Mapeamento baseado em AFM das propriedades elásticas de paredes celulares: em tecido, os celulares, e as Resoluções Subcelulares

O objetivo geral deste procedimento é mapear as propriedades mecânicas dos tecidos vegetais usando um microscópio de força atômica. Primeiro prepare as lâminas de vidro pipetando uma gota de aros de baixa temperatura de fusão em uma região gravada da lâmina para formar uma fina película de aro. O segundo passo é dissecar e montar a amostra.

Remova os botões florais do caule, corte o caule do marris do caule e incorpore imediatamente o caule cortado no fino filme Agros no vidro. Deslize em seguida, adicione agros de montagem derretidos suficientes para preencher a rachadura criada quando a haste Maris foi embutida no filme Aros. A etapa final é configurar o microscópio de força atômica para aquisição de dados.

Em última análise, a análise de dados e as medições do módulo aparente de paredes celulares de Young geram um mapa mecânico das propriedades das paredes celulares simultaneamente em resoluções subcelulares e em regiões inteiras do tecido. A principal vantagem desta técnica sobre o método existente é que ela pode medir as propriedades mecânicas da parede celular simultaneamente na resolução subcelular e em toda a região do tecido. O meio Aros para incorporação de amostras é preparado a partir de 0,7% de baixa temperatura de fusão, aros em 10% de manitol em água.

Usando um instrumento de metal forte, como uma ponta de broca, grave uma área de 0,5 por 0,5 centímetro no centro de um vidro de microscopia. Deslize isso torna a superfície áspera para facilitar a adesão dos agros para garantir que os meios agros grudem ou se fixem na lâmina. Gotícula de pipeda de cerca de 20 microlitros de incorporação de meios agrícolas na região gravada da lâmina de vidro.

Isso produz uma fina película de agros. Guarde a lâmina de vidro em uma caixa úmida e espere que o meio Agros solidifique as amostras de Arabidopsis. Ana será usada para microscopia de força atômica para preparar amostras de meristema.

Remova os botões florais um a um do caule, puxando-os para baixo com uma pinça ultrafina. É importante remover todos os botões florais até os botões que não exibem sequências conhecidas como P um primor de estágio. Usando uma lâmina de barbear ou a ponta da pinça, corte o meristema do caule.

O corte deve ser paralelo à região da superfície do meristema que deve ser medida com o microscópio de força atômica ou um FM. O ápice obtido deve ter entre 300 mícrons e 600 mícrons de altura para que não se desintegre durante o experimento. Empurre imediatamente o ápice para dentro da película fina de aros media preparada anteriormente. Escolha uma posição na lâmina de vidro ou aros e empurre suavemente de modo que o meristema fique diretamente em contato com a lâmina de vidro e se projete para fora do aros.

O agros fratura com a aplicação de pressão, então o caule mari agora estará em uma rachadura. É crucial posicionar o caule do marit no aros dentro de alguns segundos que seguem seus cortes do caule. Isso evita que a haste MA seque.

Várias hastes MA podem ser preparadas dessa maneira para imagens em lote, desde que tenham a mesma altura e estejam posicionadas a menos de 500 mícrons uma da outra. Na lâmina, manter as hastes preparadas na caixa húmida enquanto dissecamos as amostras adicionais. Antes de prosseguir para a próxima etapa, use papel de filtro para remover suavemente o excesso de água no limite entre o meristema e os botões florais.

Isso é para evitar que os agros derretidos inundem a amostra devido às forças capilares. Mais tarde, com uma pipeta de 20 microlitros em agros de montagem derretidos suficientes para preencher a rachadura criada anteriormente e circundar cada meristema, o aros deve atingir o nível da cicatriz do botão de flor removido ou ginásio primor. Para conseguir isso, pode ser necessário adicionar agros em cada extremidade da rachadura.

Quando o agros é adicionado, ele inunda rapidamente a rachadura. Usando a pipeta, aspire alguns dos agros de montagem derretidos para garantir que a haste em mim seja o ponto mais alto da lâmina. Isso corrige o caule para que ele não possa se mover durante a imagem de raízes e hipobacotas.

Nenhuma dissecção é necessária no filme fino de agros. Na lâmina de vidro preparada, use uma micropinça para fazer uma ranhura diretamente acima de uma corrosão no vidro ou ao longo de uma lamela de vidro posicione a raiz ou o hipo coddle nesta ranhura, garantindo que esteja em contato com o vidro ao longo de seu comprimento de fixação. Adicione agros de montagem derretidos ao redor da amostra da mesma forma demonstrada para a amostra de caule me.

Um nano mago JP PK. Um FM é usado nesta demonstração. Para iniciar este procedimento, monte um cantilever com uma escritura redonda no A FM. O raio determinará a resolução X, Y, Z e a profundidade de indentação na qual a medição precisa pode ser arquivada.

Para fazer medições em meso a nanoescala na superfície da epiderme, use uma reentrância redonda de raio de 50 nanômetros. Para fazer medições em mesoescala, use uma dentadura redonda de raio de 0,5 mícron e, para fazer medições em microescala em duas a três células, use uma escritura redonda de raio de 2,5 mícrons posicione o laser na ponta do cantilever. Alinhe o laser no meio do captor usando o espelho.

Posicione um vidro limpo sob a abordagem A FM com um alvo para o ponto de ajuste de um volt, selecione para espectroscopia. Execute um recuo definindo o ponto de ajuste relativo máximo para dois volts, a velocidade de extensão para 40 mícrons por segundo e o comprimento Z para cinco mícrons. No menu do gerenciador de calibração, selecione a parte linear da curva direta para ajustar a sensibilidade.

Usando o botão selecionar faixa de ajuste, o ponto de ajuste relativo deve ser transformado de vol para metro a 200 microlitros de solução de 10% de manitol. Sob a ponta do cantilever, realinhe o laser no meio do captor usando o espelho e, movendo o respector, recalibre a sensibilidade no menu do gerenciador de calibração. Clique no botão desconhecido, selecione quatro espectroscopias e execute um recuo conforme mostrado anteriormente.

Selecione a parte linear da curva direta para ajustar a sensibilidade usando o botão selecionar faixa de ajuste para iniciar este procedimento, posicione as amostras montadas sob o A FM e adicione uma gota de 500 microlitros de solução de 10% de manitol nas amostras. Os plasmas de solução de manitol que as células se aproximam em minutos com o alvo para o ponto de ajuste de 20 nano Newtons em dente, com um ponto de ajuste relativo de 200 nano newtons e velocidade de extensão de 40 mícrons por segundo e comprimento Z de cinco mícrons. Ajuste o ponto de ajuste relativo para obter um recuo de 100 nanômetros para o cantilever montado de 200 nanômetros ou 0,5 mícron para um mícron.

Modo de mapeamento de força cantilever montado em cinco mícrons. Selecione uma região para verificar se há raízes de 70 por 70 mícrons com uma resolução de 64 por 64 para hipocos e raízes de 100 por 100 mícrons com uma resolução de 64 por 64. Pressione scan para iniciar os experimentos, salve a saída.

Comece abrindo o arquivo de dados no software de análise de dados. Em seguida, selecione o processamento em lote. Para aplicar a mesma análise a todas as curvas de um único mapa.

Selecione a altura correta para a dobra do cantilever para extrair a profundidade de indentação. Selecione a função de ajuste do módulo de Young. Isso assumirá que a força é proporcional à área de recuo.

Defina a forma da ponta como parabólica para assumir que a forma de recuo é uma parábola. Indique o raio da ponta. Em seguida, selecione a curva de retração para a análise.

A curva de retração é preferida à curva xtend porque é menos sensível à topografia. Defina a proporção de poso para 0,5. Por fim, pressione, analise e salve a saída.

Mapas modulares jovens típicos de A FM de caules florais de Marte, hipo mimos jovens e velhos e caules MA de raiz são mostrados aqui em todos os experimentos. A escritura é hemisférica, mas seu raio difere para que diferentes resoluções espaciais possam ser alcançadas. Esses mapas mostram resultados típicos para reentrâncias em meso a nanoescala com um raio de 50 nanômetros com recortes de profundidade de 50 nanômetros.

O cardiógrafo revela heterogeneidades em microescala nas paredes celulares superficiais das células epidérmicas hipocodais. Também são mostrados resultados típicos para reentrâncias de mesoescala com um raio de 500 nanômetros com reentrâncias de profundidade de 500 nanômetros para meristema floral, hipo coddle e raiz. Este cardiógrafo para reentrâncias em microescala com um raio de 2,5 mícrons com reentrâncias de profundidade de 500 nanômetros revelou amolecimento do tecido durante a iniciação do órgão que precedeu qualquer crescimento visível.

No entanto, essa varredura foi abortada devido ao intervalo na altura da amostra exceder o intervalo Z máximo do A FM. O movimento da amostra durante o experimento devido à fixação inadequada pode resultar em uma varredura borrada, conforme mostrado aqui. As regiões cobertas por agros também não podem ser medidas adequadamente, conforme ilustrado neste exemplo. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em uma hora se executada corretamente.