Isolamento de CA1 Nucleares frações enriquecidas de fatias do hipocampo para o Estudo de dependentes de Atividade Nuclear Importação de Mensageiro Proteínas Synapto nucleares

Nós fornecer um protocolo detalhado para a indução de potenciação de longo prazo na região CA1 do hipocampo e o subsequente isolamento de fracções enriquecidas nucleares da área tetanized da fatia. Esta abordagem pode ser utilizada para determinar a actividade da importação nuclear de proteína dependente em modelos celulares de aprendizagem e memória.

O objetivo geral deste experimento é estudar o transporte nucleocitoplasmático dependente da atividade de proteínas usando fatias agudas do hipocampo, onde a conectividade e a função neuronal estão bem preservadas. Para atingir esse objetivo, o hipocampo de um rato macho adulto é primeiro isolado e fatias transversais agudas são preparadas como uma segunda etapa. As fatias do hipocampo são transferidas para a câmara de registro e a forma tardia de LTP é induzida no átomo de rádio CA de um estrato. Em seguida, as fatias potencializadas e de controle são quebradas congeladas e as regiões estimuladas de ca one são dissecadas para isolar a fração enriquecida com núcleo para posterior análise imunológica.

Os resultados baseados na análise de western blotting mostram diferenças nos níveis de fosfoproteína nuclear entre as fatias potencializada e controle 30 minutos após a indução de LTP. Geralmente, os indivíduos novos nesse método terão dificuldades por dois motivos. Primeiro, a baixa quantidade de amostra de tecido e, segundo, o período de tempo crítico que é recorrente para a lise das amostras em tampão de lise hipotônica, permitindo a liberação dos núcleos A demonstração visual deste método é crítica, pois a preparação da vida do hipocampo e o isolamento da região C um exigem dissecções rápidas e muito precisas, mas existem certos truques.

Para facilitar, seria necessário seguir as instruções escritas e visualizadas para a preparação da fração enriquecida com energia nuclear a partir da área C um do hipocampo. A demonstração do procedimento será realizada pelo Laboratório Postal pinon. Ela mostrará como preparar a lise aguda do hipocampo e induzir LTP.

Após a dissecação de uma região C através de Berra, o aluno do nosso laboratório mostrará como isolar a energia nuclear e a destruição. Comece este procedimento isolando o cérebro do rato e mergulhe-o na solução de olhar frio pré-carbonatada. Em seguida, remova o cerebelo e parte do córtex enteral.

Separe os hemisférios corticais com um corte sagital médio. Depois, faça um corte de 50 a 70 graus ao longo da borda dorsal de cada hemisfério. Em seguida, coloque cada hemisfério em sua superfície medial, cole cada hemisfério com a superfície recém-cortada na plataforma de corte do vibrato.

Em seguida, cubra a plataforma com a solução de olhar frio pré-carbogenada. Corte fatias de 350 micrômetros contendo a formação hipocampal subular e os córtices enterais do lado anterior para posterior com o vibram. Depois disso, transfira as fatias para uma incubadora em forma de U e submersa e incube-as por pelo menos duas horas a 32 graus Celsius com carbogênio A CSF.

Agora transfira uma fatia do hipocampo para a câmara de registro do tipo submerso montada sob um microscópio. Perfundiu a fatia com LCR A carbonatado a seis mililitros por minuto por pelo menos 30 minutos a 32 graus Celsius. Após 30 minutos, encha os microeletrodos capilares de vidro com um LCR.

Coloque um microeletrodo no CA uma fibra colateral de Schaefer para estimulação e outro no átomo pronto para CA um estrato para gravação de EPSPs de campo com uma distância de 300 micrômetros. Em seguida, evoque os SSPs EP de campo fornecendo de três a quatro volts por pulsos de corrente retangulares fásicos para as fibras colaterais de Schafer. Execute o teste de estimulação máxima medindo a relação de entrada e saída e defina a força de estimulação como 40% do valor máximo de inclinação dos EPSPs de campo.

Em seguida, registre a linha de base por pelo menos 15 minutos, medindo as respostas aos estímulos de teste a cada minuto durante o experimento. Para induzir LTP tardia, aplique teína de alta frequência para aumentar os EPSPs de campo evocado em cerca de uma região. Aplique cinco micromolares por COE no LCR A dois minutos antes do tetina e lave imediatamente após o último tétano.

Pare a gravação. Dois minutos ou 30 minutos após a indução tardia do LTP, remova os eletrodos e transfira rapidamente a fatia para uma plataforma de metal pré-resfriada colocada em gelo seco. Em seguida, colete cada fatia em um tubo de 1,5 mililitro e armazene a 80 graus Celsius negativos.

Nesta etapa, retire as fatias congeladas dos 80 graus Celsius negativos e mantenha-as no gelo. Adicione 0,5 mililitros de tampão TBS fresco e frio contendo inibidores de protease e fosfatase no tubo. Incube-os por dois a três minutos antes de transferi-los para um microscópio estéreo.

Em seguida, disseque a região CA um estrato parama dole do hipocampo segurando a fatia com uma agulha e cortando a CA em uma área com a outra. Em seguida, colete as regiões dissecadas de cinco fatias por grupo em um novo tubo de mililitro de um ponto contendo 50 microlitros de tampão de lise. Em seguida, homogeneizar os tecidos coletados pipetando cuidadosamente para cima e para baixo com uma pipeta de 200 microlitros.

Incube o lisado no gelo por cinco a sete minutos para permitir que as células inchem. Depois disso, pegue dois microlitros do lisado e solte-o em uma lâmina de microscópio. Visualize o inchaço das células sob um microscópio de campo brilhante.

Os núcleos aparecem como estruturas redondas intactas com inchaço adequado. Agora, colete 20 microlitros de amostra em um tubo fresco de 1,5 mililitro como fração homogeneizada. Adicione oito microlitros de tampão de amostra XSDS de quatro desnaturantes.

Em seguida, centrifugar o lisado restante a 1100 RCF durante um minuto. Após um minuto, recolha cuidadosamente o sobrenadante da parte superior e transfira-o para um novo tubo. Posteriormente, adicione 20 microlitros de quatro x tampão de amostra.

Em seguida, ressuspenda o pellet em 60 microlitros de tampão hipotônico e adicione 20 microlitros de quatro x tampão de amostra. Esta fração é referida como uma fração enriquecida nuclear. Armazenar as fracções homogeneizada, citosólica e nuclear enriquecida a 20 graus Celsius negativos ou 80 graus Celsius negativos.

Para immunoblotting posterior neste procedimento, descongele as amostras e ferva-as por cinco minutos a 95 graus Celsius antes de medir a concentração de proteína pelo teste AM mito black, ou carga de teste BCA, uma quantidade igual de amostras de proteína das frações homogeneizada, citoplasmática e enriquecida nuclear. Em uma página de SDS, amostras de gel das fatias de controle e LTP devem ser colocadas no mesmo gel para comparação direta no Western blot. Esta figura mostra um immunoblot para as frações homogeneizada, citosólica e enriquecida nuclear do lisado de um de ca sondado com marcadores citosólicos e nucleares.

Esta é uma análise imuno-borra dos níveis de PJS 180 no homogeneizado dois minutos e 30 minutos após a indução de teína, e esta é uma análise imunosanguínea dos níveis de PJS 180 na fração enriquecida nuclear. Dois minutos e 30 minutos após a ização, os níveis de fosfo-Jacob permaneceram inalterados nos homogeneizados totais da proteína CA um e na fração enriquecida nuclear dois minutos após a ização. Mas um aumento significativo foi encontrado em p Jacob, S 180 Imunorreatividade 30 minutos após a indução de LTP.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar um volume apropriado de válvula de lise hipotônica. Além disso, o prazo crítico para a lise das amostras precisa ser padronizado. Em particular, quando este método é aplicado para isolamento de nuclear e fração de amostras de tecido cerebral de rato ou camundongo que não sejam hipocampo Após este procedimento, outros métodos, como coloração imunológica complementar com anticorpos contra proteínas candidatas importadas para o núcleo após a indução de OTP ou moléculas de sinalização, como formas ativas de quinase ou fosfatase, podem ser úteis para verificar esses resultados.

O tratamento farmacológico pode ser realizado para responder a perguntas adicionais. Por exemplo, quais cascatas de sinalização estão envolvidas na translocação de proteínas nucleares sinápticas ou como elas influenciam uma função nuclear. Além disso, pode-se estudar o papel das proteínas mensageiras nucleares sinap na doença envolvendo o hipocampo.

Por exemplo, a doença de Alzheimer.