Name: Preparação de ADN de poliacrilamida reticulada-hidrogéis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Aprenda a preparar hidrogéis de poliacrilamida reticulados com ADN para estudar a rigidez tecidual e o comportamento celular. Este método permite modular dinamicamente a elasticidade do substrato para investigações em biomateriais.

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Os autores gostariam de agradecer: Dr. Frank Jiang, Dr. David Lin, Dr. Bernard Yurke e Dr. Uday Chippada por suas contribuições sobre o desenvolvimento da tecnologia do gel de DNA; Dr. Norell Hadzimichalis, Smit Shah, Kimberly Peterman, Robert Arter pelos seus comentários e edições deste manuscrito; fontes de financiamento, incluindo a Comissão Jersey New on Spinal Cord Research (Grant # 07A-019-SCR1, NAL) e New Jersey Institute Neuroscience (MLP); e editores de Engenharia de Tecidos, Parte A permissão para reimprimir Figuras 2 e 4 e Biomateriais permissão para reimprimir figura 3.

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A capacidade dos geles de ADN para amolecer ou endurecer antes e após a adesão das células torna-os um modelo ideal para estudar o papel da rigidez do tecido dinâmico em função da célula. Todos os três modelos têm sido utilizados em estudos biológicos e mecânicos. No entanto, todos os três modelos têm elasticidade semelhantes em várias percentagens de reticulação, que indica o comprimento de reticulação não influenciar a elasticidade de gel do DNA (Tabela 2). Em contraste, a concentração de acrilamida a...

Substratos estáticos e dinâmicos são duas categorias de biomateriais que foram desenvolvidas para estudar os efeitos de elasticidade do tecido, ou em função da rigidez das células. Substratos estáticos são incapazes de alterar as suas propriedades físicas depois de serem fabricadas e / ou uma vez as células são banhados. Poliacrilamida (PA) foram os primeiros géis bidimensionais substratos, estáticas que foram sintetizadas para investigações mechanobiology 5,17. Geles PA são fáceis de preparar, barato, versátil e pode ser fabricado com uma ampla gama de módulos elásticos. Embora essas vantagens técnicas fazem PA géis um substrato comumente aplicado, substratos estáticas não são indicativos da natureza dinâmica da matriz extracelular (MEC) e ao ambiente circundante celular in vivo. Por exemplo, a rigidez ECM sofre alterações em resultado de ferimento, de desenvolvimento, ou doença. Substratos dinâmicos são, portanto, preferidas como substratos modelo mimetizando a tecidos em estudos mechanobiology <sup&gt; 22,24,25. Numerosos sintético, Bidimensional biomateriais, tridimensionais, estáticos e dinâmicos naturais têm sido desenvolvidos para imitar rigidez tecidual 1,3,6,16,23,26. Alguns substratos dinâmicas exigem calor, UV, corrente elétrica, os íons, e mudanças de pH de alterar as suas propriedades mecânicas 2,4,7,8,12,15,16, mas esses estímulos podem restringir bio-aplicação do hidrogel. Hidrogeles de poliacrilamida reticulada-DNA (DNA) são géis elásticos substratos bidimensionais dinâmicas. Ligações cruzadas de DNA permitem a modulação temporais, espaciais, e reversível da rigidez gel DNA pela adição de DNA de fita simples (ssDNA) para mídia ou buffer 9-11,13,14,18,21. Ao contrário dos géis dinâmicas acima mencionados, onde são aplicados estímulos para modulação de elasticidade, os géis de DNA contam com a difusão de ADNcs aplicada para a alteração da elasticidade. Por conseguinte, a superfície superior de gel, em que as células são cultivadas, é a primeira área modulada, porque a taxa de omodulação f elasticidade está dependente da espessura do gel. Geles de DNA são semelhantes aos seus homólogos gel PA na medida em que têm uma espinha dorsal de poliacrilamida, no entanto, as ligações cruzadas de bis-acrilamida substituída com ligações cruzadas são compostos por ADN (Figura 1). Dois ssDNAs (SA1 e SA2) hibridar com uma cadeia reticulador (L2) para compensar as ligações cruzadas de DNA do gel. SA1 e SA2 têm seqüências distintas que ambos contêm uma modificação Acrydite no final 5 &#39;para a incorporação efetiva na rede PA. Para a preparação do gel, SA1 e SA2 são polimerizados, individualmente, em uma espinha dorsal PA e, subsequentemente, o SA1 polimerizada e SA2 são misturados em conjunto. L2, o agente de reticulação, é adicionado à mistura de SA1 e SA2. A sequência de bases é complementar a L2 ambas as sequências SA1 e SA2 e L2 hibrida com SA1 mais SA2 para formar as ligações cruzadas de DNA. Inicial, a elasticidade de gel de ADN é determinada por ambas as concentrações de L2 e de reticulação (Tabelas 1 </strong&gt; e 2). Geles de ADN que contenham quantidades estequiométricas iguais de L2, AE1, AE2 e os géis são mais duras, porque SA1 e SA2 são 100% reticulado por L2 (designado como 100% de gel). Baixas concentrações do resultado L2 em uma menor percentagem de reticulação DNA e, portanto, géis de DNA mais suave. Géis tão baixas como 50% reticulado (designado como 50% de gel) 9-11 foram construídas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/51323/51323fig1highres.jpg" /> A Figura 1 de reticulação de gel do DNA e uncrosslinking esquemática 9-11,13,14,18,21 Etapa 1:. SA1 (vermelho) e SA2 (azul) são polimerizados, individualmente, em uma espinha dorsal de poliacrilamida (preto). Após a polimerização, as soluções polimerizados SA1 e SA2 são misturados em conjunto. Passo 2: L2 (verde) é adicionado e hibrida com SA1 mais SA2 para formar as ligações cruzadas do gel. Passo 3: R2 hibrida com tele toehold de L2. Passo 4: hibridização toehold de R2 impulsiona a descompactação de L2 de SA1 e SA2. Ao contrário dos géis PA, géis de DNA pode endurecer e amaciar após a síntese. Por essa razão, as células cultivadas em géis de ADN pode ser submetido a alterações de rigidez dinâmica. Para endurecer géis de células aderentes, L2 pode ser adicionado ao meio de cultura de baixo géis percentuais, para aumentar a percentagem de ligações cruzadas. Para suavizar a géis de células aderentes, L2 podem ser removidas para reduzir a percentagem de ligações cruzadas 10,13,21. L2 tem uma sequência de ponto de apoio adicional na extremidade 3 &#39;para permitir a L2 uncrosslink de SA1 e SA2 (Tabela 1). Remoção de L2 é realizado através de hibridação de um fio chamado inversão R2. R2 é complementar ao comprimento total de L2 e hibrida com o primeiro ponto de apoio L2. Toehold hibridação impulsiona a descompactação de L2 de SA1 e SA2, que elimina a ligação transversal e reduz a rigidez do gel. Neste relatório evídeo, passo-a-passo as instruções são fornecidas para a preparação de endurecimento e amolecimento géis de DNA. Embora 100% e de 80% as preparações de gel são descritas, este protocolo pode ser adaptada para criar ADN de géis reticulados outras percentagens iniciais e finais. Em geral, 100% e 80% de gel são preparadas, imobilizada em lamelas de vidro, funcionalizada, e semeadas com células. L2 é adicionado à media de 80% de gel e R2 é adicionado aos meios de comunicação de 100% de gel, 48 horas após o plaqueamento. A adição de meios de L2 para endurece 80% de gel de ligação cruzada a 100%, ao passo que a adição de R2 a mídia amolece a 100% de gel de 80% de ligações cruzadas. Geles endurecidos são designados como 80 → 100% de gel e geles suavizados são designados como 100 → 80% de gel no texto. Para o controlo ou géis estáticos, ADNcs ou consistindo em Ts Como é entregue a outro conjunto de 100% e 80% de gel. Depois de um mínimo de dois dias seguintes modulação elasticidade, as células podem ser processados ​​e analisados. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody align="center"><tr><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"> Reticulação DNA </td><td rowspan="2"> # De bases </td><td> Sequence (ponto de apoio) </td><td rowspan="2"> Modificação </td><td rowspan="2"> A temperatura de fusão (T m, ° C) </td><td rowspan="2"> Comentários </td></tr><tr><td> 5 &#39;→ 3&#39; </td></tr><tr><td rowspan="4"> Projeto 1 </td><td> SA1 </td><td> 10 </td><td> GCA CCT TTG C </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 34,9 </td><td></td></tr><tr><td> SA2 </td><td> 10 </td><td> GTC AGA ATG A </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 23,6 </td><td></td></tr><tr><td> L2 </td><td> 30 </td><td> TCA TTC TGA C GC AAA GGT GC G CTA CAC TTG </td><td></td><td> 56 </td><td>Uma sequência de 10 pb toehold está incluído. </td></tr><tr><td> R2 </td><td> 30 </td><td> CAA GTG TAG CGC ACC TTT GCG TCA GAA TGA </td><td></td><td></td><td> R2 é complementar a L2 </td></tr><tr><td rowspan="4"> Projeto 2 </td><td> SA1 </td><td> 14 </td><td> CGT GGC ATA GGA CT </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 46.9 </td><td></td></tr><tr><td> SA2 </td><td> 14 </td><td> GTT TCC CAA TCA GA </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 40,2 </td><td></td></tr><tr><td> L2 </td><td> 40 </td><td> TCT GAT TGG GAA AC A GTC CTA TGC CAC G GT TAC CTT CAT C </td><td></td><td> 65.9 </td><td> A seqüência toehold 12 bp está incluído. </td></tr><tr><td> R2 </td><td> 40 </td><td> GAT GAA GGT AAC CGT GGC ATA GGA CTG TTT CCC AAT CAG A </td><td></td><td> 65.9 </td><td> R2 é complementar a L2 </td></tr><tr><td rowspan="3"> Design 3 </td><td> SA1 </td><td> 20 </td><td> ACG GAG GTG TAT GCA ATG TC </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 55 </td><td></td></tr><tr><td> SA2 </td><td> 20 </td><td> CAT GCT TAG GGA CGA CTG GA </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 56.6 </td><td></td></tr><tr><td> L2 </td><td> 40 </td><td> TCC AGT CGT CCC TAA GCA TG G ACA TTG CAT ACA CCT CCG T </td><td></td><td> 68.8 </td><td> Ponto de apoio não está incluído. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Controle </td><td rowspan="2"> Controle </td><td rowspan="2"> 20-40 </td><td> AAA AAA (etc.) ou </td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td></tr><tr><td> TTT TTT (etc.) </td></tr></tbody></table> Tabela 1. seqüências de bases para ssDNA 9-11,13,14,18,21. Celular e estudos mecânicos têm utilizado vários dmodelos de reticulação iferentes para gerar géis de ADN com uma variedade de propriedades mecânicas estáticas e dinâmicas. Os parâmetros modulados em design de reticulação são sequência de bases de comprimento e sequência ou comprimento de reticulação. Fontes em negrito e itálico ilustrar o pareamento de bases entre SA1 e L2 e entre SA2 e L2, respectivamente. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody align="center"><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="8"> Projeto </td></tr><tr><td colspan="3"> 1 </td><td colspan="3"> 2 </td><td colspan="2"> 3 </td></tr><tr><td> Concentração de acrilamida (%) </td><td colspan="3"> 10 </td><td colspan="3"> 10 </td><td> 10 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> SA1 mais SA2 hibridado com L2 (% reticulado) </td><td> 50 </td><td> 80 </td><td> 100 </td><td> 50 </td><td> 80 </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> &lt;strong&gt; Elasticidade (kPa, média ± SEM) </td><td> 6,6 ± 0,6 </td><td> 17,1 ± 0,8 </td><td> 29,8 ± 2,5 </td><td> 5,85 ± 0,62 </td><td> 12,67 ± 1,33 </td><td> 22,88 ± 2,77 </td><td> 25,2 ± 0,5 </td><td> 10,4 ± 0,6 </td></tr></tbody></table> Tabela 2 o módulo de Young (E) de geles de ADN. 9-11,13,14,18,21 concentração de acrilamida, percentagem de ligações cruzadas, e comprimento de ligação transversal pode ser modulada em geles de ADN. Designs 1, 2 e 3 têm 20, 28 e 40 pb comprimentos de ligação transversal, respectivamente. 100% de gel para todos os projetos têm módulos semelhantes indicando comprimento reticulação não afeta a elasticidade gel. No entanto, as variações na concentração de acrilamida alterar a elasticidade em gel de ADN.

<table><tbody><tr><td>ssDNA</td><td>Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) idtdna.com</td><td></td><td>Não vórtice ssDNA. Inverta suavemente o frasco para injetáveis e/ou a solução de pipeta para misturar.</td></tr><tr><td>PBS com cálcio e magnésio</td><td></td><td></td><td>Qualquer marca.</td></tr><tr><td>100x tampão Tris-EDTA (tampão TE)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) sigmaldrich.com</td><td>T9285</td><td></td></tr><tr><td>10x tampão Tris-Borato-EDTA (tampão TBE)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td><td>93290</td><td>TBE é uma toxina reprodutiva.</td></tr><tr><td>Solução de acrilamida a 40%</td><td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA)</td><td>BP14021</td><td>A acrilamida é uma toxina.</td></tr><tr><td>Persulfato de amônio (APS)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td><td>A3678</td><td>Prepare uma solução a 2% em tampão TE. APS é uma toxina e irratante.</td></tr><tr><td>Tetrametiletilenodiamina (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td><td>T9281</td><td>Prepare uma solução a 20% em tampão TE. TEMED é inflamável, corrosivo e toxina.</td></tr><tr><td>Tampa de lamínula redonda de 12 mm de diâmetro</td><td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA) fishersci.com</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo óptico Norland</td><td>72 Norland Products (Cranbury, NJ) norlandprod.com</td><td>NOA72</td><td></td></tr><tr><td>Placa</td><td></td><td></td> de cultura de tecidos de 24 poços <td>Qualquer marca.</td></tr><tr>Tubos de <td></td><td></td><td>microcentrífuga</td><td>Qualquer marca.</td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>ProteoChem ou Thermo Fisher, (Rockland, IL) proteochem.com ou thermofisher.com</td><td>C111 ou 22589</td><td>Prepare uma solução de 0,315 mg/ml em água imediatamente antes de usar. Dissolva a 37 > C e esterilizar por filtro. É normal observar sulfo-SANPAH não dissolvido no filtro. Sulfo-SANPAH é sensível à luz e, portanto, a solução deve ser protegida da luz até a exposição aos raios UV.</td></tr><tr><td>Poli-D-lisina (PDL)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td><td>P6407</td><td>Prepare uma solução de 0,2 mg/ml em água e filtre e esterilize.</td></tr><tr><td>Affymetrix de colágeno tipo I</td><td>(Santa Clara, CA) affymetrix.com</td><td>13813</td><td>Prepare uma solução de 0,2 mg/ml em ácido acético 0,2 N. A solução precisa permanecer fria o tempo todo para evitar a polimerização. O ácido acético é inflamável, tóxico e corrosivo.</td></tr><tr><td>Tampa de vidro 22 x 60</td><td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA)</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de deslocamento positivo</td><td>Gilson, Inc (Middletown, WI) gilson.com</td><td>F148504</td><td></td></tr><tr><td>Bloco de calor</td><td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA)</td><td>11-718</td><td></td></tr><tr><td>Fonte</td><td></td><td></td> de luz UV <td>Coloque os géis o mais próximo possível da luz UV. A luz UV pode causar lesões na pele ou nos olhos.</td></tr><tr><td>Termômetro</td><td></td><td></td><td>Qualquer marca.</td></tr><tr><td>Gás nitrogênio</td><td>GTS-Welco (Flemington, NJ) www.praxairmidatlantic.com/</td> <td>NI 5.0UH-R</td><td></td></tr></tbody></table>

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Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Mechanobiology é uma área científica emergente que aborda o papel crítico de pistas físicas em dirigir a morfologia ea função das células. Por exemplo, o efeito da elasticidade do tecido em função celular é uma importante área de pesquisa por causa da rigidez do tecido mechanobiology modula com a doença, o desenvolvimento, e a lesão. Materiais imitando tecido-estática, ou materiais que não podem alterar a rigidez vez células são banhados, são predominantemente utilizados para investigar os efeitos da rigidez do tecido sobre as funções celulares. Embora as informações recolhidas a partir de estudos estáticos é valiosa, esses estudos não são indicativos da natureza dinâmica do microambiente celular in vivo. Para melhor enfrentar os efeitos da rigidez dinâmica em função das células, foi desenvolvido um sistema de poliacrilamida hidrogel reticulado-DNA (géis de DNA). Ao contrário de outros substratos dinâmicos, géis de DNA tem a capacidade de aumentar ou diminuir a rigidez após a fabricação, sem estímulos. Geles de ADN consistem de ADN crosslAs tintas que são polimerizados em uma espinha dorsal de poliacrilamida. Adição e remoção de ligações cruzadas através da entrega de DNA de fita simples permite temporais, espaciais e controle reversível da elasticidade gel. Temos demonstrado em relatórios anteriores que a modulação de elasticidade dinâmico gel DNA influencia o comportamento de fibroblastos e neurônio. Neste relatório e vídeo, nós fornecemos um esquema que descreve os mecanismos de reticulação do gel de DNA e instruções passo-a-passo sobre os géis de preparação de DNA.

Antes de nossos estudos, interações célula-ECM foram observados em biomateriais compatíveis estáticas ou dinâmicas em substratos irreversíveis e unidirecionais. Estes substratos não refletem com precisão a natureza dinâmica do microambiente celular. Nosso trabalho muda os paradigmas técnicos existentes, fornecendo um modelo mais fisiológico para estudar as interações célula-ECM no amolecimento e endurecimento biomateriais dinâmicos. Em estudos anteriores, foram analisados ​​os efeitos de substratos dinâmicos em células ...

O nosso laboratório desenvolveu hidrogéis de poliacrilamida reticulada-ADN, um sistema dinâmico de hidrogel, para compreender melhor os efeitos da modulação da rigidez do tecido sobre a função das células. Aqui, nós fornecemos esquemas, descrições e protocolos para preparar estes hidrogéis.

Preparação de ADN de poliacrilamida reticulada-hidrogéis

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...

O objetivo geral deste procedimento é preparar hidrogéis de poliacrilamida com DNA reticulado que possam tornar-se mais rígidos ou mais macios mediante a pipetagem de DNAs de fita simples no meio de cultura após o plaqueamento celular. Isso é realizado primeiramente pela ressuspensão de DNA de fita simples liofilizado SA um, SA dois L dois R dois e controles em tampão, seguida da polimerização individual das soluções SA um e SA dois em um esqueleto de poliacrilamida. O segundo passo consiste em misturar as soluções polimerizadas SA um e SA dois com a solução L dois para formar o gel de DNA.Em seguida, a solução de gel de DNA é imobilizada em lamínulas de vidro com cola óptica. O passo final consiste em funcionalizar os géis tratando-os com sul sampa e, depois, com PDL. Por fim, as células são semeadas sobre os géis de DNA e a elasticidade do gel é modulada pela adição de R dois L dois ou de DNA de fita simples controle, para suavizar, endurecer ou não alterar a elasticidade do gel, respectivamente.Os resultados desses experimentos mostram que a natureza dinâmica do substrato subjacente direciona o comportamento celular. A vantagem do uso dessa técnica em comparação com outros métod

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nós apresentamos os protocolos para o 3-dimensional encapsulamento (3D) de células dentro de hidrogéis sintéticos. O procedimento de encapsulamento é descrito por dois métodos comumente utilizados de reticulação (michael tipo adição e light-iniciado livre mecanismos radical), bem como uma série de técnicas para avaliar o comportamento das células encapsuladas.

O encapsulamento celular em Hidrogéis 3D para Engenharia de Tecidos

O efeito da rigidez substratos em função celular podem ser...

Estudando os efeitos da rigidez Matrix em função celular usando acrilamida baseado Hidrogéis

Neste vídeo, demonstramos as técnicas experimentais usadas para fabricar compliant, matriz extracelular (ECM) substratos revestidos adequado para cultura de células, e que são passíveis de microscopia de força de tração e observando os efeitos da rigidez ECM no comportamento de células.

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Apresentamos um novo hidrogel de poliacrilamida, chamada hidroxi-PAAm, que permite uma ligação direta das proteínas da MEC com custo ou experiência mínima. A combinação de hidroxi-PAAm hidrogéis com impressão microcontact facilita o controlo independente das muitas pistas de o microambiente celular natural para estudar mechanostransduction celular.

Preparação de Hidroxi-PAAm hidrogéis para dissociar os efeitos de Mecanotransdução Sugestões

Rigidez mecânica no microambiente tumoral desempenha um papel crucial na condução de comportamento maligno, aumentando a atividade invadopodia e actomiosina contratilidade. Usando géis de poliacrilamida (PaaS), invadopodia e força de tração ensaios podem ser utilizados para estudar as propriedades invasivas e contrátil das células cancerosas em resposta a matriz rigidez.

Géis de poliacrilamida para Invadopodia e Tração Força Ensaios sobre as células cancerosas

Aqui, é descrito um método que permite a preparação rápida, eficiente e barata de géis de poliacrilamida em um formato de placa multipoços. O método não requer nenhum equipamento especializado e pode ser facilmente adotado por qualquer laboratório de pesquisa. Seria particularmente útil em pesquisas focadas na compreensão das respostas celulares dependentes da rigidez.

Simples Multiwell Rigidez Ensaio para o Estudo das respostas das células Rigidez dependentes base de poliacrilamida

diferenciação celular é regulada por uma série de fatores do microambiente, incluindo ambas as propriedades da composição da matriz e material de substrato. Descrevemos aqui uma técnica utilizando microarrays de células em conjunto com microscopia de força de tracção para avaliar tanto a diferenciação de células e as interacções célula-substrato biomecânicas como uma função do contexto microambiental.

Um de alta capacidade: Plataforma celular Microarray para Análise correlativa da diferenciação celular e forças de tração

Este protocolo descreve a caracterização da síntese de DNA polimerase do ADN modificado através da observação de alterações para o infravermelho próximo fluorescente etiquetada DNA usando electroforese em gel e gel de imagem. Géis de acrilamida são utilizados para geração de imagens de alta resolução da separação de curtos ácidos nucleicos, que migram em taxas diferentes dependendo do tamanho.

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Tradicionalmente a fatia vertical e toda a preparação para montagem da retina têm sido usados ​​para estudar a função dos circuitos da retina. Aqui, descrevemos a novela corte método para preservar a morfologia dendrítica de neurônios da retina intacta.

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Preparação de Dissociated rato Culturas Neuron Cortical

Aprenda a preparar hidrogéis de poliacrilamida reticulados com ADN para estudar a rigidez tecidual e o comportamento celular. Este método permite modular dinamicamente a elasticidade do substrato para investigações em biomateriais.

Preparação de ADN de poliacrilamida reticulada-hidrogéis

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