleares da área tetanized da fatia. Esta abordagem pode ser utilizada para determinar a actividade da importação nuclear de proteína dependente em modelos celulares de aprendizagem e memória.

Isolamento de CA1 Nucleares frações enriquecidas de fatias do hipocampo para o Estudo de dependentes de Atividade Nuclear Importação de Mensageiro Proteínas Synapto nucleares

Studying activity dependent protein expression, subcellular translocation, or phosphorylation is essential to understand the underlying cellular ...

O objetivo geral deste experimento é estudar o transporte nucleocitoplasm�tico dependente de atividade de proteínas utilizando fatias hipocampais agudas, nas quais a conectividade e a função neuronais são bem preservadas. Para alcançar esse objetivo, o hipocampo de um rato adulto macho é primeiramente isolado e fatias transversais agudas são preparadas como segundo passo. As fatias hipocampais são transferidas para a câmara de registro e a forma tardia de potenciação de longa duração (LTP) é induzida na camada radiata do CA1. Em seguida, as fatias potencializadas e as de controle são congeladas rapidamente, e as regiões do CA1 estimuladas são dissecadas com o intuito de isolar a fração enriquecida em núcleo para análise posterior por imunoblot.Resultados baseados na análise por western blot mostram diferenças nos níveis de fosfoproteínas nucleares entre os cortes potencializados e os controles 30 minutos após a indução da PTL. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades por dois motivos. Primeiro, a pequena quantidade de amostra tecidual, e segundo, o intervalo crítico necessário para a lise das amostras no tampão de lise hipotônico, permitindo a liberação dos núcleos. A demonstração visual deste método é essencial, pois o preparo vital do hipocampo e o isolamento da região C um exigem dissecações rápidas e muito precisas, mas existem alguns truques.Para facilitar, seria necessário seguir tanto as instruções escritas quanto as instruções visualizadas para o preparo da fração enriquecida em núcleos da área C um do hipocampo. A demonstração do procedimento será realizada pelo Laboratório Pinon Postal. Ela mostrará como preparar a lisado agudo do hipocampo e induzir a PTL.Após a dissecação da região C, um aluno de graduação do nosso laboratório, Berra G, mostrará como isolar o núcleo e a destruição. Inicie este procedimento isolando o cérebro de rato e mergulhando-o na solução gelada de gás pré-carbonatada. Em seguida, remova o cerebelo e parte do córtex entorinal.Seccione os hemisférios corticais com um corte sagital mediano. Em seguida, faça um corte de 50 a 70 graus ao longo da borda dorsal de cada hemisfério. Depois, posicione cada hemisfério com sua superfície medial voltada para baixo e fixe cada hemisfério com a superfície recém-cortada sobre a plataforma de corte do vibrátomo.Posteriormente, cubra a plataforma com a solução gaseificada pré-carbogenada gelada. Corte fatias de 350 micrômetros contendo a formação hipocampal, o córtex subular e o córtex entorinal do lado anterior ao posterior com o vibrosserrote. Em seguida, transfira as fatias para um incubador submerso do tipo em formato de U e incube-as por pelo menos duas horas a 32 graus Celsius com CSF carbogenado.Agora transfira uma fatia de hipocampo para a câmara de gravação do tipo submersa montada sob um microscópio. Perfunda a fatia com A CSF carbonatada a seis mililitros por minuto durante pelo menos 30 minutos a 32 graus Celsius. Após 30 minutos, preencha os microeletrodos de capilar de vidro com A CSF.Coloque um microeletrodo no colateral de Schaefer do CA1 para estimulação e outro no estrato radiatum do CA1 para gravação de EPSPs de campo, com uma distância de 300 micrômetros entre eles. Em seguida, evoque os EPSPs de campo aplicando pulsos de corrente retangulares fásicos de três a quatro volts às fibras colaterais de Schaefer. Realize o teste de estimulação máxima medindo a relação entrada-saída e defina a intensidade de estimulação como 40% do valor máximo da inclinação dos EPSPs de campo.Em seguida, registre a linha de base por pelo menos 15 minutos, medindo as respostas aos estímulos-teste a cada minuto durante todo o experimento. Para induzir a PLP tardia, aplique estimulação de alta frequência para aumentar os PEPS de campo evocados em uma região do hipocampo. Adicione cinco micromolares de COE ao LCR artificial dois minutos antes da tetanização e lave imediatamente após a última tetanização.Interrompa a gravação. Dois minutos ou 30 minutos após a indução da LTP tardia, remova os eletrodos e transfira rapidamente a lâmina para uma plataforma metálica pré-resfriada colocada sobre gelo seco. Em seguida, colete cada lâmina em um tubo Eppendorf de 1,5 mililitro e armazene a menos 80 graus Celsius.Nesta etapa, retire os cortes congelados do freezer a menos 80 graus Celsius e mantenha-os sobre gelo. Adicione 0,5 mililitros de tampão TBS fresco e frio contendo inibidores de protease e fosfatase ao tubo. Incube-os por dois a três minutos antes de transferir para um microscópio estereoscópico.Em seguida, dissecione a região do estrato pyramidale do CA1 do hipocampo segurando a fatia com uma agulha e cortando a área do CA1 com a outra. Posteriormente, colete as regiões do CA1 dissecadas de cinco fatias por grupo em um novo tubo de 1,0 mililitro contendo 50 microlitros de tampão de lise. Em seguida, homogeneíze os tecidos coletados pipetando cuidadosamente para cima e para baixo com uma pipeta de 200 microlitros.Incube o lisado no gelo durante cinco a sete minutos para permitir o inchamento das células. Em seguida, retire dois microlitros do lisado e coloque-os em uma lâmina de microscopia. Visualize o inchamento das células em um microscópio de campo claro.Os núcleos aparecem como estruturas redondas e intactas com inchaço adequado. Agora, colete 20 microlitros da amostra em um novo tubo de 1,5 mililitro como a fração homogeneizada. Adicione oito microlitros de tampão amostral SDS 4X desnaturante.Em seguida, centrifugue o lisado remanescente a 1100 RCF durante um minuto. Após um minuto, colete cuidadosamente o sobrenadante do topo e transfira-o para um novo tubo. Posteriormente, adicione 20 microlitros de tampão amostra quatro x.Em seguida, ressuspenda o precipitado em 60 microlitros de tampão hipotônico e adicione 20 microlitros de tampão amostral quatro x. Esta fração é denominada fração enriquecida em núcleos. Armazene o homogeneizado, as frações citosólica e enriquecida em núcleos a 20 graus Celsius negativos ou 80 graus Celsius negativos.Para posterior imunomarcção nesta etapa, descongele as amostras e ferva-as por cinco minutos a 95 graus Celsius antes de medir a concentração proteica pelo teste AM mito black ou teste BCA. Carregue uma quantidade igual de amostras proteicas provenientes das frações homogenizada, citoplasmática e enriquecida em núcleo. Em um gel SDS-PAGE, as amostras provenientes dos cortes controle e LTP devem ser colocadas no mesmo gel para comparação direta no Western blot. Esta figura mostra um imunoblot para as frações homogenizada, citosólica e enriquecida em núcleo de um lisado de ca, analisadas com marcadores citosólicos e nucleares.Esta é uma análise por imunoblot dos níveis de PJS 180 no homogenato dois minutos e 30 minutos após a indução de tein, e esta é uma análise por imunoblot dos níveis de PJS 180 na fração enriquecida nuclear. Dois minutos e 30 minutos após a fosforilação, os níveis de fosfo Jacob permaneceram inalterados nos homogenatos totais de proteína CA1 e na fração enriquecida nuclear dois minutos após a fosforilação. No entanto, um aumento significativo foi observado na imunorreatividade de p Jacob, S 180, 30 minutos após a indução de LTP.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de usar um volume apropriado da válvula de lise hipotônica. Além disso, o período crítico para a lise das amostras precisa ser padronizado. Em particular, quando este método é aplicado para o isolamento de núcleos e frações a partir de amostras de tecido cerebral de ratos ou camundongos, além do hipocampo, após a execução deste procedimento, outros métodos como coloração imunológica complementar com anticorpo contra proteínas candidatas importadas para o núcleo após a indução de OTP ou moléculas sinalizadoras como formas ativas de quinases ou fosfatases podem ser úteis para verificar esses resultados.O tratamento farmacológico pode ser realizado para responder perguntas adicionais. Por exemplo, quais cascatas de sinalização estão envolvidas na translocação de proteínas nucleares mensageiras sinápticas, ou como elas influenciam uma função nuclear. Além disso, pode-se estudar o papel das proteínas mensageiras nucleares sinápticas em doenças que envolvem o hipocampo.Por exemplo, a doença de Alzheimer.

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Isolamento de CA1 Nucleares frações enriquecidas de fatias do hipocampo para o Estudo de dependentes de Atividade Nuclear Importação de Mensageiro Proteínas Synapto nucleares (Vídeo) | JoVE Journal

Isolamento de CA1 Nucleares frações enriquecidas de fatias do hipocampo para o Estudo de dependentes de Atividade Nuclear Importação de Mensageiro Proteínas Synapto nucleares

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