Name: Endotelial Tubo celular Formação ensaio para a In Vitro Estudo da angiogênese (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Aprenda o ensaio de formação de tubos endoteliais para estudar angiogênese in vitro usando células endoteliais e extrato de membrana basal. Este método rápido permite visualizar e quantificar redes tubulares em poucas horas.

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Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo programa do Instituto Nacional do Câncer dos Institutos Nacionais de Saúde Research intramuros, e pelo NCI conceder UA5CA152907.

1 Coleção de meios condicionados teste para potencial angiogênico <ol><li> Cultivar células primárias ou imortalizadas para ser testado para potencial angiogênico ou anti-angiogênico em meio de soro nativas ou baixas e recolher meios condicionados. <ol><li> Em alternativa, a utilização de meios condicionados imediatamente, ou divididos em alíquotas e armazenado a -80 ° C durante vários meses. Usar meios de soro nativo ou nonconditioned baixo como um controlo negativo, e utilizar meios não-condicionado completo de crescimento (10% FBS, ou concentração apropriada) como um controlo positivo. Como alternativa, para testar potenciais estimuladores da angiogênese, suplemento de carvão mídia despojado sem fatores de crescimento, com concentrações conhecidas de proteínas específicas de interesse e comparar com fator de crescimento mídia livre sozinho. </li></ol></li></ol> 2 Preparação de células endoteliais antes do ensaio <ol><li> Dois dias antes do ensaio, a passagem 3B-11 células para um novo frasco T-75. Número de passagem das células é importante. Este ensaio funciona melhor quando as células estão entre as segunda e sexta passagens. O ensaio não vai funcionar bem se as células endoteliais são utilizados antes da segunda ou após a décima passagem. </li><li> Crescer as células durante 24 horas em DMEM suplementado com 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM, 100 U / ml de penicilina, e 100 ug / ml de estreptomicina. </li><li> Um dia antes do ensaio, soro fome 3B-11 células, como se segue: <ol><li> Aspirar mídia das células 11 3B-. </li><li> Adicionar meio de soro reduzido de DMEM suplementado com 0,2% de FBS, 2 mM de L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM, 100 U / ml de penicilina, e 100 ug / ml de estreptomicina. </li><li> Crescer as células durante mais 24 horas adicionais. </li></ol></li></ol> 3: Preparação de reagentes antes do ensaio NOTA: As concentrações de minorias étnicas são altamente variável dependente muito. O BME não funcionam bem, se a concentração é inferior a 10 mg / ml, por conseguinte, o fabricante deve ser contactado BME antes da compra para asseguraraquisição de um lote de concentrado de forma adequada. <ol><li> Degelo reduzido fator de crescimento BME na geladeira. BME solidifica quando aquecido, por isso deve ser mantido frio antes de usar. BME pode ser armazenado sob refrigeração durante algumas semanas, ou divididos em alíquotas e congeladas a -80 ° C. </li><li> Um fator de crescimento reduzido BME é preferível a BME tradicional. A falta de fatores angiogênicos na BME irá torná-lo mais fácil de observar o efeito que os fatores do meio condicionado têm na formação do tubo. </li><li> Meios de descongelação para ser testado. </li></ol> 4 Preparação de Células Endoteliais Imediatamente antes do ensaio <ol><li> Lavar 3B-11 em células de DPBS. <ol><li> Se a visualização em microscopia confocal de fluorescência ou é desejado, antes de lavá-3B 11 células, adicionar calceina AM às células endoteliais em meio a uma concentração final de 2 ug / ml. Colocar as células marcadas calceína no escuro a 37 ° C e 5% de CO 2 antes do início do ensaio. Dissolver estoque calceï¿½aAM em DMSO e uma vez que a calceina é diluída em meio de concentração final de DMSO não deve exceder 0,1%. Após 30-45 min lavagem calceï¿½a AM a partir das células (passo 4.1) e continuar com o experimento segue. </li></ol></li><li> Tripsinizar as células por adição de 1 ml de tripsina-EDTA para frascos T-75. </li><li> Após tripsinização é completa, neutralizar a tripsina por ressuspensão células para um volume final de 10 ml em DMEM, 10% FBS, 2 mM de L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM, 100 U / ml de penicilina, e 100 ug / ml de estreptomicina. </li><li> Células filtro através do 100 um filtro de células para remover pedaços. </li><li> Contar as células e ressuspender as células a uma concentração final de 7,5 x 10 6 células / ml em DMEM, 10% FBS, 2 mM de L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM, 100 U / ml de penicilina, e 100 ug / ml de estreptomicina. </li></ol> Formação 5 Tubo de Ensaio <ol><li> Colocar 24 poços de placas e 1 ml de pontas em frigorífico ou em gelo durante 20-30 minutos antes de carregar a placa de modo que a BME não prematurely solidificar. </li><li> Pipetar 250 l de factor de crescimento reduzida de BME em cada poço de uma placa de 24 poços. Evite criar bolhas por não pressionar a pipeta para sua última parada, enquanto a distribuição. Tome cuidado para que suficiente BME continua no centro do poço quando as formas de menisco; Se a matriz é muito fino, apenas as células formarão uma monocamada. </li><li> Incubar placa de 24 poços a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 30 minutos para solidificar BME. </li><li> Uma vez que a BME definiu, misturar cerca de 300 ul de meio condicionado com 10 ul de ressuspensos 3B-11 células (aproximadamente 75.000 células). <ol><li> Ajustar o volume de meio condicionado, o número de células plaqueadas dependendo do tipo de célula endotelial utilizado, e testar as diluições em série dos meios condicionados para demonstrar a actividade. Se comparando células cultivadas sob diferentes condições, normalizar condicionado volume de mídia para o número de células que foram utilizadas para condicionar os meios de comunicação. </li></ol></li><li> Tubos will começam a se formar dentro de 2-4 horas. Dependendo da concentração de factor angiogénico no meio condicionado, a formação do tubo de pico pode ocorrer entre 3 e 12 horas e o tempo do ensaio terá de ser optimizada. Se estiver a trabalhar com células endoteliais primárias, em vez de células imortalizadas, a formação do tubo inicial pode ser atrasada por várias horas. <ol><li> Tubes, muitas vezes, começam a deteriorar-se no prazo de 18 células endoteliais hr e passará por apoptose. </li></ol></li><li> No momento da formação pico tubo, mídia cuidadosamente aspirado do poço para evitar a ruptura do tubo de rede na BME. <ol><li> Lavar cada poço com 1 ml de DPBS, em seguida, aspirar. <ol><li> Para visualização imediata, adicione 1 ml DPBS frescas para cada rede tubo bem e imagem usando um microscópio invertido ligado a uma câmera digital, ou fluorescência / microscópio confocal se as células foram marcadas com calceína AM como em 4.1.1. </li><li> Para fixar a rede de tubos para posterior visualização, e adicionar paraformaldeído 4% a cadaaspirada bem e incubar durante 15 min à temperatura ambiente. <ol><li> Remover paraformaldeído, lavar duas vezes com DPBS e depois adicionar 1 mL de DPBS fresco a cada poço. </li><li> Microscopicamente imagem antes da fixação de alguns dos tubos pode quebrar durante este procedimento. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol> 6. Quantificação da rede de metro <ol><li> Quantificar a rede de tubos de várias maneiras diferentes, dependendo da preferência do investigador, e vários programas de computador têm a capacidade de medir os seguintes parâmetros: número de tubos; número de loops / malhas; número de locais de filiais / nós; comprimento de tubos. </li><li> Use programa de computador representante como J Imagem com o plugin angiogênese Analyzer 16 para quantificação de redes de tubos. </li></ol>

<ol><li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+life%2C+disease+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438, 932-936 (1038).</li>
<li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473, 298-307 (2011).</li>
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<li>Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+angiogenesis%3A+endothelial+cell+tube+formation+on+gelled+basement+membrane+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.</a> Nature protocols. 5, 628-635 (2010).</li>
<li>Walter-Yohrling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+endothelial+cell+lines+as+models+of+tumor+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+cancer+research+%3A+an+official+journal+of+the+American+Association+for+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Murine endothelial cell lines as models of tumor endothelial cells.</a> Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 10, 2179-2189 (2004).</li>
<li>Connell, K. A., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+lymphoid+endothelial+cell+line+immortalized+by+simian+virus+40+binds+lymphocytes+and+retains+functional+characteristics+of+normal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells.</a> Journal of immunology. , Baltimore, Md. 144-521 (1950).</li>
<li>Carpentier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+contribution%3A+Angiogenesis+Analyzer%5BTitle%5D)+AND+%22ImageJ+News%22%5BJournal%5D)">ImageJ contribution: Angiogenesis Analyzer.</a> ImageJ News. , (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A angiogénese está envolvida em ambos os processos fisiológicos e patológicos. O estudo dos mecanismos envolvidos na angiogénese necessita da utilização de ensaios que recapitulam as etapas principais na angiogénese. O ensaio de formao de tubo endotelial oferece várias vantagens em relação a outros ensaios. É fácil de configurar, é relativamente barato, produz túbulos dentro de horas, e é quantificável. Além disso, pode ser completado em 24 ou placas de 96 poços, e, assim, pode ser utilizado para a triagem de alto rendi...

A angiogénese, desenvolvimento de novos vasos sanguíneos a partir de vasos pré-existentes, é essencial para uma variedade de processos, incluindo o crescimento de órgãos, desenvolvimento embrionário, a cicatrização de feridas e 1-3. Recentemente desenvolvido vasos sanguíneos, revestidos por células endoteliais, suprimento de oxigênio e nutrientes para os tecidos, promover a vigilância imunológica por células hematopoiéticas e remover os resíduos 2,4. A angiogênese é de fundamental importância durante o desenvolvimento embrionário e fetal. No entanto, este processo permanece dormente no adulto, exceto durante os períodos de cicatrização de feridas, crescimento esquelético, a gravidez ou durante o ciclo menstrual 1-3. Ao longo das duas últimas décadas, os mecanismos moleculares fundamentais que regulam a angiogênese começaram a surgir. A angiogênese é um evento estritamente regulado, equilibrado pelo pró e antiangiogênicos sinais incluindo as integrinas, quimiocinas, angiopoietinas, agentes sensores de oxigênio, moléculas juncional e inibidores endógenos 5. Uma vez proangiogenic sinais tais como o factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e factor de crescimento epidérmico (EGF) activam os receptores de células endoteliais nas células endoteliais libertam proteases para degradar a membrana basal. As células endoteliais proliferam em seguida e migram, formando brotos a uma taxa de vários milímetros por 6,7 dias. A angiogénese está associada a várias condições patológicas, incluindo cancro, psoríase, retinopatia diabética, artrite, asma, doenças auto-imunes, doenças infecciosas, e aterosclerose 8-10. Devido à importância da angiogénese em várias doenças, compreendendo os genes e vias que regulam este processo é crítica para a concepção de melhores terapias. O ensaio de formao de tubo é um método rápido e quantitativo para a determinação de genes ou vias envolvidas na angiogénese. Descrita pela primeira vez em 1988,os princípios subjacentes a este ensaio são as células endoteliais que retêm a capacidade de dividir e migrar rapidamente, em resposta a sinais angiogénicos 11-13. Além disso, as células endoteliais são induzidas a diferenciar e formar estruturas semelhantes a tubos quando cultivadas numa matriz de extracto de membrana basal (BME). Estes tubos contêm um lúmen rodeado por células endoteliais ligadas entre si por meio de complexos juncionais. A formação do tubo ocorre rapidamente com a maioria dos tubos formando neste ensaio dentro de 2-6 horas, dependendo da quantidade e do tipo de estímulos angiogénicos. Vários tipos de células endoteliais pode ser utilizado para este ensaio, incluindo ambas as células primárias e as linhas de células imortalizadas 14,15. A linha celular utilizada para este artigo foi rato 3B-11, mas o mesmo método pode ser aplicado a outras linhas de células endoteliais, tais como SVEC4-10 (ratinho) ou células endoteliais primárias, tais como células humanas (HUVEC). Dependendo da linhagem de células é utilizado e se o ce endoteliallls são transformadas ou não transformadas, a optimização necessita de ser realizado para identificar o tempo ideal necessário para a formação do tubo adequado.

<table><tbody><tr><td>Placa tratada com cultura de tecidos Costar de 24 poços</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel matriz de membrana basal, fator de crescimento reduzido</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Gibco 0,05% tripsina-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Gibco L-glutamina 200 mM (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Estreptococo de caneta Gibco</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gibco DMEM (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Gibco DPBS (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Atlas Biologicals</td><td>F-0500-A</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Life Technologies</td><td>C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ATCC</td><td>4-X</td><td></td></tr></tbody></table>

endotelial tubo celular formação ensaio para a<em&gt; in vitro</em&gt; estudo da angiogênese

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

A angiogénese é um processo fundamental para o desenvolvimento de tecido normal e cicatrização de feridas, mas também está associada a uma variedade de condições patológicas. Utilizando este protocolo, a angiogénese pode ser medida in vitro, de um modo rápido, quantificável. Células endoteliais primárias ou imortalizadas são misturados com meios condicionados e semeadas em matriz de membrana basal. As células endoteliais formam estruturas semelhantes a capilares em resposta a sinais angiogénicos encontrados em meios condicionados. A formação do tubo ocorre rapidamente com células endoteliais começam a alinhar-se dentro de 1 hora e túbulos contendo lúmen começando a aparecer dentro de 2 horas. Os tubos podem ser visualizados utilizando um microscópio invertido de contraste de fase, ou as células podem ser tratadas com calceína AM antes do ensaio e tubos visualizado através de fluorescência ou microscopia confocal. O número de locais de filiais / nós, laços / malhas, o número ou o comprimento dos tubos de formados podem ser facilmente quantificado como uma medida de em VITRo angiogénese. Em resumo, este ensaio pode ser usado para identificar genes e vias que estão envolvidos na promoção ou inibição de angiogénese de um modo rápido, reprodutível e quantitativa.

Rato 3B-11 as células endoteliais foram semeadas em factor de crescimento reduzida solidificada BME - neste ensaio, o produto foi utilizado Matrigel - e seguido ao longo do tempo. Como mostrado na Figura 1, os factores angiogénicos segregados por qualquer queratinócitos de ratinho ou de fibroblastos são capazes de induzir a formação do tubo ao longo do tempo. As células endoteliais migram e começam a se formar pequenos ramos dentro de 1-2 horas de galvanização. Formação máxima tubo foi alcançado por 4-6...

O ensaio de formao de tubo é um método rápido, quantificável para medir a angiogénese in vitro. As células endoteliais são combinados com meios condicionados e semeadas em extracto de membrana basal. A formação do tubo ocorre dentro de poucas horas e túbulos recém-formados facilmente quantificada.

Endotelial Tubo celular Formação ensaio para a<em&gt; In Vitro</em&gt; Estudo da angiogênese

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

O objetivo geral deste procedimento é determinar genes ou vias envolvidas na angiogênese por meio do uso de um método in vitro rápido e quantitativo. Isso é realizado primeiramente submetendo células endoteliais primárias ou imortalizadas à privação de soro no dia anterior ao ensaio. O segundo passo consiste em incubação das células endoteliais com calcine por 30 minutos, seguida pela lavagem das células com PBS.Em seguida, as células endoteliais são tripsinizadas, filtradas para remover agregados e contadas. O passo final consiste em combinar as células endoteliais com meio condicionado contendo possíveis fatores angiogênicos e distribuí-las sobre o extrato de membrana basal solidificado. Por fim, utiliza-se microscopia de luz ou fluorescente para visualizar as redes tubulares, que podem então ser quantificadas com programas computacionais especializados.A principal vantagem desta técnica em comparação com outros métodos para ensaiar angiogênese é que ela é fácil de montar, relativamente barata, produz túbulos em poucas horas e é quantificável, demonstrando esta técnica. É Erica Bullwinkle, uma estudante de pós-graduação no departamento de biologia da American University? Usando o

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Biologia

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O objetivo deste método é obter matrizes 3D derivadas de fibroblasto como um andaime natural para ensaios celulares subsequentes. Os fibroblastos são semeados em uma placa de cultura pré-tratada e estimulados com ácido ascórbico para geração de matriz. As matrizes são descelularizadas e bloqueadas para a cultura de células relevantes (por exemplo, células endotélias).

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O presente protocolo permite a recuperação de estruturas semelhantes a tubos formadas no ensaio clássico de formação de tubos de angiogênese in vitro , onde células, como células trofoblásticas, se organizam em estruturas semelhantes a capilares sobre uma camada de matriz de membrana basal extracelular. As estruturas recuperadas são usadas para isolamento de RNA e proteínas para várias análises bioquímicas.

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Aprenda o ensaio de formação de tubos endoteliais para estudar angiogênese in vitro usando células endoteliais e extrato de membrana basal. Este método rápido permite visualizar e quantificar redes tubulares em poucas horas.

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