Name: Nanopodia - finas, Projeções frágil membrana com papéis em Movimento Celular e intercelulares Interações (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-03T15:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Aprenda a visualizar nanopódios em células endoteliais e cancerosas usando imunofluorescência de TM4SF1. Este método preserva estruturas frágeis para estudar movimento celular e interações intercelulares.

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Reconhecemos Dr. Harold Dvorak para discussões úteis, incluindo a sugestão de tentar fixação em 37 ° C PFA. Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder P01 CA92644 e por um contrato da Fundação Nacional para Pesquisa do Câncer.

1. Cultura de Células em colágeno revestido Disk Vidro <ol><li> Coloque os discos de vidro (12 mm de diâmetro) em uma jarra de vidro (4 oz) e autoclave para esterilizar os discos. </li><li> Colocar 25 ml de etanol a 70% em um tubo Falcon de 50 ml e coloca-se numa capa de cultura de células. Esta solução pode ser reutilizada várias vezes até que o nível da solução baixa para 20 ml. </li><li> Coloque uma pinça afiada com um ponto extra fino no etanol 70% por 5 minutos antes de usá-lo para lidar com o disco de vidro. </li><li> Cuidadosamente remover a pinça para fora do tubo e fechar a tampa, em seguida, colocar gentilmente a pinça de etanol tratada na parte superior do tubo de ar seco, durante 2 min. Não permita que a ponta da pinça para tocar qualquer coisa no capô. </li><li> Use as pinças esterilizadas para pegar um disco de vidro estéril fora da jarra de vidro e coloque-o em um poço da placa de 24 poços de cultura de células. Repita até que o número desejado de poços foi preenchido com discos. </li><li> Coloque 500 mL de solução de colágeno bovino (50 ng / mL) em cada cavidade que contém um disco de vidro e coloque-a num banho a 37 ° C, 5% de CO 2 célula incubadora de cultura durante pelo menos 30 min. Não há mal nenhum em um período de incubação mais longo. </li><li> Colheita (HUVEC Células Endoteliais da Veia Umbilical Humana) ou PC3 (células de tumor da próstata) que já foram cultivadas em placa de 150 mm de cultura de células por meio de tripsinizao e bloqueiam a actividade da tripsina utilizando o seu meio de cultura completo. Recolher as células para um tubo Falcon de 15 ml. </li><li> Conte o número de celular e certifique-se a viabilidade é superior a 90%. </li><li> Agregar as células por centrifugação a 200 xg durante 10 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante. </li><li> Utilizar o meio de cultura para diluir as células a 10 5 células / ml. Coloque as células no gelo. </li><li> Aspirar o colagénio no capuz de cultura de células e colocar suavemente a 500 ul de suspensão celular a cada cavidade em que os discos de vidro foram pré-revestidos com colagénio. 5 x 10 4 células / cavidade da placa de 24 poços, vai dar 60% confluency para HUVEC e 30% de confluência de células PC3. Nota: adicionar mais suspensão de células para uma maior densidade de células. </li><li> Cultura as células em um 37 ° C, 5% CO 2 incubadora de 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, ou 24 horas para rastrear as atividades nanopodia e passagem celular. Normalmente, as células irá anexar ao disco de vidro nos primeiros 30 min, em seguida, começar a se polarizar e migrar na primeira hora, e realizar interações intercelulares e divisão celular nas horas seguintes. </li></ol> 2. A fixação celular <ol><li> Cada poço terá 500 mL de 4% PFA (paraformaldeído) para fixar as células. Quer comercialmente ou fabricado feito recentemente PFA a 4% pode ser usado. Calcular a quantidade de PFA necessário com base no número de poços preparados, e colocar PFA num tubo Falcon de 15 ml. CUIDADO: paraformaldeído é um cancerígeno. </li><li> Coloque o tubo de falcon em um estande de isopor que já estava em vigor em 37 ° C incubadora. Deixe o tubo na incubadora por 30 min para a guerram até o PFA para 37 ° C. </li><li> Coloque uma almofada de aquecimento na capa de cultura e ligá-lo. </li><li> Retire a placa de cultura de células de 24 poços ea PFA pré-aquecido para fora da incubadora e coloque-o em cima da almofada de aquecimento. </li><li> Use uma mão para aspirar o meio de um poço, e imediatamente depois use a outra mão para deslizar suavemente 500 mL PFA no poço através da borda também. Para facilitar a aspiração, inclinar a placa de cultura a cerca de 45 °, encostando-o suporte de isopor de modo que é estável a este ângulo. Isto irá facilitar a aspiração e adição de solução de PFA para o bem, sem perturbar as células na cultura. Este é o passo mais importante para preservar a estrutura celular inicial de actividades celulares. </li><li> Repita o processo até que todos os poços com um disco de vidro receberam PFA. Nota: todas as etapas que precisam mudar de solução pré-existente do poço vai aplicar procedimentos mesma aspiração. </li><li> Colocar a placa de 37 ° C durante 5 min. </li&gt; <li> Pegue a placa de volta para a capa de cultura e incline contra isopor como descrito no passo 2.5. Use uma mão para transferir suavemente a PFA do poço em um tubo de coleta; use a outra mão para colocar logo em seguida, pelo menos, 500 temperatura ambiente mL PBS no poço. Depois de todos os poços foram lavados, voltar e repetir a lavagem PBS mais uma vez em todos os poços. Esvazie o PFA coletado em um recipiente de resíduos perigosos. </li><li> Preparar tampão de bloqueio TPI por adição de 2% de soro fetal bovino para PBS. Azida de sódio a 0,04% (diluído a partir de solução-mãe de 20%) é adicionado como conservante. AVISO: A azida de sódio é um composto tóxico. O tampão pode ser armazenado em 4 ° C, durante um longo período de tempo sem a contaminação bacteriana. </li><li> Com a placa de cultura ainda inclinado contra um suporte, uma vez por cada ciclo de aspiração bem para remover PBS e imediatamente depois adição de 500 ul de tampão de bloqueio de ICC. As células estão prontas para a coloração de imunofluorescência. Se necessário, océlulas fixadas podem ser armazenados num refrigerador 4 ° C durante uma semana sem perda significativa da proteína TM4SF1. </li></ol> 3. TM4SF1 Imunofluorescência Coloração de Nanopodia <ol><li> Em cada poço, a substituição de 500 ul de tampão de bloqueio do TPI com um novo tampão de bloqueio contendo 0,01% de Triton X-100 e deixar repousar à temperatura ambiente durante 1 hora. Não utilizar mais elevado do que 0,03% de Triton X-100, uma vez que irá remover TM4SF1 a partir de membranas celulares. PBS células lavadas do passo 2.10 pode ser directamente transferida para o tampão de bloqueio contendo Triton se a coloração está pronto para ser iniciado imediatamente. </li><li> Dilui-se o anticorpo primário anti-TM4SF1 (ou anti-CD9) a 0,5 ug / ml em tampão de bloqueio de ICC. </li><li> Em cada poço, remover o tampão de Triton ICC/0.01% e substituí-la com 300 ml da solução de anti-TM4SF1-anticorpo. Incubar 2 horas à temperatura ambiente ou deixar durante a noite a 4 ° C. </li><li> Lavar cada poço com não menos do que 500 ul de PBS. Repita 3x; cada vez dar a least 5 min do tempo de incubação. </li><li> Prepara-se uma solução de anticorpo secundário e faloidina em ICC tampão de bloqueio, usando uma diluição de 1000 vezes de Alexa 488 anticorpo secundário marcado de burro anti-ratinho (2 ug / ml de concentração final) e 1.000 x diluição de faloidina (50 ng / mL de concentração final). </li><li> Remover PBS e adicionar 300 ul da solução de anticorpo secundário e faloidina a cada poço e incubar durante 2 horas ou deixá-lo durante a noite a 4 ° C. </li><li> Repita os passos de lavagem PBS com pelo menos 5 minutos de incubação por lavagem. Na última lavagem, deixar cada poço em PBS, durante 1 hora. </li><li> Largar uma única gota (~ 10 mL) de montagem anti-fade mídia sobre uma lâmina de vidro. </li><li> Dobre a ponta de um 19 G 1 ½ na agulha da seringa de 90 ° pressionando suavemente sobre uma superfície dura. Use uma mão para segurar a agulha dobrado e gentilmente levante um disco de vidro do bem e utilize a outra mão para segurar o disco usando a pinça afiadas. </li><li> Vire o disco de vidro e# 160; viradas para baixo deixando o contato célula lado os meios de comunicação de montagem na lâmina de vidro. Delicadamente, coloque o disco de vidro e deixe-a secar durante a noite em um lugar escuro à temperatura ambiente. </li><li> Prossiga para a imagem da imunofluorescência manchado nanopodia, ou armazenar os slides em uma caixa de lâminas a -20 ° C. Os slides permanecerá visível por alguns meses em -20 ° C. </li></ol>

<ol><li>Chhabra, E. S., Higgs, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+faces+of+actin%3A+matching+assembly+factors+with+cellular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures.</a> Nat. Cell Biol. 9, 1110-1121 (2007).</li>
<li>Shih, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+L6+protein+TM4SF1+is+critical+for+endothelial+cell+function+and+tumor+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The L6 protein TM4SF1 is critical for endothelial cell function and tumor angiogenesis.</a> Cancer Res. 69, 3272-3277 (2009).</li>
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<li>Koley, D., Bard, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triton+X-100+concentration+effects+on+membrane+permeability+of+a+single+HeLa+cell+by+scanning+electrochemical+microscopy+%28SECM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Triton X-100 concentration effects on membrane permeability of a single HeLa cell by scanning electrochemical microscopy (SECM).</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16783-16787 (2010).</li>
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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nanopodia são finos canais de membrana celular que ligam firmemente à matriz através TMED e pode se estender mais do que 100 mm a partir de uma célula móvel polarizada para sentir o ambiente e mediar interações intercelulares 2,3. Nanopodia aderir à matriz tão firmemente que os resíduos são deixados para trás, como os movimentos de células de distância (Figuras 1 e 2). Nanopodia assim nos permitem estudar como as células sentir seu ambiente e determinar o caminho do movimento...

Durante a polarização para o movimento, as células animais estender uma variedade de dinâmicas, saliências da membrana de suas superfícies, incluindo filopodia, lamellipodia, fibras de retração, e babados 1. Recentemente adicionado a esta lista foram nanopodia, um tipo recém-reconhecido de fina (100-300 m de diâmetro), a projeção da membrana alongada (até 50-100 mM de comprimento) que oferecem canais de membrana para a extensão das estruturas de F-actina como filopodia e fibra de retracção, e que coraram positivamente com TM4SF1 (Transmembrana-4-L e seis-família-1) em células endoteliais e de tumor de células cultivadas 2,3. TM4SF1 é uma proteína com topologia tetraspaninas semelhante que foi originalmente conhecido como um antigénio das células tumorais antes de 4 a descoberta de que a molécula é um biomarcador de células endoteliais, que desempenha um papel essencial na proliferação de células endoteliais e migração de 2,3. Imunofluorescência revelou que TM4SF1 está localizada a perinucvesículas Lear e para a membrana plasmática, e é enriquecido em TM 4SF1 e nriched micro omains d (TMED). TMED âncora nanopodia à matriz e presente em um padrão em faixas regularmente espaçadas de 1-3 comprimento TMED / mM de nanopodia. Nanopodia normalmente se estendem desde principal frente de uma célula e à direita traseira durante a polarização celular para o movimento. Devido à natureza aderente firme de TMED, nanopodia são incapazes de retrair de volta para dentro da célula, uma vez que se move para longe; resíduos nanopodia abandonados traçar, assim, o caminho do movimento celular. Nanopodia fornecer canais de membrana para a extensão F-actina e retração, e são locais de interações intercelulares e comunicações 2,3. Essas características significam que nanopodia proporcionar uma oportunidade única de estudar os mecanismos subjacentes a montagem F-actina durante a polarização celular, sensor de celular do ambiente, a determinação do caminho e direção do movimento celular e interações intercelulares umnd comunicações. Devido à natureza altamente hidrofóbico de TMED ea natureza membranoso fina e frágil de nanopodia, um cuidado especial deve ser tomado a fim de preservar TMED e nanopodia. A destruição de nanopodia e remoção de TMED por métodos comuns de laboratório é uma possível razão para que apenas sessenta e três publicações apareceram na TM4SF1 desde a sua primeira descoberta, em 1986, 1 e para a total falta de conhecimento de TM4SF1 enriquecimento em 100-300 mM microdomínios em superfície das células até que o relatório de TM4SF1 em células endoteliais em 2009 2. Métodos convencionais vulgarmente imunocoloração utilizar solventes orgânicos como o etanol, metanol, acetona ou para fixar as células e utilizar de 0,1% ou mais elevada a concentração de Triton X-100 a permeabilizar as células 5. Estudos descritos aqui implementados três grandes mudanças para o método convencional para revelar TMED e nanopodia: (i) usar 37 ° C PFA 4% e corrigir as células em um 3776; incubadora C, (ii) aplicar suave temperatura ambiente de lavagem PBS, e (iii) utilizar a menos de 0,03% de Triton X-100 apenas brevemente para permeabilizar as células antes da adição do anticorpo primário, tal como Triton X-100 0,03% maior do que irá extrair TM4SF1. Todos tetraspanins formar microdomínios sobre a membrana da célula 6 e alguns colocalize com TMED em endoteliais e células tumorais 2,3. Como tetraspanins como CD9, CD81, CD151 e são ubiquamente expressas, o protocolo de coloração descrito aqui pode ser estendida a muitos tipos de células diferentes que carecem TM4SF1 para os estudos de função nanopodia.

<table><tbody><tr><td>Discos de vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td> Jarra de vidro de <td>12 mm de diâmetro</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>02-912-310</td><td>Frascos de vidro reto de vidro transparente limpo certificado, lâmina de vidro de 4 oz</td></tr><tr><td>Lâminas</td> de <td>microscópio de vidro liso premium Fisher</td><td>Scientific</td><td>12-544-1</td> Fisherfinest</tr><tr><td>50 ml Tubo Falcon</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>Tubo de centrífuga cônico de polipropileno de alta clareza de 50 ml, classificação de 16.000 rcf. Estéril.</td></tr><tr><td>Tubo Falcon de 15 ml com suporte de isopor</td><td>Corning</td><td>430790</td><td>Corning 15 ml PP Tubos de centrífuga</td></tr><tr><td>Pinça afiada</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-42</td><td>Pinça de lascas pontiagudas extra finas dissecante</td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 24 poços</td><td>BD Bioscience</td><td>353047</td><td>Placa de cultura de células de 24 poços</td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 150 mm</td><td>BD Bioscience</td><td>353025</td><td>Placa de cultura de células de 150 mm</td></tr><tr><td>19 G 1 &frac12; Agulha de seringa</td><td>BD Bioscience</td><td>309635</td><td>19 G 1 &frac12;</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>2701</td><td>Solução de colágeno puro de etanol 200 provas da</td></tr><tr><td></td><td>Decon BD Bioscience</td><td>354249</td><td>Collagen I, alta concentração, cauda de rato, 100 mg</td></tr><tr><td>de tripsina/EDTA</td><td>Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td>0,25% de tripsina-EDTA 1x</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>DMEM glicose alta (1x), líquido, com L-glutamina, sem piruvato de sódio</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Affymetrix</td><td>75889 5 LT</td><td>PBS, 10x Solução, pH 7,4</td></tr><tr><td>PFA (paraformaldeído)</td> <td>Affymetrix</td><td>19943 1 LT</td><td>4% em PBS</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135-500ML</td><td>Soro Fetal</td></tr><tr><td>Bovino EGM2-MV</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml e EGM-2 SingleQuot Kit Suplemento & Fatores</td></tr><tr><td>de crescimento Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Triton X-100</td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td>Solubilizado em água. Solução estoque a 4% e concentração de trabalho é de 0,4%.</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-humano TM4SF1 de camundongo&nbsp;</td>O epítopo <td>de MAB3127</td> <td>Millipore</td><td>está localizado no domínio extracelular</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD9 humano de camundongo&nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>555370</td><td>Epítopo está localizado no domínio extracelular</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Anti-rato de burro 2º anticorpo</td><td>Life Technologies</td><td>A-21202</td><td>Alexa Fluor 488 Anti-rato de burro IgG (H+L)</td></tr><tr><td>Faloidina</td><td>Chemicon</td><td>90324</td><td>Faloidina conjugada com rodamina</td></tr><tr><td>Mídia de montagem anti-desbotamento&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>P-36931</td><td>ProLong Gold Antifade Reagent com DAPI</td></tr><tr><td>70% Etanol&nbsp;</td><td></td><td></td><td>17,5 ml de etanol (200 provas) 7,5 ml de água duplamente deionizada</td></tr><tr><td>10x PBS (fazer 200 ml)</td><td></td><td></td><td>20 ml de 10x PBS 180 ml de água duplamente deionizada</td></tr><tr><td>20% Triton X-100 (fazer 20 ml)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>4 ml de Triton X-100 16 ml de água duplamente deionizada</td></tr><tr><td>4% NaN3 (perfazer 25 ml)</td><td></td><td></td><td>1 g de NaN3 25 ml de água duplamente deionizada</td></tr><tr><td>50 ng/ml Solução de colágeno bovino em PBS (fazer 5 ml)</td><td></td><td></td><td>Solução-estoque de 50 &mu; g/ml (50 ml) 830 &mu; l de Colágeno I (3 mg) 50 ml</td></tr> de <tr><td>Tampão de Bloqueio PBS ICC (50 ml)</td><td></td><td></td><td>49 ml PBS 2% FBS (adicionar 1 ml) 0,04% NaN3 (adicionar 100 &mu; l de 4% NaN3)</td></tr><tr><td>Tampão de Bloqueio ICC/0,01% Triton X-100 (faça 50 ml)</td><td></td><td></td><td>50 ml de Tampão de Bloqueio ICC 25 &mu; l de 20% Triton X-100</td></tr><tr><td>HUVEC&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>C2517A</td><td><a href="http://www.lonza.com/products-services/bio-research/primary-and-stem-cells/human-cells-and-media/endothelial-cells-and-media/huvec-human-umbilical-vein-endothelial-cells.aspx">www.lonza.com</a></td></tr><tr><td>PC3</td><td>ATCC</td><td>CRL-1435</td><td><a href="http://www.atcc.org/products/all/CRL-1435.aspx#85786B46AA23451B94BC5D45200673F7">www.atcc.org</a></td></tr><tr><td>Capuz de cultura de células</td><td>NuAIRE</td><td>Nu-425-600</td><td>NU-425 (Série 60) Gabinete de Segurança Biológica&nbsp;</td></tr><tr><td>37 &graus; C, 5% CO2 Incubadora de cultura de células&nbsp;</td><td>CellStar</td><td>QWJ300DABA</td><td>Cellstar CO2 Almofada de aquecimento para incubadora com camisa de água</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>K & H Fabricação</td><td>1020</td><td>K & H Lectro Kennel Almofada Aquecida com Capa de Lã Livre (<a href="http://www.amazon.com/Lectro-Kennel-Heat-Pad-22-5x28-5-In/dp/B000PSRN20/ref=pd_bxgy_petsupplies_img_y">www.amazon.com</a>)</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Sorvall</td><td>T6000B</td><td>Sorvall T6000 (B) Centrífuga de Bancada</td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>Bright-Line</td></tr></tbody></table>

nanopodia - finas, projeções frágil membrana com papéis em movimento celular e intercelulares interações

Nanopodia - Thin, Fragile Membrane Projections with Roles in Cell Movement and Intercellular Interactions

As células aderentes em cultura manter um estado polarizado para apoiar o movimento e interações intercelulares. Nanopodia são finas, alongadas, em grande parte de actina F-negativo-projeções de membrana em células endoteliais e de câncer que podem ser visualizadas através de TM4SF1 (Transmembrane-4-L-seis-família-1) técnica de imunofluorescência. Cachos TM4SF1 em 100-300 diâmetro mM TMED (TM 4SF1 e nriched micro d omains) contendo 3 a até 14 individuais TM4SF1 moléculas. TMED estão dispostas de forma intermitente ao longo nanopodia com um espaçamento regular de 1 a 3 TMED por μ m e ancorar firmemente nanopodia a matriz. Isso permite nanopodia estender mais de 100 μ m do líder frente ou à direita traseira de células endoteliais ou tumorais polarizadas, e faz com que os resíduos de membrana para ser deixado para trás em matrix quando a célula move-se para longe. TMED e nanopodia ter sido ignorado por causa de sua extrema fragilidade e sensibilidade à temperatura. Lavagem de rotina e fixação romper a estrutura. Nanopodia são preservadas por meio da fixação directa de paraformaldeído (PFA) a 37 ° C, seguida por uma breve exposição a 0,01% de Triton X-100 antes da coloração. Nanopodia abrir novas perspectivas na biologia de células: eles prometem para reformular a nossa compreensão de como as células perceber seu ambiente, detectar e identificar outras células à distância, iniciar interações intercelulares em contacto estreito, e dos mecanismos de sinalização envolvidos no movimento, proliferação e celular -celulares comunicações. Os métodos que são desenvolvidos para estudar nanopodia TM4SF1 derivados podem ser úteis para estudos de nanopodia que se formam em outros tipos de células através da agência de tetraspanins clássicos, nomeadamente a CD9 onipresente expressa, CD81 e CD151.

Para o Passo 1: Se as células (como HUVEC e PC3 utilizado neste estudo) são capazes de crescer normalmente, as células irá anexar o disco revestido de colágeno dentro de 30 minutos depois que eles são semeadas, polarizar e tornar-se móvel logo depois, e estender nanopodia à frente do seu caminho de movimento. Figuras 1A e 1B mostram, respectivamente, um polarizado e em proliferação de HUVEC. Figura 2A mostra células PC3 polarizado num estado mó...

Nanopodia são canais de membrana fina, mas frágeis, que se estendem até 100 mm de líder frente ou à direita traseira de um celular e sentir o ambiente celular. Fixação directa a 37 ° C, lavagem suave, e evitar os solventes orgânicos como o etanol, metanol, ou de acetona e de Triton X-100 a concentrações mais elevadas são necessárias para observar estas estruturas celulares.

Nanopodia - finas, Projeções frágil membrana com papéis em Movimento Celular e intercelulares Interações

Adherent cells in culture maintain a polarized state to support movement and intercellular interactions. Nanopodia are thin, elongated, largely ...

O objetivo geral deste procedimento é visualizar nano podas através de coloração imunofluorescente em células cultivadas. In vitro. Isso é feito primeiro cultivando as células de interesse em discos de vidro revestidos de colágeno.Na segunda etapa, as células são fixadas ao disco com PFA quente em seguida, as células são lavadas e depois incubadas em tampão de bloqueio por uma hora em temperatura ambiente. Na etapa final, as células são coradas com anticorpo contra TM quatro, SF um e montadas em uma lâmina de vidro. Em última análise, a presença de extensões nano podias em células móveis em proliferação ou interação pode ser visualizada por microscopia de imunofluorescência.As implicações dessa técnica se estendem à terapia e ao diagnóstico de cânceres humanos porque o movimento de proliferação de células endot e células tumorais e as interações intercelulares são processos-chave envolvidos na angiogênese e no crescimento de células tumorais. Demonstrando o procedimento será dois lean, um pós-doutorado de um laboratório Comece autoclavando discos de vidro de 12 milímetros em um frasco de vidro de quatro onças enquanto os discos estão sendo esterilizados. Coloque um tubo cônico de 50 mililitros contendo 25 mililitros de etanol a 70% em uma coifa de cultura de células.Coloque uma pinça afiada com uma ponta extra fina no etanol por cinco minutos e, em seguida, remova cuidadosamente a pinça e tampe o tubo, colocando a pinça em cima do tubo para secar ao ar por dois minutos. Quando a pinça estiver seca, coloque um disco de vidro estéril por poço em um de cada um dos poços desejados de uma placa de cultura de células de 24 poços. Em seguida, cubra cada disco com 500 microlitros de solução de colágeno bovino e coloque a placa em uma incubadora de cultura de células de dióxido de carbono a 37 graus Celsius a 5% por pelo menos 30 minutos.Enquanto os discos estão incubando, gotejam e olham para as células de interesse, interrompendo a reação com meios de cultura completos. Quando as células se separarem, colete as células flutuantes em um tubo Falcon de 15 mililitros e conte-as após confirmar que sua viabilidade é superior a 90%Pellet as células por 10 minutos a 200 G e quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante e, em seguida, dilua as células para uma vez 10 elevado ao quinto células por mililitro em meio de cultura de células e coloque as células no gelo.Agora aspire a solução de colágeno de cada poço na capa de cultura de células e, em seguida, dispense suavemente 500 microlitros das células em cada cultura de disco revestida de colágeno. As células pelo tempo apropriado para rastrear as atividades nano podia e a passagem celular. Normalmente, as células se ligam ao disco de vidro nos primeiros 30 minutos, começam a polarizar e migrar na primeira hora e realizam interações intercelulares e divisão celular nas horas seguintes para fixar as células primeiro com PFA quente o suficiente para todos os discos em uma incubadora de 37 graus Celsius por 30 minutos.Em seguida, coloque uma almofada de aquecimento na coifa de cultura. Ligue-o e coloque o PFA pré-aquecido em cima da almofada de aquecimento. A adição de PFA aos discos é a etapa mais crucial para preservar a estrutura celular original das atividades celulares para facilitar a remoção do meio de cultura e a adição do PFA sem perturbar as células em cultura, cauda a placa a cerca de 45 graus, encostando-a em um suporte de isopor para que fique estável no ângulo Usando uma mão.Em seguida, aspire o meio de cada poço e, em seguida, use imediatamente a outra mão para deslizar 500 microlitros de PFA em cada poço através da borda do poço e incubar os discos por mais cinco minutos. Em seguida, remova o PFA conforme demonstrado para o meio de cultura de células, dispensando o PFA usado em um tubo de coleta com uma mão e substituindo imediatamente o PFA por 500 microlitros de PBS em temperatura ambiente com a outra após os poços terem sido lavados duas vezes com PBS, remova a lavagem final do PBS como acabou de demonstrar e adicione 500 microlitros de tampão de bloqueio imunoquímico a cada disco. Para visualizar os nano podia por microscopia de fluorescência, primeiro substitua o tampão de bloqueio da imunoquímica em cada poço por 0,01% tritton X 100 bloqueando o tampão à temperatura ambiente por uma hora.Em seguida, substitua o tampão de bloqueio de tritton por 300 microlitros de solução de anticorpo anti TM quatro SF um recém-diluído por duas horas em temperatura ambiente. Em seguida, lave cada disco três vezes com PBS como acabamos de demonstrar, deixando o PBS nos discos por cinco minutos durante cada lavagem após a última lavagem. Incube cada poço com 300 microlitros de anticorpo secundário recém-diluído e solução de Phin e incube os discos por mais duas horas em temperatura ambiente.Agora lave os discos três vezes novamente, deixando a lavagem final do PBS nos poços por uma hora. Em seguida, com uma única gota de 10 microlitros de mídia de montagem Antifa, em uma lâmina de vidro para cada disco. Em seguida, dobre suavemente a ponta de uma agulha de seringa de calibre 19, uma polegada e meia, 90 graus em uma superfície dura.Em seguida, segurando a agulha com uma mão, levante suavemente o disco de vidro, um por um, usando uma pinça afiada para segurar o disco com a outra mão. Coloque cada disco de vidro voltado para baixo na mídia de montagem nas lâminas de vidro e, em seguida, coloque cuidadosamente as lâminas em um local escuro em temperatura ambiente para secar durante a noite. Os nano podas corados podem então ser visualizados ou armazenados em uma caixa de slides a menos 20 graus Celsius.Normalmente, as células em crescimento se ligam aos discos revestidos de colágeno dentro de 30 minutos após o assento, polarizam e se tornam móveis logo após estender os nano podos à frente de seu caminho de movimento. Conforme demonstrado nessas imagens, o indivíduo isolado H-U-V-E-C geralmente mostrará uma morfologia claramente polarizada com projeções de f actina na periferia celular embutidas dentro do nano podia PC três células exibirão uma morfologia polarizada com seus nano podódios revelando o caminho do movimento de três células PC. Se as células estão no estado de divisão celular, como visto aqui em uma divisão H-U-V-E-C, o nano podia firmemente ligado à matriz através de TM E e permite que a actina F se estenda ou retraia dentro do nano podia.As interações intercelulares que levam à formação da junção celular também são comumente observadas por meio de temperaturas abaixo do ideal dos nanopodos, conforme mostrado nesses exemplos, usando a fixação de PFA de quatro graus Celsius e a lavagem a frio de PBS perturbará e destruirá a estrutura dos nano podes em células polarizadas. No PFA frio e no PBS frio, as células em proliferação não terão pódios e, portanto, será observada uma retração da actina dentro dos nanopódios. E as lacunas nas junções intercelulares serão produzidas artificialmente, pois os nano podos são projeções finas e longas de membrana que se ligam à matriz extracelular por meio de agrupamento.A intensidade agrupada provavelmente precisará ser aprimorada por meio das funções de brilho e contraste no software de processamento de imagem para revelar o caminho do movimento celular através de resíduos nano podia. Como foi feito na inserção desta imagem aqui, H-U-V-E-C que foram cultivados por seis horas após o plaqueamento a uma fluência de 60% de co em um disco de vidro revestido de colágeno e, em seguida, fixados em 37 graus Celsius, 4% PFA como acabamos de demonstrar são mostrados nesta imagem. Os nano pódios foram revelados com anticorpo anti CD nove e F actina foi corada com Phin demonstrando que o CD nove também se localiza nos nano pódios.Seguindo o procedimento. Outros métodos, como citometria de fluxo no sangue ocidental, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como, como certos tratamentos influenciam os níveis de expressão de TM quatro SF um e, assim, afetam a proliferação do movimento celular e as interações intracelulares. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a sustentação imunocongelada para estudar o papel dos nano podia no movimento celular e nas interações intercelulares.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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