Name: Mapeamento baseado em AFM das propriedades elásticas de paredes celulares: em tecido, os celulares, e as Resoluções Subcelulares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Aprenda a mapear propriedades mecânicas de tecidos vegetais usando microscopia de força atômica (AFM). Este método permite analisar alterações mecânicas nas paredes celulares durante o desenvolvimento de plantas em escala mesoscópica.

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Damos graças especiais para Yves Couder para muitas discussões úteis. Agradecemos Atef Asnacios para a calibração das consolas e discussão. Agradecemos Lisa Willis, Elliot Meyerowitz e Oliver Hamant para a leitura crítica. Este trabalho foi financiado em parte pelo Human Frontier Science Program RGP0062/2005-C subvenção; Agence Nationale de la Recherche projeta&#39;&#39; Growpec,&#39;&#39; e&#39;&#39;&#39;&#39; Mechastem.

1. Prepare lâminas de vidro para montagem Amostra <ol><li> Prepare encaixar mídia agarose: 0,7% de agarose de baixa fusão em 10% manitol (em água). </li><li> Usando um instrumento de metal forte (por exemplo, ponta broca, cal), gravar uma área de 0,5 x 0,5 cm no centro de uma lâmina de vidro de microscopia. Ou em vez disso, colar um pequeno pedaço de lamela de vidro (cerca de 20 x 200 mm) para a lâmina de vidro com cola Araldite. NOTA: Este encrespa a superfície, a fim de facilitar a aderência da camada de agarose para assegurar que as varas de comunicação de agarose ou corrige para a corrediça. Este slide pode ser reutilizado. </li><li> Posicionar um gota de cerca de 20 ul de encaixar meios de agarose para a região gravada da placa de vidro. Isto dá uma película fina de agarose. </li><li> Guarde a lâmina de vidro em uma caixa úmido e esperar que os meios de comunicação de agarose solidificar. </li></ol> 2. Dissecando e montagem Amostras meristema <ol><li> Microdissect meristemas para imagi confocalng: remover os botões florais, um por um a partir do tronco, puxando-os para baixo com uma pinça ultrafinas. É importante remover todos os botões florais até os brotos que não apresentam sépalas (isto é, o primórdio P1 14). </li><li> Usando uma lâmina de barbear ou a ponta da pinça, cortar o meristema para longe da haste. O corte deve ser paralela à região da superfície do meristema, que deve ser medida com a AFM. O ápice obtida deve estar entre 300 mm e 600 mM alto para caber sob a ponta do AFM. </li><li> Empurre o ápice no filme de meios de agarose preparado no passo 1.1.4. Escolha uma posição sobre a lâmina de vidro / agarose e empurre tal que o meristema é tanto diretamente em contato com a lâmina de vidro e se projeta para fora da agarose. É crucial para posicionar o meristema no agarose, nos poucos segundos que se seguem o seu corte a partir da haste. NOTA: Este é, a fim de impedir que o meristema da secagem. Nesta fase, o meristema estará de pé em um crack porque a agarose fracturado mediante a aplicação de pressão. </li><li> Prepare vários meristemas desta forma para a imagiologia de lote, proporcionando que eles têm a mesma altura e são posicionados inferior a 500 mm a partir de um outro sobre a corrediça. Mantenha os meristemas preparados na caixa úmido enquanto dissecar mais amostras. NOTA: Limita a variação proveniente da calibração. Idealmente, 2 amostras de cada condição pode ser preparado e medido de forma aleatória. Até o momento não há nenhum efeito observado de imagem em lote na medição (stress induzido resposta). Isto pode ser devido à diluição de moléculas de sinalização de stress no agar e / ou a solução de montagem. Em alternativa, a resposta ao estresse é o mesmo, independentemente da quantidade de amostra preparada. </li><li> Antes de passar para o próximo passo, certifique-se que a fronteira entre o meristema e os botões florais é seco. Se não, retire o excesso de água com papel de filtro. Isto deve impedir que na fase seguinte, que o derretidoagarose inunda a amostra devido às forças de capilaridade. </li><li> Com uma pipeta de 20 mL, adicione o suficiente derretido montagem agarose para preencher o crack criou no passo 1.2.3. e cercar cada meristema. A agarose deve atingir o nível da cicatriz do botão de flor removido (primórdio). Para alcançar este objectivo, pode ser necessário adicionar agarose em cada extremidade da fenda. </li><li> Quando a agarose é adicionado, ele vai rapidamente inundar o crack; utilizando a pipeta, chupar parte da montagem de agarose fundida para garantir que o meristema é o ponto mais alto da corrediça. Isto corrige o meristema de modo que não pode mover-se durante o exame. </li></ol> 3. Montagem amostras de raízes ou hipocótilo <ol><li> Para raízes e hipocótilos, sem dissecção é necessário. No fina película de agarose na lâmina preparada, fazer um sulco ou diretamente acima de um etch no vidro ou ao longo de uma lamela de vidro. Posicione a raiz ou hipocótilo neste sulco garantindo que ele está em contato com ode vidro ao longo de todo o seu comprimento. </li><li> Antes de passar para o próximo passo, certifique-se de que a amostra é seca em sua superfície. Se não, retire o excesso de água com papel de filtro. </li><li> Adicionar derretido montagem agarose ao redor da amostra como no passo 1.2.6. </li></ol> 4. AFM Preparação e calibração de sensibilidade (para uma JPK NanoWizard AFM) <ol><li> Montar um cantilever na AFM. O balanço deve ser montado com penetrador em forma redonda. O raio vai determinar a, y, z x resolução e a profundidade de penetração no qual a medição exacta poderia ser arquivados. <ol><li> Para fazer medições meso-escala nanométrica na superfície da epiderme, use um penetrador rodada 50 raio nm; para fazer medições de mesoescala, use um raio mM penetrador rodada 0,5; para fazer medições em microescala (através 2-3 células), use um penetrador rodada 2,5 mM raio. </li></ol></li><li> Posicionar o laser na ponta do braço de suporte. Alinhar o laser para o meiodo captor através do espelho. </li><li> Coloque um copo limpo sob o AFM. NOTA: O seguinte é definido para transformar o sinal da posição do laser sobre o receptor de AFM em uma deformação do cantilever e, avaliando a constante do cantilever primavera, para traduzi-lo em uma força. </li><li> Aproximação com uma força-alvo &quot;set point&quot; de 1 V. </li><li> Selecione &quot;espectroscopia de força&quot;. Faça um recorte, definindo o máximo de &quot;set point em relação&quot; a 2 V, o &quot;estender velocidade&quot; a 40 mM / seg, eo &quot;comprimento z&quot; de 5 mm. </li><li> A partir do menu &quot;calibração manager&quot;, selecione a parte linear da curva para a frente para se ajustar à sensibilidade utilizando o botão &quot;select ajuste faixa&quot;. O &quot;ponto de ajuste relativa&quot; deve ser transformado de &quot;volt&quot; para &quot;meter&quot;. </li><li> A partir do menu &quot;Gerenciador de calibração&quot;, selecionar &quot;constante da mola&quot; para avaliar a elasticity do cantilever usando flutuações térmicas. Pressione o botão &quot;run&quot; para obter o enredo densidade espectral do cantilever. Encontre o pico de ressonância com a freqüência mais baixa. Coloque-o usando o botão &quot;selecionar ajuste faixa&quot;. NOTA 1: Para mais detalhes sobre o ajuste de flutuações térmicas, leia 15 Cook et al. NOTA 2: É preferível utilizar um método directo para avaliar a elasticidade do braço de suporte através de um braço de suporte de referência (ou material com rigidez conhecida). O usado aqui foi gentilmente doado por Atef Asnacios 16. </li><li> Adicione 200 ml de solução de manitol a 10% sob a ponta do cantilever. Realinhar o laser para o meio do captador usando o espelho. </li><li> Recalibrar a sensibilidade: a partir do menu &quot;calibração manager&quot;, clique no botão &quot;desconhecido&quot;; repita os passos 2.3 até 2.5. </li></ol> . 5 Aquisição de Dados: Módulo Cartografia aparente de Young <ol&gt; <li> Coloque as amostras montadas sob a AFM e adicionar uma gota de 500 mL de uma solução de manitol a 10% para a amostra. A solução de manitol plasmolyzes as células dentro de minutos. </li><li> Aproximação com uma força-alvo (&quot;set point&quot;), de 20 nN (&quot;set point&quot;, não deve ser superior a 3 V) </li><li> Recuo com um &quot;ponto de ajuste relativa&quot; de 200 nN, um &quot;estender velocidade&quot; de 40 mM / s, e &quot;comprimento z&quot; de 5 mm. </li><li> Ajustar o &quot;set point relativa&quot;, a fim de obter uma reentrância de 100 nm a 200 nm, para a montagem do cantilever ou 0,5 mm para o braço de suporte montado 1 mM / 5 um. </li><li> No modo de &quot;mapeamento de força&quot;, selecione uma região para analisar: por meristemas, 70 mM x 70 mM com uma resolução (&quot;pixels&quot;) de 64 x 64; para hipocótilos e das raízes, 100 um x 100 mm com uma resolução de 64 x 64. </li><li> Pressione Digitalizar para iniciar os experimentos. Salve a saída. </li&gt; </ol> . 6 Análise de Dados: Cálculos aparente módulo de Young <ol><li> Abra o arquivo de dados no software de análise de dados. </li><li> Selecione &quot;processamento em lote&quot; para aplicar a mesma análise para todas as curvas de um único mapa. </li><li> Seleccionar &quot;corrigir a altura para a flexão do braço de suporte&quot; de modo a extrair a profundidade de penetração. </li><li> Seleccionar &quot;módulo de função ajuste de Young&quot; que vai assumir a força é proporcional à área de reentrância. Defina a &quot;forma tip&quot; para parabólica para assumir que a forma é um recuo parabólica. </li><li> Indique o raio da ponta. </li><li> Escolha preferencialmente a curva &quot;retract&quot; para a análise, porque é menos sensível a topografia do que a curva &quot;estender&quot;. No entanto, se há aderência significativa da sonda durante a &quot;retração&quot;, use a curva &quot;estender&quot;, que é insensível a degola. </li><li> Conjuntoa relação de Poisson para 0,5. Imprensa em analisar e salvar a saída. </li></ol>

<ol><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+in+vitro+extensibility+of+growing+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Measuring in vitro extensibility of growing plant cell walls.</a> Methods in molecular biology. 715, 291-303 (2011).</li>
<li>Durachko, D. M., Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+plant+cell+wall+extension+%28creep%29+induced+by+acidic+pH+and+by+alpha-expansin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Measuring plant cell wall extension (creep) induced by acidic pH and by alpha-expansin.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , 1263(2009).</li>
<li>Durachko, D. anielM., C, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Plant+Cell+Wall+Extension+%28Creep%29+Induced+by+Acidic+pH+and+by+Alpha-Expansin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin.</a> J. Vis. Exp.. , 25(2009).</li>
<li>Suslov, D., Verbelen, J. P., Vissenberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onion+epidermis+as+a+new+model+to+study+the+control+of+growth+anisotropy+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+experimental+botany%22%5BJournal%5D)">Onion epidermis as a new model to study the control of growth anisotropy in higher plants.</a> Journal of experimental botany. 60, 4175-4187 (2009).</li>
<li>Parre, E., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pectin+and+the+role+of+the+physical+properties+of+the+cell+wall+in+pollen+tube+growth+of+Solanum+chacoense%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Pectin and the role of the physical properties of the cell wall in pollen tube growth of Solanum chacoense.</a> Planta. 220, 582-592 (2005).</li>
<li>Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+growth+in+pollen+tubes+is+associated+with+spatially+confined+dynamic+changes+in+cell+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties.</a> Developmental biology. 334, 437-446 (2009).</li>
<li>Radotic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+stiffness+tomography+on+living+Arabidopsis+thaliana+cells+reveals+the+mechanical+properties+of+surface+and+deep+cell-wall+layers+during+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth.</a> Biophysical journal. 103, 386-394 (2012).</li>
<li>Milani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+local+wall+stiffness+at+the+shoot+apical+meristem+in+Arabidopsis+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 67, 1116-1123 (2011).</li>
<li>Peaucelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pectin-induced+changes+in+cell+wall+mechanics+underlie+organ+initiation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis.</a> Current biology : CB. 21, 1720-1726 (2011).</li>
<li>Braybrook, S. A., Hofte, H., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+mechanical+contributions+of+the+pectin+matrix%3A+Insights+for+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+signaling+%26+behavior%22%5BJournal%5D)">Probing the mechanical contributions of the pectin matrix: Insights for cell growth.</a> Plant signaling & behavior. 7, 1037-1041 (2012).</li>
<li>Routier-Kierzkowska, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+force+microscopy+for+in+vivo+measurements+of+plant+tissue+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics.</a> Plant physiology. 158, 1514-1522 (2012).</li>
<li>Agudelo, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TipChip%3A+a+modular%2C+MEMS-based+platform+for+experimentation+and+phenotyping+of+tip-growing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">TipChip: a modular, MEMS-based platform for experimentation and phenotyping of tip-growing cells.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 1057-1068 (2013).</li>
<li>Miedes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xyloglucan+endotransglucosylase%2Fhydrolase+%28XTH%29+overexpression+affects+growth+and+cell+wall+mechanics+in+etiolated+Arabidopsis+hypocotyls%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+experimental+botany%22%5BJournal%5D)">Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase (XTH) overexpression affects growth and cell wall mechanics in etiolated Arabidopsis hypocotyls.</a> Journal of experimental botany. 64, 2481-2497 (2013).</li>
<li>Byrne, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+leaves1+mediates+leaf+patterning+and+stem+cell+function+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Asymmetric leaves1 mediates leaf patterning and stem cell function in Arabidopsis.</a> Nature. 408, 967-971 (2000).</li>
<li>Cook, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+implementation+of+dynamic+methods+for+measuring+atomic+force+microscope+cantilever+spring+constants%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants.</a> Nanotechnology. 17, 20135-22145 (2006).</li>
<li>Desprat, N., Richert, A., Simeon, J., Asnacios, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creep+function+of+a+single+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Creep function of a single living cell.</a> Biophysical journal. 88, 2224-2233 (2005).</li>
<li>Peaucelle, A., Braybrook, S., Hofte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+mechanics+and+growth+control+in+plants%3A+the+role+of+pectins+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+plant+science%22%5BJournal%5D)">Cell wall mechanics and growth control in plants: the role of pectins revisited.</a> Frontiers in plant science. 3, 121(2012).</li>
<li>Mittler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+signaling%3A+the+new+wave%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+plant+science%22%5BJournal%5D)">ROS signaling: the new wave.</a> Trends in plant science. 16, 300-309 (2011).</li>
<li>Braybrook, S. A., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechano-chemical+aspects+of+organ+formation+in+Arabidopsis+thaliana%3A+the+relationship+between+auxin+and+pectin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS%22%5BJournal%5D)">Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin.</a> PLoS. 8, e57813(2013).</li>
<li>Asnacios, A., Hamant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanics+behind+cell+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The mechanics behind cell polarity.</a> Trends in cell biology. 22, 584-591 (2012).</li>
<li>Meister, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FluidFM%3A+combining+atomic+force+microscopy+and+nanofluidics+in+a+universal+liquid+delivery+system+for+single+cell+applications+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">FluidFM: combining atomic force microscopy and nanofluidics in a universal liquid delivery system for single cell applications and beyond.</a> Nano letters. 9, 2501-2507 (2009).</li>
<li>Lintilhac, P. M., Wei, C., Tanguay, J. J., Outwater, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ball+tonometry%3A+a+rapid%2C+nondestructive+method+for+measuring+cell+turgor+pressure+in+thin-walled+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+plant+growth+regulation%22%5BJournal%5D)">Ball tonometry: a rapid, nondestructive method for measuring cell turgor pressure in thin-walled plant cells.</a> Journal of plant growth regulation. 19, 90-97 (2000).</li>
<li>Kroeger, J. H., Zerzour, R., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulator+or+driving+force%3F+The+role+of+turgor+pressure+in+oscillatory+plant+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Regulator or driving force? The role of turgor pressure in oscillatory plant cell growth.</a> PloS one. 6, e18549(2011).</li>
<li>Forouzesh, E., Goel, A., Mackenzie, S. A., Turner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+extraction+of+Arabidopsis+cell+turgor+pressure+using+nanoindentation+in+conjunction+with+finite+element+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">In vivo extraction of Arabidopsis cell turgor pressure using nanoindentation in conjunction with finite element modeling.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 509-520 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Nas plantas, a mudança de propriedades mecânicas desempenham um papel importante na orientação do crescimento e morfogénese. Até à data, tem havido um grande progresso em desvendar as redes genéticas e químicas que controlam o crescimento das plantas, mas nosso conhecimento de como essas redes contribuem e são afetadas por mudanças nas propriedades mecânicas é rudimentar. Este método deve permitir-nos para preencher esta lacuna, e por isso deve ser de grande interesse para os cientistas que estudam qualquer aspecto do c...

Crescimento em plantas é conseguido pela expansão coordenada das paredes celulares rígidas que cercam cada uma e todas as células do organismo. Acumulando evidência indica que é através da modificação química da parede celular de plantas que controlar localmente essa expansão. A expansão é pensado para ser conduzido principalmente por pressão sobre as paredes das células, provocadas por uma elevada pressão de turgescência da célula; esta resposta de tensão para a pressão de turgescência é governada pelas propriedades mecânicas das paredes das células 1. Pouco se sabe sobre estas propriedades mecânicas e como eles mudam durante o desenvolvimento. Além disso, pouco se sabe sobre a forma como estas propriedades mecânicas são controlados e se opiniões contribuir para alterar a química da parede celular de um modo que aparentemente é coordenado através de um tecido. Se quisermos compreender a relação entre as alterações químicas e mecânicas na parede celular das plantas durante o desenvolvimento e, finalmente, como essas interações microscópicas governar uma plantaO crescimento macroscópico, um método que pode controlar as propriedades mecânicas das paredes das células no desenvolvimento de órgãos à escala celular ou de tecido é necessária. O método de microscopia de força atómica (AFM), descrito aqui, o qual é baseado em micrométricas ou nanométricas compressões de tecidos ou cavidades, foi desenvolvido para medir com precisão as características mecânicas de paredes celulares no desenvolvimento de órgãos simultaneamente com resoluções subcelulares e entre as regiões inteiras de tecido. Outros métodos têm uma resolução que é muito baixo ou muito alto: o extensômetro só é capaz de medir as propriedades mecânicas médias de um tecido inteiro na escala milimétrica 2-4, numa escala que é, por exemplo muito grande para medir os primeiros eventos organogênese; o microindenter pode fazer medições em resolução subcelular em escala nanométrica, mas é restrita a medição células isoladas e não grupos de células ou órgãos 5-7. Com a AFM, a exigirtecido d, celulares e subcelulares resoluções podem ser alcançados 8-10. Recentemente, vários protocolos têm sido desenvolvidos especificamente para medir mecânica do tecido de plantas que também poderiam ser utilizados 11, 12. Vamos apresentar aqui como avaliar a elasticidade do tecido através da medição do módulo aparente de Young 13. O módulo de elasticidade é utilizada para descrever a rigidez de um material. Durante a pequena deformação a força necessária para deformar um material é proporcional à área de reentrância. O módulo de Young é este coeficiente. No caso de um material homogéneo contínuo com o mesmo coeficiente será medido, independentemente do tipo de recuo (tamanho e forma) mas mudará com a velocidade da medição. No caso de a estrutura complexa do tecido de plantas, temos observado até agora que a força é proporcional à deformação, permitindo a determinação deum coeficiente de proporcionalidade que chamamos &quot;jovem módulo aparente&quot;. Em contraste a partir de meios contínuos nas plantas, este novo módulo aparente é sensível ao tamanho do recuo. Ele não corresponde ao novo módulos de uma parede celular puro. Ela descreve melhor a elasticidade do andaime da parede celular do tecido de.

<table><tbody><tr><td>AFM</td><td>JPK</td><td>NanoWizard</td><td>Toda a 3 gerações pode fazer o trabalho com o mesmo prefermento.</td></tr><tr><td>Estágio</td><td>AFM JPK</td><td>CellHesion</td><td>Necessário para amostra com baixa topografia (menos de 11 &micro; m entre o ponto mais baixo e o mais alto na área de varredura forçada).</td></tr><tr><td>Óptica AFM</td><td>JPK</td><td>Top View Optics</td><td>Muito importante para posicionar a amostra. Pode ser substituído por binóculos de longo alcance ou um microscópio.</td></tr><tr><td>Microscópio estéreo</td><td>Leica</td><td>M125</td><td>Qualquer tipo de microscópio estéreo pode fazer.</td></tr><tr><td>Nanosensores cantilever montados em 150 nm</td><td>Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Suíça</td><td>R150-NCL-10</td><td>Para medir apenas a parede celular na superfície da epiderme, use.</td></tr><tr><td>1 &micro; m montado cantilever</td><td>Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchâtel, Suíça</td><td>SD-Sphere-NCH-S-10</td><td>Para medir a mecânica da parede celular ortogonal à superfície da epiderme.</td></tr><tr><td>Nanosensores cantilever sem ponta</td><td>Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchâtel, Suíça</td><td>TL-NCH-20</td><td>Para medir a mecânica local do tecido (2-3 células de largura) use um 5 &micro; M montado em balanço. Anexamos um 5 &micro; m em um balanço sem ponta.</td></tr><tr><td>5 &micro; m microesferas de silício</td><td>Corpuscular</td><td>C-SIO-5</td><td></td></tr><tr><td>Araldite</td><td>Bartik S.A. 77170 Coubet, França</td><td></td><td>Araldite para fixação do cordão ao balanço sem ponta.</td></tr><tr>Gramado da Feira Científica Fisher de <td>baixo ponto de fusão</td><td>, Nova Jersey 07410</td><td>BP160-100</td><td>34-45 &#176; C temperatura de gelação</td></tr><tr><td>D-Manitol</td><td>Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 EUA</td><td>M4125-500G</td><td></td></tr><tr><td>2 Pinças de Aço Inoxidável No. 5</td><td>Ideal-Tek 6828 Balerna, Suíça&nbsp;</td><td></td><td></td>951199</tr></tbody></table>

mapeamento baseado em afm das propriedades elásticas de paredes celulares: em tecido, os celulares, e as resoluções subcelulares

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

Nós descrevemos um método recentemente desenvolvido para medir as propriedades mecânicas das superfícies dos tecidos vegetais através de microscopia de força atômica (AFM) micro / nano-recuos, para um JPK AFM. Especificamente, neste protocolo medimos o módulo de Young aparente das paredes celulares em resoluções subcelulares em todas as regiões de até 100 mm x 100 mm em meristemas florais, hipocótilos e raízes. Isto requer uma preparação cuidadosa da amostra, a correta seleção de micro-penetradores e profundidades recuo. Para ter em conta as propriedades da parede celular só, as medições são realizadas em soluções altamente concentradas de manitol de modo a plasmolyze as células e, assim, remover a contribuição da pressão de turgescência celular. Em contraste com outras técnicas existentes, por meio de diferentes penetradores e profundidades de entalhe, este método permite a medição simultânea multiscale, <em&gt; Ou seja em resoluções subcelulares e em centenas de células que compõem um tecido. Isso significa que agora é possível caracterizar espacialmente temporalmente as mudanças que ocorrem nas propriedades mecânicas da parede celular durante o desenvolvimento, permitindo que essas alterações sejam correlacionados com o crescimento e diferenciação. Isto representa um passo fundamental para compreender como as alterações celulares microscópicas coordenados trazer eventos morfogenéticos macroscópicos. No entanto, várias limitações permanecem: o método pode ser usado apenas em relativamente pequenas amostras (cerca de 100 um de diâmetro) e apenas em tecidos externos; o método é sensível à topografia do tecido; ele mede apenas certos aspectos das propriedades mecânicas complexas do tecido. A técnica está a ser desenvolvida rapidamente e é provável que a maioria destas limitações sejam ultrapassadas em breve.

Na Figura 1 apresenta-se típicas Jovens mapas de módulos de meristemas florais (Figuras 1a e 1b), jovens e velhos hipocotiledonar (Figuras 1C-F) e meristema da raiz (Figura 1G e 1H). Em todos os experimentos o penetrador é hemisférica, mas seu raio é diferente, de modo que diferentes resoluções espaciais podem ser alcançados Figuras 1C e 1D mostram resultados típicos para penetradores meso-escala nanomé...

Descrevemos um método para mapear propriedades mecânicas de tecidos vegetais usando um microscópio de força atômica (AFM). Nós nos concentramos em como registrar as mudanças mecânicas que ocorrem nas paredes celulares durante o desenvolvimento da planta em mesoescala de campo amplo, permitindo que essas mudanças sejam correlacionadas com o crescimento e a morfogênese.

Mapeamento baseado em AFM das propriedades elásticas de paredes celulares: em tecido, os celulares, e as Resoluções Subcelulares

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

O objetivo geral deste procedimento é mapear as propriedades mecânicas de tecidos vegetais utilizando um microscópio de força atômica. Primeiro, prepare lâminas de vidro pipetando uma gota de agarose de baixa temperatura de fusão sobre uma região gravada da lâmina para formar uma película fina de agarose. O segundo passo é dissecar e montar a amostra.Remova as gemas florais do caule, corte o caule de marris longe do caule e imediatamente incorpore a extremidade cortada do caule na película fina de Agros sobre o vidro. Em seguida, deslize e adicione quantidade suficiente de agros de montagem derretido para preencher a fenda criada quando o caule de Maris foi incorporado à película de Aros. O passo final é configurar o microscópio de força atômica para a aquisição de dados.Por fim, a análise de dados e as medições do módulo aparente de Young das paredes celulares geram um mapa mecânico das propriedades das paredes celulares simultaneamente em resoluções subcelulares e em regiões inteiras do tecido. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes é que ela pode medir as propriedades mecânicas da parede celular simultaneamente em resolução subcelular e em toda a região do tecido. O meio Aros para inclusão de amostras é preparado a partir de 0,7% de aros de baixa temperatura de fusão em 10% de manitol em água.Usando um instrumento metálico resistente, como a ponta de uma broca, risque uma área de 0,5 por 0,5 centímetro no centro de uma lâmina de microscopia. Esse procedimento roughens a superfície para facilitar a adesão do agros e garantir que o meio de agros fixe-se à lâmina. Pipete uma gota de aproximadamente 20 microlitros de meio de incorporação de agros na região gravada da lâmina de vidro.Isso produz um filme fino de agros. Armazene a lâmina de vidro em uma caixa úmida e aguarde a solidificação das amostras de Arabidopsis no meio Agros. Ana será utilizada para microscopia de força atômica a fim de preparar amostras de meristema.Remova os botões florais um a um do caule puxando-os para baixo com pinças ultrafinas. É importante remover todos os botões florais até os botões que não apresentam sequelas conhecidas como primórdios no estágio P1. Com uma lâmina de barbear ou a ponta das pinças, corte o meristema separando-o do caule.O corte deve ser paralelo à região da superfície do meristema que será medida com o microscópio de força atômica ou um microscópio de fluorescência. O ápice obtido deve ter entre 300 mícrons e 600 mícrons de altura para não desmoronar durante o experimento. Empurre imediatamente o ápice para dentro da película fina do meio aros preparado anteriormente. Escolha uma posição na lâmina de vidro ou no aros e empurre suavemente de modo que o meristema entre em contato direto com a lâmina de vidro e se projete para fora do aros.A agros se fractura com a aplicação de pressão, de modo que o caule de mari ficará agora em uma rachadura. É crucial posicionar o caule de marit na aros dentro de poucos segundos após seu corte do caule. Isso impede que o caule de MA seque.Vários estolões de MA podem ser preparados desta forma para imageamento em lote, desde que tenham a mesma altura e estejam posicionados a menos de 500 micrômetros um do outro. No lâmina, mantenha os estolões de MA preparados na caixa úmida enquanto dissecar amostras adicionais. Antes de prosseguir para a próxima etapa, use papel filtro para remover suavemente qualquer excesso de água na fronteira entre o meristema e os botões florais.Isso serve para impedir que o agarose derretido alague a amostra devido às forças capilares. Posteriormente, com uma pipeta de 20 microlitros, adicione quantidade suficiente de agarose derretido para preencher a fenda criada anteriormente e envolver cada meristema; o agarose deve atingir o nível da cicatriz do botão floral ou do primórdio removido. Para isso, pode ser necessário adicionar agarose em ambas as extremidades da fenda.Quando o agarose for adicionado, ele rapidamente inundará a fenda. Utilizando a pipeta, aspire um pouco da agarose fundida para garantir que o embrião seja o ponto mais alto da lâmina. Isso fixa o embrião de modo que ele não possa se mover durante a obtenção de imagens de raízes e hipocótilos.Nenhuma dissecação é necessária na película fina de ágar. Sobre a lâmina de vidro preparada, use pinças microscópicas para fazer um sulco diretamente acima de uma ranhura no vidro ou ao longo de uma lamela de vidro, posicione a raiz ou o hipocótilo nesse sulco, garantindo que ele esteja em contato com o vidro ao longo de todo o seu comprimento. Adicione ágar de montagem derretido ao redor da amostra da mesma forma que demonstrado para a amostra de caule apical.Um nanoespetaculador JP PK. Um MF é utilizado nesta demonstração. Para iniciar este procedimento, monte uma alavanca com uma indentação de formato arredondado no MF. O raio determinará a resolução em X, Y e Z e a profundidade de indentação na qual medições precisas podem ser obtidas.Para realizar medições na escala meso a nano na superfície da epiderme, utilize uma indentação redonda com raio de 50 nanômetros. Para realizar medições na escala meso, utilize uma indentação redonda com raio de 0,5 mícron; e para realizar medições na escala micro ao longo de duas a três células, utilize uma indentação redonda com raio de 2,5 mícrons, posicionando o laser na ponta do cantiléver. Alinhe o laser ao centro do captor utilizando o espelho.Posicione um vidro limpo sob a aproximação A FM com um alvo para um ponto de ajuste de um volt, selecione a espectroscopia. Realize uma indentação definindo o ponto de ajuste relativo máximo em dois volts, a velocidade de extensão em 40 mícrons por segundo e o comprimento Z em cinco mícrons. No menu do gerenciador de calibração, selecione a parte linear da curva de avanço para ajustar a sensibilidade.Usando o botão de seleção do intervalo de ajuste, o ponto de referência relativo deve ser transformado de vol para metro em 200 microlitros de solução de manitol a 10%. Abaixo da ponta do cantiléver, realinhe o laser para o centro do captor usando o espelho e, movendo o respecter, recalcule a sensibilidade a partir do menu do gerenciador de calibração. Clique no botão desconhecido, selecione quatro espectroscopias e realize uma indentação conforme mostrado anteriormente.Selecione a parte linear da curva avanço para ajustar a sensibilidade usando o botão selecionar intervalo de ajuste para iniciar este procedimento, posicione as amostras montadas sob o AFM e adicione uma gota de 500 microlitros de solução de manitol a 10% sobre as amostras. A solução de manitol plasmatiza as células em minutos, com um valor-alvo de ponto de ajuste de 20 nano newtons em indentação, com um ponto de ajuste relativo de 200 nano newtons e velocidade de extensão de 40 mícrons por segundo e comprimento Z de cinco mícrons. Ajuste o ponto de ajuste relativo para obter uma indentação de 100 nanômetros para o cantiléver montado de 200 nanômetros ou 0,5 mícrons para o de um mícron.Modo de mapeamento de força com cantilever montado de cinco mícrons. Selecione uma região para varredura dos entrenós com 70 por 70 mícrons com uma resolução de 64 por 64 e para raízes com 100 por 100 mícrons com uma resolução de 64 por 64. Pressione varredura para iniciar os experimentos e salvar os resultados.Inicie abrindo o arquivo de dados no software de análise de dados. Em seguida, selecione o processamento em lote. Para aplicar a mesma análise a todas as curvas de um único mapa.Selecione corretamente a altura para a flexão do cantiléver para extrair a profundidade de indentação. Selecione a função de ajuste do módulo de Young. Isso assumirá que a força é proporcional à área de indentação.Defina a forma da ponta como parabólica para assumir que a forma da indentação é uma parábola. Indique o raio da ponta. Em seguida, selecione a curva de recuo para a análise.A curva de retração é preferida em relação à curva de extensão porque é menos sensível à topografia. Defina a razão poso como 0,5. Por fim, pressione analisar e salve a saída.Mapas modulares típicos de FM-A de caules florais de Mars jovens e velhos, hipocótilos e caules de MA radiculares são mostrados aqui em todos os experimentos. A indentação é hemisférica, mas seu raio difere de modo que diferentes resoluções espaciais podem ser alcançadas. Esses mapas mostram resultados típicos para indentações de meso a nanoescala com raio de 50 nanômetros e profundidade de indentação de 50 nanômetros.O cardiograma revela heterogeneidades em escala microscópica nas paredes celulares superficiais de células epidérmicas hipodérmicas. Também são apresentados resultados típicos para impressões em escala mesoscópica com raio de 500 nanômetros e profundidade de 500 nanômetros em meristemas florais, hipodérmicas e raízes. Este cardiograma para impressões em escala microscópica com raio de 2,5 mícrons e profundidade de 500 nanômetros revelou amolecimento tecidual durante a iniciação de órgãos, precedendo qualquer crescimento visível.No entanto, esta varredura foi abortada devido à amplitude na altura da amostra ter excedido o alcance Z máximo do MF-A. O movimento da amostra durante o experimento, causado por fixação inadequada, pode resultar em uma imagem desfocada, como mostrado aqui. Regiões cobertas com agros também não podem ser medidas corretamente, conforme ilustrado neste exemplo. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em uma hora, se executada corretamente.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

A rigidez da matriz extracelular influencia fortemente os comportamentos múltiplo de células aderentes. Rigidez da matriz varia espacialmente ao longo de um tecido, e sofre modificação nas condições de várias doenças. Aqui nós desenvolvemos métodos para caracterizar as variações espaciais na rigidez do tecido normal e pulmão fibrótico do mouse usando microindentation microscopia de força atômica.

Micro-Mecânica Caracterização do tecido pulmonar Usando Microscopia de Força Atômica

Este documento revela um protocolo para caracterizar as propriedades mecânicas de células vivas por meio de microindentação utilizando um microscópio de força atómica (AFM).

Medir as propriedades mecânicas das células vivas Usando Microscopia de Força Atômica

Um novo protocolo de imagem foi desenvolvido usando um atuador mecânico acionado por motor personalizado para permitir a medição de respostas em tempo real à tensão mecânica em células vivas. Relevante para a mecanobiologia, o sistema pode aplicar deformações de até 20%, permitindo imagens quase em tempo real com microscopia de força confocal ou atômica.

Imagens de células vivas durante Mecânica estiramento

A celulose cristalina é um constituinte importante da parede celular da planta. No entanto, sua quantificação em uma resolução celular é tecnicamente desafiadora.  Aqui, relatamos o uso de tecnologia de luz polarizada e seções de choque radicular para obter informações da composição da parede celular em uma resolução espaço-temporal.

Quantificação de alta resolução Celulose cristalina Acumulação em<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Raízes para monitorar celular específico do tecido da parede Modificações

Aqui, nós apresentamos a microscopia de força atômica (AFM), operada como uma ferramenta do nano-e do micro-Indentation em pilhas e em tecidos. O instrumento permite a aquisição simultânea de topografia de superfície 3D da amostra e suas propriedades mecânicas, incluindo a parede celular módulo de Young, bem como a pressão de turgor.

Uso da microscopia de força atômica para medir propriedades mecânicas e pressão de turgor de células vegetais e tecidos vegetais

Este protocolo visa automatizar as medições de AFM em centenas de células microbianas. Primeiro, micróbios são imobilizados em microestruturas de selo PDMS e, em seguida, as medições de espectroscopia de força são realizadas automaticamente em centenas de células imobilizadas.

Automação de Medições de Microscópio de Força Bio-Atômica em centenas de células de C. albicans

Apresentado aqui é o protocolo da técnica Conpokal, que combina microscopia de força confocal e atômica em uma única plataforma de instrumentos. Conpokal fornece a mesma célula, mesma região, imagens confocal simultâneas e caracterização mecânica de amostras biológicas vivas.

Microscopia confocal e força atômica (Conpokal) em células vivas

O protocolo de indentação por microscopia de força atômica oferece a possibilidade de dissecar o papel das propriedades físicas da parede celular de uma determinada célula de um tecido ou órgão durante o crescimento normal ou restrito (ou seja, sob déficit hídrico).

Microscopia de Força Atômica para Estudo das Propriedades Físicas de Células Epidérmicas de Raízes Vivas de Arabidopsis

Estudos da biomecânica da parede celular são essenciais para a compreensão do crescimento e morfogênese das plantas. O protocolo a seguir é proposto para investigar paredes celulares primárias finas nos tecidos internos de órgãos de plantas jovens usando microscopia de força atômica.

Caracterizando as Propriedades Mecânicas da Parede Celular Primária em Órgãos de Plantas Vivas Usando Microscopia de Força Atômica

A quantificação da área de contato e da força aplicadas por uma ponta de sonda de microscópio de força atômica (AFM) à superfície de uma amostra permite a determinação de propriedades mecânicas em nanoescala. As melhores práticas para implementar nanoindentação baseada em balil AFM em ar ou fluido em amostras moles e duras para medir módulo elástico ou outras propriedades nanomecânicas são discutidas.

Nanoindentação baseada em cantilever por microscopia de força atômica: medidas de propriedades mecânicas em nanoescala no ar e fluido

Este protocolo visualiza como preparar criossecções de tecido pulmonar murino, realizar experimentos de mapa de força de microscopia de força atômica e analisar os dados para determinar o módulo de Young da membrana basal pulmonar murina nativa.

Extraindo o módulo de Young de membranas basais pulmonares murinas nativas de mapas de força derivados de microscopia de força atômica

Aprenda a mapear propriedades mecânicas de tecidos vegetais usando microscopia de força atômica (AFM). Este método permite analisar alterações mecânicas nas paredes celulares durante o desenvolvimento de plantas em escala mesoscópica.

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