Uma rápida e específica de microplaca de ensaio para a determinação de ascorbato intra-e extracelular em células cultivadas

O objetivo geral do experimento a seguir é determinar os níveis de ascorbato intracelular ou extracelular em células cultivadas ou isoladas. Isso é obtido incubando extratos de células ou células inteiras com uma escore oxidase para esgotar seletivamente uma escore BA nas etapas subsequentes. No primeiro método, os extratos celulares são incubados com cianeto para gerar cianeto de ferro de maneira dependente do ascorbato, o que dá uma representação direta da quantidade de ascorbato nos extratos.

Em seguida, a quantidade de cianeto de ferro formada nos extratos celulares é determinada pela oxidação quantitativa do cianeto de ferro com ferro férrico adicionado para formar ferro-gigante, a fim de gerar um complexo cromogênico de ferro e duas samambaias S que pode ser quantificado espectrometricamente. No segundo método, todas as células são incubadas diretamente com o ferro, dois quelantes ferne S e citrato férrico. Os resultados mostram diferenças nos níveis de ascorbato intracelular ou extracelular com base na redução quantitativa e específica dos complexos de ferro extracelulares que podem ser detectados.

Espectros metricamente. A principal vantagem da técnica atual sobre os métodos que já estão em vigor, como a detecção baseada em HBLC, é que este ensaio de microplaca altamente específico pode ser realizado muito rapidamente e todas as amostras e padrões podem ser processados em paralelo, em vez de em série, antes de iniciar este procedimento. Cultivar células em suspensão K 5 62 e criar em um escore BA contendo extrato celular.

Em seguida, prepare uma solução estoque de ácido ascórbico 10 milimolar em PBS gelado. Em seguida, prepare cuidadosamente uma série de padrões de ascorbato entre zero e 20 micromolares. Remova cuidadosamente quatro alíquotas de 100 microlitros de cada padrão e adicione-as a uma sequência horizontal de poços.

Em uma placa de fundo plano de 96 poços que contém 25 microlitros por poço de PBS ou 45,5 unidades por mililitro. A solução de estoque de L ascorbato oxidase ou AO em PBS cobre a placa de 96 poços com folha e orbital. Misture a 550 RPM em temperatura ambiente por cinco minutos.

Quando terminar, adicione 50 microlitros de cianeto de potássio 3,5 milimolares em PBS a todos os poços para obter uma concentração final de cianeto de Ferris de um milimolar após a mistura orbital da placa de 96 poços, usando as mesmas condições de antes. Adicione imediatamente 25 microlitros de uma solução recém-construída contendo 50% de ácido acético e 30% de ácido tricloroacético. Em seguida, adicione 100 microlitros de uma solução de determinação de cianeto do Faraó recém-preparada a cada orbital de poço.

Misture o prato no escuro a 550 RPM por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, leia os valores de absorbância dos poços em 593 nanômetros. Para iniciar o ensaio.

Primeiro, oxide o ascorbato extracelular em poços selecionados, adicionando 50 microlitros de 120 unidades por mililitro AO ou HBSD a poços emparelhados em triplicata para dar uma concentração final de AO de 10 unidades por mililitro. Seguindo esse rótulo, os poços emparelhados são menos AO e mais ao. Depois de misturar as placas com mistura orbital suave por cinco minutos a 37 graus Celsius, adicione 50 microlitros de Ferne S de 2,4 milimolares a todos os poços para obter uma concentração final de Ferne S de 200 micromolares, misture as placas como acima por cinco minutos a 37 graus Celsius.

Em seguida, adicione 50 microlitros de citrato férrico de 120 micromolares recém-preparado a todos os poços para obter as concentrações finais de ferro e citrato de 10 micromolares de ferro e 50 micromolares, respectivamente. Misture bem no final do ensaio de ascorbato FLX. Aspire rapidamente o meio sobrejacente de cada poço e adicione aos poços devidamente marcados em uma placa de 24 poços.

Em seguida, adicione três alíquotas de microlitros do sobrenadante a uma placa de 96 poços para determinar o ascorbato extracelular. Leia os valores de absorbância dos poços em 593 nanômetros em um espectrofotômetro de microplacas. Finalmente, calcule a quantidade de ascorbato extracelular como m ascorbato por miligrama de proteína mostrada.

Aqui está uma curva padrão típica para um conjunto de padrões de ascorbato, zero a 20 micromolares ou zero a dois ascorbato NMO por poço. Da placa de 96 poços, embora não mostrada aqui, a linearidade é mantida até oito ascorbato NMO por poço, o que corresponde a uma concentração de ascorbato de amostra de cerca de 80 micromolares. O ensaio pode ser usado para detectar com sucesso níveis de ascorbato abaixo de 0,25 ole ascorbato por poço.

As células K 5 62 acumulam rapidamente ascorbato intracelular do ácido ascórbico L desidróbico extracelular, mas não o ascorbato. Neste experimento representativo, as células K 5 62 lavadas com PBS foram incubadas em PBS com 500 micromolares de ascorbato, ácido desidróbico L, ácido ascórbico desidróbico L mais 50 micromolares de cito B, ascorbato mais cianeto cinco milimolares ou ascorbato mais 50 unidades por mililitro AO por 30 minutos a 37 graus Celsius. O ascorbato intracelular foi determinado conforme descrito anteriormente.

A captação de ácido ascórbico de desidro L pelas células K 5 62 ocorre por transporte mediado por glúteos do transportador de glicose facilitador para avaliar o envolvimento dos glúteos na absorção de ácido ascórbico de desidro L. Neste experimento representativo, as células K 5 62 foram incubadas com concentrações crescentes de cito B ou diidrocitolito B antes da incubação com ácido ascórbico desidratado L. É importante notar que, embora tanto a cito calina B quanto a diidrocitolicita B inibem processos móveis em concentrações micromolares, apenas a citocalina B, que difere da diidrocitolina B pela presença de uma única ligação dupla, inibe o transporte dependente dos glúteos em baixas concentrações micromolares.

Portanto, como o desidratador L, a absorção de ácido ascórbico foi inibida pelo citoB com um IC 50 inferior a 2,5 micromolar, mas não foi inibida pelo diidrocitocito. B dehydro. A captação de ácido ascórbico provavelmente ocorre por transporte mediado por glúteos.

Alternativamente, as células lavadas foram expostas a concentrações crescentes do glúteo transportável, mas não metabolizável glicose análogo três O metil D glicose ou o não glúteo transportável glicose estereo isômero L glicose durante a incubação com ácido ascórbico desidro L. Novamente, os resultados indicam o envolvimento do glu na importação de ácido ascórbico L desidratado, pois a inibição do acúmulo de ascorbato intracelular ocorre apenas na presença do análogo de glicose transportável do glúteo. No segundo ensaio.

A taxa de efluxo de ascorbato das células cultivadas pode ser determinada. Este ensaio específico é importante, pois a liberação de ascorbato das células parece ser crucial para a captação celular regulada pelo ascorbato de ferro não ligado à transferrina pelas células. A captação de ferro não ligado à transferrina é considerada relevante para a fisiopatologia dos distúrbios de sobrecarga de ferro, como a hemocromatose, bem como para a troca de ferro e homeostase dos neurônios dos astrócitos no cérebro de mamíferos.

De fato, o principal neurotransmissor excitatório L glutamato desencadeia a liberação de ascorbato para astrócitos de uma maneira que depende do L glutamato, captação pelo vidro e provavelmente GLT um e subsequente inchaço celular que desencadeia a liberação de ascorbato por VSOs putativos. Em analogia, a liberação de A score bate de astrócitos carregados com A score B pode ser estimulada pelo aminoácido excitatório L aspartato, mas não pelo aminoácido não excitatório L glutamina. Este efeito é descrito aqui, que mostra curvas de resposta à dose para a estimulação da liberação de ascorbato por aspartato e glutamina de culturas primárias de astrócitos de camundongos carregados com ascorbato Uma vez dominados.

Esta técnica pode ser realizada em menos de duas horas se realizada corretamente.