Endotelial Tubo celular Formação ensaio para a

O objetivo geral deste procedimento é determinar genes ou vias envolvidas na angiogênese por meio do uso de um método in vitro rápido e quantitativo. Isso é realizado primeiramente submetendo células endoteliais primárias ou imortalizadas à privação de soro no dia anterior ao ensaio. O segundo passo consiste em incubação das células endoteliais com calcine por 30 minutos, seguida pela lavagem das células com PBS.

Em seguida, as células endoteliais são tripsinizadas, filtradas para remover agregados e contadas. O passo final consiste em combinar as células endoteliais com meio condicionado contendo possíveis fatores angiogênicos e distribuí-las sobre o extrato de membrana basal solidificado. Por fim, utiliza-se microscopia de luz ou fluorescente para visualizar as redes tubulares, que podem então ser quantificadas com programas computacionais especializados.

A principal vantagem desta técnica em comparação com outros métodos para ensaiar angiogênese é que ela é fácil de montar, relativamente barata, produz túbulos em poucas horas e é quantificável, demonstrando esta técnica. É Erica Bullwinkle, uma estudante de pós-graduação no departamento de biologia da American University? Usando o meio apropriado, transfira três células B 11 para um novo frasco dois dias antes de iniciar o ensaio; para melhores resultados, as células devem estar entre a segunda e a sexta passagem quando utilizadas.

Em seguida, cultive as células por 24 horas em dmm suplementado. Quando as células estiverem prontas, submeta-as à privação de soro. Substituindo o meio por meio com soro reduzido, cultive as células privadas de soro por mais 24 horas.

Para obter os melhores resultados, é importante confirmar com o fabricante que a concentração da solução estoque de BME é de 10 miligramas por mililitro. Deve-se descongelar o BME com fatores de crescimento reduzidos na geladeira. Como o BME se solidifica quando está morno, ele deve ser mantido frio antes do uso.

A seguir, descongele o meio necessário para o ensaio para visualização com microscopia de fluorescência ou confocal e adicione calcina AM ao meio numa concentração final de dois microgramas por mililitro. Incube as células marcadas com calcina AM no escuro por cerca de 30 a 45 minutos. Após esse período, remova o meio e lave as células 3B11 em DPBS. A seguir, trypsinize as células adicionando um mililitro de tripsina, EDTA. Após a conclusão da tripsinização.

Re-suspenda as células até um volume final de 10 mililitros. Em dmm suplementado, remova quaisquer agregados das células filtrando-as através de um filtro celular de 100 micrômetros. Após a contagem das células re-suspensas, suspenda-as na concentração final correta para iniciar o ensaio de formação de tubos em gelatina refrigerada.

Uma placa de 24 poços e ponteiras de um mililitro por 20 a 30 minutos antes da carga. Isso evita que a BME solidifique prematuramente. Quando estiver pronto para começar, pipete 250 microlitros de BME com fator de crescimento reduzido em cada poço de uma placa de 24 poços. Evite formar bolhas não pressionando a pipeta até o seu limite final.

Ao pipetar, após o carregamento dos poços, verifique se há quantidade suficiente de BME no centro de cada poço. Quando o menisco se formar, se a matriz estiver muito fina, as células formarão apenas uma monocamada. Em seguida, incube a placa por 30 minutos para solidificar o BME.

Uma vez que o BME tenha solidificado, misture aproximadamente 300 microlitros de meio condicionado com 10 microlitros de suspensão de três células B 11 e distribua a suspensão celular em alíquotas nos poços da placa. Após colocar a placa na incubadora, os tubos começarão a se formar entre duas e quatro horas; dependendo da concentração do fator angiogênico no meio condicionado, a formação máxima de tubos pode ocorrer entre três e 12 horas. O tempo do ensaio precisará ser otimizado de acordo com as condições individuais do estudo.

Os tubos geralmente começam a se deteriorar dentro de 18 horas, e as células endoteliais sofrerão apoptose no momento da formação máxima dos tubos. Aspire cuidadosamente o meio do poço para evitar perturbar a rede de tubos. Em seguida, lave cada poço com um mililitro de DPBS para visualização imediata.

Adicione um mililitro de DPBS fresco a cada poço e visualize a rede de tubos em um microscópio confocal para fixar uma rede de tubos para visualização posterior. Adicione paraformaldeído a 4% a cada poço aspirado e incube por 15 minutos à temperatura ambiente. Após a remoção do paraformaldeído, lave duas vezes com DPBS e, em seguida, adicione um mililitro de DPBS fresco a cada poço. Essas imagens mostram que fatores angiogênicos secretados por queratinócitos ou fibroblastos de camundongo são capazes de induzir a formação de tubos.

Com o tempo, as células endoteliais migram e começam a formar pequenas ramificações dentro de uma a duas horas após a semeadura. A formação máxima de tubos foi atingida entre quatro e seis horas. Após 24 horas, algumas ramificações permaneceram, mas muitas das células tornaram-se apoptóticas e os tubos começaram a se desconectar.

O número de células tem um impacto profundo na formação de tubos. Quando um número insuficiente de células é semeado, poucos tubos se formam e a rede é mínima; à medida que mais células são semeadas, a rede de tubos torna-se mais extensa. No entanto, em concentrações muito altas, as células começam a se aglomerar ou a formar monocamadas, e as diferenças entre os grupos tratados tornam-se mascaradas. As células devem ter, no mínimo, dois passagens para garantir uma formação adequada de tubos.

A taxa de crescimento de três B 11 é tão rápida que 25% das células passadas em um dia produzirão um frasco confluente no dia seguinte. Aqui, o Image J com o plugin de angiogênese é utilizado em uma rede de tubos corados com calcina AM para detectar o número total de nós, tubos em malha em combinação e sobreposição na rede. Além disso, este programa pode ser usado para detectar individualmente nós, tubos ou malhas, que podem ser quantificados.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a angiogênese in vitro de maneira rápida e confiável, evitando armadilhas comuns.