Name: Um fluxo de Adesão Ensaio para o Estudo de Recrutamento de leucócitos para hepáticas humanas senoidais endotélio sob condições de estresse de cisalhamento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-21T15:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Aprenda a estudar o recrutamento de leucócitos através de células endoteliais hepáticas humanas sob estresse de cisalhamento fisiológico. Este método utiliza microscopia de contraste de fase para analisar interações celulares e identificar alvos terapêuticos para doenças inflamatórias crônicas do fígado.

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1. MicroSlide Preparação <ol><li> Precoat uma microlâmina de seis canais com cauda de rato de colagénio tipo I (RTC, diluído 1:100 em PBS dar uma diluição de trabalho de 220 ug / ml). Isto é realizado através da injecção de 30 ul de solução RTC diluída directamente para dentro dos canais e incubando durante 2 horas a 37 ° C, seguido de três lavagens com PBS. </li></ol> 2. Semeando Células em Microslides <ol><li> Dissociar um frasco confluente T75 de células hepáticas humanas cultivadas sinusoidais endoteliais (HSEC) (isolado a partir de tecido do fígado, tal como descrito anteriormente 13) em tripsina-EDTA, lavar em PBS, e ressuspender em 3 x 10 6 células / ml em meio completo (endoteliais humanas meio basal suplementado com 2 mM de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina e estreptomicina 100 ug, 10% inactivado pelo calor de soro AB humano, 10 ng / ml de factor de crescimento endotelial vascular e 10 ng / ml de factor de crescimento de hepatócitos). Injetar 30 mL de suspensão de células nefastasctly em cada canal. </li><li> Deixar as células aderir durante 1 hora numa incubadora humidificada a 37 ° C, com uma atmosfera de CO 2 a 5% em um rack de slide. Depois de permitir que as células a aderir preencher as portas de ambos os lados de cada canal com meio completo (Figura 1). </li></ol> 3. Citocinas estimulação das células <ol><li> Deixar as células na incubadora durante 24 horas. Avaliar o crescimento das células utilizando um microscópio de contraste de fase invertida. 24 horas antes do ensaio de ades, estimular as monocamadas endoteliais com citocina através da substituição do meio de crescimento com meio completo suplementado com factor de necrose tumoral alfa e interferão gama, ambos a 10 ng / ml. </li></ol> 4. Isolamento de Linfócitos do Sangue Periférico <ol><li> Isolar os linfócitos de sangue periférico a partir de sangue total por inicialmente purificar a fracção mononuclear por centrifugação em gradiente de densidade sobre uma mídia de centrifugação de separação de células apropriado durante 25 min a 800x g. Incubar as células em plástico durante 1 hora para permitir a aderência de monócitos. </li><li> Após a adesão ao aspirado de plástico a linfócitos enriquecida sobrenadante. Lave os linfócitos e ressuspender-los (tipicamente 1 x 10 6 células / ml em meio de fluxo (meio basal endotelial contendo 0,1% (v / v) de albumina de soro bovino (BSA)). </li></ol> 5. O pré-tratamento do endotélio ou leucócitos com Inibidores <ol><li> Preparar diluições recomendadas de anticorpos de bloqueio da função ou inibidores de moléculas pequenas em endotelial media/0.1% (v / v) de BSA. Substituir meio completo com bloqueio de solução de anticorpo / canal de inibidor na microlâmina escolhido 30 min antes do ensaio a fluir. </li><li> Quando o pré-tratamento de receptores de quimiocina em linfócitos são planeados, ressuspender leucócitos isolados em solução de RPMI contendo 0,1% (v / v) de BSA e incubar com 200 ng / ml de toxina da tosse convulsa para bloquear a actividade do receptor acoplado à proteína G dos receptores de quimiocinas, em alternativa diluir específico funçãoanticorpos bloqueadores ou inibidores de moléculas pequenas de receptores de quimiocina, na diluição recomendada. Incubar leucócitos a 37 ° C durante 30 min, em seguida lavar e ressuspender em meio de fluxo. </li></ol> 6. Configuração do Fluxo de Ensaio Sistema <ol><li> Pré-aquecer uma câmara transparente com termóstato a 37 ° C. A câmara deve ter portas para a inserção do tubo de silicone e fornecimento eletrônico de uma válvula solenóide eletrônico que permite a comutação entre as células e meios de comunicação praticamente sem volume morto. A câmara é montada num microscópio invertido para permitir a microscopia de contraste de fase. Figura 2 mostra a câmara de ensaio de fluxo e microscopia e microlâmina colocado na platina do microscópio. </li><li> Prefill uma seringa de vidro de 50 ml com um luer lock com 10 ml de água destilada estéril e anexar um comprimento de tubagem de silicone de 25 centímetros para o orifício de seringa. Coloque em uma bomba de seringa. Alterar a taxa de retirada da bomba de seringa de acordo com ainstruções do fabricante da microlâmina para manter uma tensão de corte de 0,05 Pa (0,5 dine / cm 2, a Figura 3). </li><li> Tome duas seringas de 5 ml, descarte os êmbolos e anexar os barris para os dois portos em fluxo de uma válvula solenóide eletrônico usando tubo de silicone. <ol><li> Anexar 12 cm de tubo de silicone para a válvula de fluxo de saída. A válvula permite a alternância entre um tampão de lavagem de células livres (endotelial media/0.1% (v / v) de BSA) e a suspensão de linfócitos. </li><li> Lave a válvula solenóide eletrônica através da inserção de tampão de lavagem em ambas as seringas e garantindo tampão está fluindo a partir de um barril através da válvula e no tubo de silicone para fora do fluxo. </li><li> Utilizar o interruptor de válvula para alternadamente para o outro tambor e assegurar o tampão está a fluir, e que todas as bolhas são removidas do sistema. Remover o tampão de lavagem a partir de um dos tambores e substitua com linfócitos suspensão Figura 4a. </li></ol></li><li> Conecte o tubin siliconeg a partir da bomba de seringa a uma porta de um canal microlâmina escolhido por meio de um adaptador de microlâmina. Em seguida, conecte o tubo de silicone da válvula de saída para a porta oposta através de um adaptador MicroSlide. Certifique-se de que a tubagem de silicone e as placas são preenchidos com tampão de lavagem antes da ligação para evitar as bolhas de ar que entra no sistema (Figura 4b). </li><li> Uma vez conectado ao sistema de fluxo, coloque o MicroSlide no palco microscópio e prenda com grampos ou fita adesiva para impedir o movimento. Definir o microscópio para a objectiva 10X em conjunto com a configuração de fase adequado. Assegurar a monocamada endotelial é visualizado e em usar o foco da lente ocular. Assegurar as imagens podem ser capturadas através de uma câmara que é ligada ao microscópio em que as imagens podem ser retransmitido para um monitor e registada. </li></ol> 7. Fluxo Técnica de Ensaio e Gravação de Adesão para Análise <ol><li> Perfundir a camada endotelial com tampão de lavagem por 2 min, dando início withdrawal da bomba de seringa para remover quaisquer detritos ou anticorpo de bloqueio não acoplado e depois mudar a válvula para permitir que um bolus de 5 minutos uma solução de leucócitos com uma tensão de cisalhamento de parede constante de 0,05 Pa. </li><li> Durante os últimos 2 minutos do bolo de leucócitos, gravar 10 campos aleatórios ao longo do comprimento da microlâmina. Isto permite a análise off-line de linfócitos de rolamento / amarrar na monocamada endotelial. Registre cada campo por aproximadamente 10 seg antes de passar para a próxima e garantir que as gravações são feitas contra a direção do fluxo para evitar a gravação da mesma célula de rolamento duas vezes em rápida sucessão. </li><li> Seguir o bolus de leucócitos com um bolus de 5 min de tampão de lavagem, retornando a válvula para a sua posição inicial. Durante o final de 2 min de bolus esta proceder a uma segunda fase de gravação, escolhendo pelo menos 10 campos seleccionados aleatoriamente ao longo do comprimento da microlâmina. Registre cada campo por aproximadamente 5 segundos antes de passar para a próxima e garantir que a monocamada endotelial e leucoc aderenteytes estão em foco. Isto permite a análise offline do padrão de adesão. </li></ol>

<ol><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li>
<li>Wong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minimal+role+for+selectins+in+the+recruitment+of+leukocytes+into+the+inflamed+liver+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature.</a> Clin. Invest. , 2782-2790 (1997).</li>
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<li>Aspinall, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX%283%29CR1+and+vascular+adhesion+protein-1-dependent+recruitment+of+CD16%28%2B%29+monocytes+across+human+liver+sinusoidal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">CX(3)CR1 and vascular adhesion protein-1-dependent recruitment of CD16(+) monocytes across human liver sinusoidal endothelium.</a> Hepatology. 51, 2030-2039 (2010).</li>
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<li>Weston, C. J., Shepherd, E. L., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+localization+and+trafficking+of+vascular+adhesion+protein-1+as+revealed+by+an+N-terminal+GFP+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural+Transm%22%5BJournal%5D)">Cellular localization and trafficking of vascular adhesion protein-1 as revealed by an N-terminal GFP fusion protein.</a> J. Neural Transm. , (2013).</li>
<li>Shetty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+lymphatic+endothelial+and+vascular+endothelial+receptor-1+mediates+the+transmigration+of+regulatory+T+cells+across+human+hepatic+sinusoidal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium.</a> J. Immunol. 186, 4147-4155 (2011).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes

A etapa mais importante para a realização com êxito um ensaio de escoamento é garantir que uma monocamada saudável e confluentes de células endoteliais está pronta antes de o ensaio de adesão de fluxo. Células endoteliais primárias pode ser difícil para a cultura e sensível a alterações nos métodos de cultura. É importante que 1) as câmaras de fluxo são de forma adequada e uniformemente revestidos com células endoteliais em monocamada, para HSEC usamos rato de colagénio tipo I da cauda, ​​mas este pode ser diferente para outras populações endoteliais, 2) o meio de cultura apropriado para o tipo de célula, para HSEC descrevemos nosso meio completo na seção de protocolo. Outros passos vitais incluir a criação da bomba de seringa à taxa adequada para refletir níveis fisiológicos de tensão de cisalhamento. Durante o ensaio de fluxo que é necessário para evitar que as bolhas de ar no interior do circuito de escoamento, que pode danificar a monocamada endotelial ou retirar células do sistema imunológico da superfície endotelial. Isto pode ser evitado por ptsuring que toda a tubagem de silicone e os adaptadores são perfundidos com tampão de lavagem antes da ligação, que todas as bolhas de ar são removidas, e que os meios de comunicação são pré-aquecido antes de ser utilizado. Quando a ligação dos adaptadores para as portas na microlâmina é muito importante que haja uma interface líquido / líquido durante a ligação, se existir qualquer ar, então isso vai formar um espaço de ar dentro do sistema que irá perturbar a monocamada endotelial durante a retirada da seringa passo. A solução de leucócitos no corpo da seringa tem agitação regular, para assegurar que as células não se contentar, mantendo assim uma densidade celular constante ao longo da experiência. Durante as etapas de gravação, é importante para garantir que a imagem da camada endotelial está adequadamente focado e clara para permitir a análise off-line precisas, e que durante a segunda etapa do ensaio de escoamento (pós leucócitos bolus) que é deixado tempo suficiente durante o tampão de lavagem fase antes da gravação é recomeçado para garantir quetodos os leucócitos não aderentes são removidas. De igual modo, é essencial a utilização de células endoteliais em monocamada de densidade adequada para prevenir a perda de células que podem interferir com os padrões de fluxo em capilares estreitos e pode também ser difícil de distinguir da maiores leucócitos aderentes à microscopia de contraste de fase. Nós descrevemos densidade de semeadura ideal para células endoteliais sinusoidais hepáticas humanas, mas pode variar entre diferentes populações e espécies endoteliais. Um progresso significativo foi feito no estudo de recrutamento de leucócitos em modelos animais com microscopia intravital. A principal vantagem do método de ensaio de adesão de fluxo é que o recrutamento de leucócitos pode ser estudado num sistema binário com células endoteliais humanas primárias. Além disso, essas interações podem ser estudadas sob níveis fisiológicos relevantes da tensão de cisalhamento. É importante para confirmar resultados de estudos intravital em animais com sistemas celulares humanos como pode haver differences nas propriedades endoteliais entre as espécies. Uma das limitações do ensaio de escoamento é o recrutamento de leucócitos que está a ser estudado num ambiente unicelular da monocamada endotelial. Além disso uma vez que os leucócitos têm aderida e transmigrou através do endotélio não pode estar presente em uma quantidade suficiente para ser isoladas e submetidas a processos a jusante. Apesar destas limitações, uma vez que o ensaio de adesão de fluxo tem sido dominada que pode ser desenvolvido para realizar posterior análise da cascata de adesão de leucócitos e adaptado para recapitular um ambiente multicelular. Gravação prolongada de campos individuais e do uso de software de monitoramento pode ser usado para analisar o comportamento do rastreamento dos leucócitos. Além disso, após a conclusão do ensaio de escoamento dos microslides pode ser interrogado utilizando microscopia confocal de varrimento laser e rotulagem de imunofluorescência para estudar a adesão e transmigração em mais detalhe. Além disso, temos desenvolver anteriormenteed um modelo in vitro, onde os leucócitos que fluem poderia interagir com endotélio hepático condicionada pela presença de hepatócitos. Este ensaio também pode ser desenvolvido para estudar as subpopulações de leucócitos: nosso grupo realizou estudos com subconjuntos, tais como células T reguladoras, as células B e os leucócitos infiltrantes fígado. Estes estudos são evidências de que o ensaio de adesão de fluxo é uma ferramenta poderosa para estudar o recrutamento de leucócitos específicos geral e órgão em sistemas humanos.

Está agora bem estabelecido que o recrutamento de leucócitos em geral segue o modelo da cascata de adesão de várias etapas 1. Isto envolve a captura de leucócitos a partir de sangue que flui por células endoteliais que revestem a parede do vaso. Inicialmente, os leucócitos submetidos a um passo de enrolamento, que é mediada por selectina receptores ou os membros da superfamília das imunoglobulinas. Isto permite à proteína G de receptores acoplados (GPCRs) expressa na superfície de leucócitos para ser activado por quimiocinas apresentados no glycocalyx endotelial. Isto leva à alteração da confirmação da integrina para um estado de &quot;alta afinidade&quot; na superfície dos leucócitos e prender e adesão firme ao endotélio. Adesão firme é seguida por alteração da forma e do rastreamento de leucócitos no navio. O passo final é a transmigração através da monocamada endotelial, que pode ocorrer por via paracelular ou transcelular rotas. Enquanto a cascata de adesão de várias etapas descrevems o mecanismo geral de recrutamento de leucócitos no corpo há diferenças específicas do órgão. No fígado, a maioria do recrutamento de leucócitos ocorre dentro dos sinusóides hepáticas, em contraste com outros órgãos, onde recrutamento geralmente ocorre dentro das vénulas pós-capilares 2. Os sinusóides hepáticos são um ambiente de baixo cisalhamento e leucócitos passam por um breve passo tethering antes de firmar a adesão que é independente selectina 2. Estes canais estão alinhados pelo endotélio sinusoidal hepática que é descontínua e contém fenestrações, poros abertos 100-200 nm de diâmetro, e carecem de uma membrana basal 3. Elucidar os mecanismos moleculares que medeiam o recrutamento de leucócitos através do endotélio sinusoidal hepático humano poderia identificar órgãos alvos terapêuticos específicos para doenças inflamatórias do fígado. Ensaios de adesão de fluxo são ferramentas essenciais no estudo do recrutamento de leucócitos. Eles permitem a reconstrução de leucócitos recruitment na presença de tensão de cisalhamento para analisar a adesão sob forças bem definidas. O uso mais comum para o ensaio é o estudo de leucócitos adesão a monocamadas endoteliais em cultura ou substratos purificados. Câmaras de fluxo comercialmente disponíveis são utilizadas para perfundir as células sob condições de fluxo laminar, entre duas superfícies planas e depois visualizar o processo dinâmico de aderência sobre um microscópio 4. Grupos anteriores demonstraram que certas interacções adesivas ocorrem apenas sob fluxo e não pode ser estudado em ensaios estáticos 5,6. Nós temos usado essa técnica para recapitular os sinusóides hepáticos e estudar o recrutamento de leucócitos em condições de baixa tensão de cisalhamento. HSEC humano primário são cultivadas em microslides e leucócitos podem ser perfundidos durante este monocamada, a uma taxa de fluxo calculada para reproduzir a tensão de corte dentro de sinusóides hepáticas. A tensão de corte é uma tensão que é aplicada em paralelo ou tangente a uma superfície como opposed a tensão normal, que é perpendicular. Qualquer líquido que se move ao longo de uma fronteira exercerá uma tensão de cisalhamento em que limite. A tensão de cisalhamento foi demonstrado ser um componente essencial de linfócitos transmigração 7. Sob estas condições, cada passo da cascata de adesão pode ser visualizada por microscopia de contraste de fase. Este método permitiu importantes descobertas sobre o recrutamento de leucócitos no fígado, incluindo o estudo de moléculas de adesão 8 convencionais, o papel de quimiocinas e receptores de quimiocina 9-11, e moléculas de adesão atípicos tais como a adesão vascular protein-1 (VAP-1 ) 8,12 e linfática comum e vascular endotelial receptor-1 (CLEVER-1) 13. Embora este ensaio foi mencionado em várias publicações do nosso grupo, sua descrição foi breve e nós tomamos esta oportunidade para fornecer um detalhado passo a passo para ajudar na solução de problemas e evitar erros técnicos quando tentativação do ensaio. Além disso, nós recentemente mudou o fornecimento de câmaras MicroSlide que permite alterações precisas em tensão de cisalhamento. Acreditamos que esta alarga a aplicabilidade do ensaio de outras células endoteliais e do sistema imunológico. O método seguinte descreve a preparação e a técnica para a realização de um ensaio de adesão de fluxo baseado em células hepáticas sinusoidais endoteliais humanas e de linfócitos de sangue periférico.

<table><tbody><tr><td>Câmara de fluxo de seis canais microslide VI 0.4</td><td>Ibidi</td><td>80601</td><td>Outros tamanhos de canal e lâminas pré-revestidas estão disponíveis dependendo dos requisitos do ensaio.</td></tr><tr><td>Adaptadores de fluxo&nbsp; microslide VI 0.4</td><td>Ibidi</td><td>80646</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de ensaio de fluxo</td><td>Solent Scientific</td><td>33-3322</td><td>Estas câmaras são feitas sob medida pela empresa dependendo do modelo de microscópio e acessórios.&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscópio invertido IX2</td><td>Olympus, Reino Unido</td><td>Modelo IX50</td><td></td></tr><tr><td>Harvard Bomba de seringa</td><td>Harvard Aparelho, Reino Unido</td><td>702101</td><td></td></tr><tr><td>Válvula solenóide eletrônica</td><td>Lee Products Limited, Reino Unido</td><td>Número da peça LFYA1226032H</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de silício grande</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB50855</td><td>2 mm de diâmetro interno, 4 mm de diâmetro externo</td></tr><tr><td>Tubo de silicone - pequeno</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB50853</td><td>1 mm de diâmetro interno, 3 mm de diâmetro externo</td></tr><tr><td>Harvard Glass Syringe</td><td>Harvard Apparatus, Reino Unido</td><td>55-0962</td><td></td></tr><tr><td>Meio de separação celular/Linfólito</td><td>VH Bio</td><td>CL-5020</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno de cauda de rato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3867-1VL</td><td></td></tr></tbody></table>

um fluxo de adesão ensaio para o estudo de recrutamento de leucócitos para hepáticas humanas senoidais endotélio sob condições de estresse de cisalhamento

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Infiltração de leucócitos em tecido de fígado humano é um processo comum em todas as doenças inflamatórias do fígado de adulto. Infiltração crônica pode conduzir ao desenvolvimento de fibrose e progressão para cirrose. Compreender os mecanismos moleculares que medeiam o recrutamento de leucócitos para o fígado poderia identificar alvos terapêuticos importantes para a doença hepática. A interação chave durante o recrutamento de leucócitos é a de células inflamatórias com endotélio em condições de tensão de cisalhamento. Recrutamento para o fígado ocorre dentro dos canais baixos de cisalhamento dos sinusóides hepáticos, que são revestidas por células endoteliais sinusoidais hepáticas (HSEC). As condições dentro dos sinusóides hepáticos pode ser recapitulada irrigando leucócitos através de canais revestidos por monocamadas HSEC humanos em vazões específicas. Nestas condições leucócitos sofrer uma breve etapa de amarrar seguido por activação e adesão firme, seguido por um passo de rastreamento e transmigração através do endotélio subsequentecamada. Usando a microscopia de contraste de fase, cada etapa desta &quot;cascata de adesão» pode ser visualizada e registada seguido por análise off-line. As células endoteliais ou leucócitos podem ser pré-tratados com inibidores para determinar o papel de moléculas específicas durante este processo.

Este ensaio tem a capacidade de visualizar a cascata de adesão de fluxo de passos múltiplos e elucidar os mecanismos moleculares subjacentes, comparando os resultados de experiências de controlo para aqueles com inibidores moleculares. Vários leitos vasculares pode ser reproduzido através da incorporação de células endoteliais específicas e alterando as condições de tensão de cisalhamento. Cada passo da cascata de adesão podem ser analisados ​​off-line, seguindo o método de gravação descrito no protocolo. O primeiro passo da cascata de adesão é o rolamento de leucócitos, que pode ser expresso como uma percentagem do total de células aderentes. Análise off-line permite que o número de células aderentes a ser enumerados em cada campo registados durante o bolus de leucócitos. A reprodução da imagem permite a comparação de células que são firmemente aderente e aqueles que estão passando por um movimento de rolamento através do endotélio. O movimento de rolamento pode ser visualizada usando esta técnica, cada campo é registada por pelo menos 10 seg. Células rolamento são identificados por sua velocidade reduzida ao longo da superfície endotelial em comparação com células fluindo. Este comportamento deve ser demonstrada por pelo menos 5 segundos, sem distanciamento. A cascata de adesão dentro dos sinusóides hepáticos ocorre em um ambiente de baixo cisalhamento e estudos in vivo confirmaram rolamento mínimo com apenas um breve passo tethering. Confirmámos que o ensaio de fluxo reflecte o ambiente dos sinusóides hepáticas, demonstrando que menos de 10% do número de leucócitos aderentes persistentemente rolar estimulada HSEC nestes ensaios. O passo seguinte da cascata de adesão é a adesão firme. Aderência total pode ser calculada a partir da segunda fase de gravação durante o bolus de tampão de lavagem (passo 7.3). Análise off-line permite que o número total de células firmemente aderentes a ser contado em cada campo (Figura 5). As células firmemente aderentes são definidas como células que são estacionários ou shapechanged com comportamento rastreamento lento.O número médio de células por campo pode então ser calculado. Este valor pode então ser utilizado, em conjunto com a área de superfície total do campo de visão (determinado usando uma retícula ou equivalente), a concentração de linfócitos (tipicamente 1 x 10 6 células / ml) e a taxa de fluxo para expressar o grau de linfócitos como a aderência de células aderentes / mm 2/10 6 células perfundidos. Estudar o padrão de adesão envolve a análise das duas últimas etapas da cascata de adesão, incluindo forma de troca, rastejando e migração transendotelial. Os leucócitos aderentes à superfície superior da monocamada HSEC aparecer fase brilhante, enquanto aqueles que migraram através da monocamada aparecer fase escura (Figura 6). As células podem então ser classificados como apresentando adesão &quot;estática&quot; (nonmigrated / volta), &#39;mudou-forma&#39; morfologia ou como &#39;migraram&#39; e categorias individuais são, então, expressa em percentagem dopopulação total de adesivo. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig1.jpg" /> Figura 1. Monocamada de células hepáticas humanas primárias senoidais endoteliais no interior da câmara de fluxo. A) Microslides cheios com meios contendo monocamada de células endoteliais antes do início do ensaio de adesão de fluxo. B) imagem de contraste de fase de confluente monocamada endotelial, células endoteliais devem ser semeadas na microlâmina que tenham sido pré-revestido (para células endoteliais hepáticas humanas esta deve ser com colágeno tipo cauda de rato 1), e é essencial que as células endoteliais são saudáveis ​​em cultura e confluentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src= &quot;/ Files/ftp_upload/51330/51330fig2highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51330/51330fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2. Fluxo câmara de ensaio. Uma câmara de ensaio de fluxo de set-up pode ser visto aqui, é constituída por uma câmara transparente, que é montado em um microscópio invertido. Um aquecedor é colocado na câmara e deve ser controlado por termostato para manter uma temperatura de 37 ° C. Deve haver portas disponíveis para conectar tubos de silicone a partir de uma microlâmina no interior da câmara de uma bomba de seringa, que está localizado do lado de fora. O MicroSlide é colocado diretamente no palco microscópio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig3.jpg" /> Figura 3. Syringe Pump. A bomba de seringa é conectared através de tubagem de silicone para a câmara de fluxo. A bomba foi colocada a uma taxa de retirada específico dependendo da tensão de cisalhamento desejado necessário para o ensaio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig4.jpg" /> Figura 4. Conexão da válvula de fluxo de câmara. A) Uma válvula solenóide eletrônica permite alternar entre duas seringas contendo células ou mídia com praticamente nenhum espaço morto. B) Uma vez que a válvula é liberado e os dois barris são criados, o tubo de silicone da válvula está ligado à câmara de fluxo. É fundamental que ao conectar o adaptador no tubo de silicone para a porta na câmara de fluxo, há uma interface líquido / líquido. &lt;a href = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; Clique aqui para ver imagem ampliada. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig5.jpg" /> Figura 5. Medição da adesão de leucócitos totais. Durante os últimos dois minutos da etapa bolus tampão de lavagem (conforme descrito no protocolo), um mínimo de dez campos aleatórios devem ser registrados. Estes podem ser analisados ​​off-line e o número total de células firmemente aderentes, pode ser contado em cada campo. Adesão total de leucócitos pode ser comparado entre as câmaras de controle e aqueles pré-tratados com anticorpos bloqueadores, aqui vamos mostrar um campo de representante de uma lâmina de controlo e um slide pré-tratados com adesão intracelular molécula-1 (ICAM-1) anticorpo bloqueador. Setas foram adicionados para realçar os leucócitos aderentes, na representaçãocampo tiva da lâmina de controlo, há um total de 25 leucócitos identificados e no ICAM-1 bloco de slides, há um total de 13 leucócitos identificados. Barras de escala = 100 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig6.jpg" /> Figura 6. Análise A análise do padrão de adesão de leucócitos em monocamadas endoteliais por microscopia de contraste de fase. Off de campos gravados também podem ser usadas para estudar a direcção e velocidade de adesão de leucócitos. As etapas específicas da cascata de adesão podem ser visualizadas e quantificadas utilizando imagem de contraste de fase. Células vivas fase que são firmemente aderente mas não ativado pode ser denominado de adesão &#39;round&#39;, as células que são activated e brilhante fase pode ser denominado &#39;forma alterada &quot;e as células que são escuro fase são as células que foram sujeitas a migração transendotelial e pode ser denominado&#39; migraram &#39;. A imagem mostra exemplos de cada padrão de aderência. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> .

Recrutamento de leucócitos para o fígado ocorre dentro dos canais especializados dos sinusóides hepáticos, que são revestidas por células endoteliais sinusoidais hepáticas únicas. Microscopia de contraste de fase de recrutamento de leucócitos através do endotélio sinusoidal hepática humana em condições de tensão de cisalhamento fisiológico pode facilitar a elucidação dos mecanismos moleculares que estão na base deste processo.

Um fluxo de Adesão Ensaio para o Estudo de Recrutamento de leucócitos para hepáticas humanas senoidais endotélio sob condições de estresse de cisalhamento

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

O objetivo geral deste procedimento é estudar os mecanismos de recrutamento de leucócitos através de células endoteliais hepáticas humanas na presença de níveis fisiológicos de tensão de cisalhamento. Isso é realizado primeiramente preparando uma monocamada confluente de células endoteliais sinusoidais hepáticas humanas em um lâmina microscópica, que posteriormente é estimulada com citocinas inflamatórias. O segundo passo é isolar linfócitos do sangue periférico.Em seguida, o lâmina microscópica é conectada a um sistema de ensaio de fluxo e perfundida com linfócitos na presença de estresse cisalhante fisiologicamente relevante. O passo final consiste em visualizar as interações dos linfócitos sob condições de fluxo utilizando um microscópio de contraste de fase. Por fim, a análise off-line das imagens de contraste de fase adquiridas durante o ensaio de fluxo é utilizada para comparar o efeito de diversos inibidores no recrutamento de linfócitos através das células endoteliais hepáticas.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da hepatologia, como quais combinações de proteínas de adesão e receptores de quimiocinas são importantes para o recrutamento de diversas populações de células imunes através do endotélio sinusoidal e para dentro do parênquima hepático. As implicações desta técnica estendem-se à terapia das doenças hepáticas inflamatórias crônicas, a maioria das quais é impulsionada pelo recrutamento de linfócitos para o tecido hepático. Compreender os mecanismos moleculares pode levar ao desenvolvimento de novas terapias anti-inflamatórias.Embora este método possa fornecer informações sobre o recrutamento de células inflamatórias para o fígado humano, ele também pode ser aplicado a outros tipos celulares, como células endoteliais isoladas da veia umbilical ou de outros leitos vasculares. Para começar, prepare uma solução de trabalho de 200 microgramas por mililitro de colágeno de cauda de rato, tipo I, diluindo-a a partir de uma solução estoque em PBS estéril.Em seguida, injete 30 microlitros do colágeno diluído em cada canal de uma lâmina microscópica de seis canais e incube por duas horas a 37 graus Celsius. A seguir, prepare o meio completo suplementando o meio basal endotelial humano com L-glutamina, penicilina e estreptomicina, ab inativado pelo calor, soro humano, fator de crescimento endotelial vascular e fator de crescimento de hepatócitos. Em seguida, utilizando tripsina-EDTA, recolha células endoteliais sinusoidais hepáticas humanas cultivadas de um frasco T-75 confluente, faça um pellet das células, lave-as em PBS e, então, re-suspenda-as a três vezes 10 à sexta células por mililitro em meio completo.Em seguida, lave a lâmina microscópica três vezes com PBS e, então, adicione 30 microlitros da suspensão celular em cada canal da lâmina microscópica revestida com colágeno. Deixe as células aderirem por uma hora em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com atmosfera de 5%CO2. Após a adesão celular, preencha as portas em ambos os lados de cada canal com meio completo e retorne-as à incubadora por 24 horas.Após 24 horas, utilize um microscópio invertido de contraste de fase para verificar que o crescimento celular atingiu 80% de confluência. Em seguida, prepare as citocinas para estimulação celular adicionando 10 nanogramas por mililitro de TNF alfa e 10 nanogramas por mililitro de interferon gama a um mililitro de meio completo. Então, 24 horas antes de realizar o ensaio de adesão, substitua o meio de crescimento celular por 0,1 mililitro do meio suplementado com citocinas para estimular as células, e purifique a fração mononuclear do sangue total por centrifugação em gradiente de densidade sobre um meio apropriado de separação celular, como o lympho light, durante 25 minutos a 800 vezes a gravidade.Em seguida, transfira a fração mononuclear para um novo tubo e complete com PBS contendo BSA a 0,1% volume por volume. Centrifugue o tubo por 10 minutos a 125 vezes a gravidade para esgotar a solução de plaquetas. A seguir, lave o pellet com PBS contendo BSA a 0,1% volume por volume e, então, centrifugue por 10 minutos a 800 vezes a gravidade. Re-suspenda o pellet em 10 mililitros de RPMI contendo BSA a 0,1% volume por volume, coloque as células em um frasco de cultura de tecidos tratado T 75 e incube por uma hora para permitir a adesão dos monócitos na fração.Em seguida, remova cuidadosamente o sobrenadante enriquecido em linfócitos e centrifugue as células a 800 vezes a gravidade durante 10 minutos. Em seguida, pré-trate os linfócitos isolados ressuspendendo-os em solução RPMI contendo BSA a 0,1% volume por volume e, adicionalmente, 200 nanogramas por mililitro de anticorpos bloqueadores da função específica da toxina da coqueluche ou inibidores de pequenas moléculas dos receptores de quimiocinas. Incube os linfócitos na solução inibidora por 30 minutos a 37 graus Celsius e, então, centrifugue as células e lave-as em PBS com BSA a 0,1% volume por volume.Em seguida, centrifugue as células novamente e, então, resuspenda-as em meio de fluxo na concentração de um vezes 10 à sexta potência de células por mililitro. Pré-aqueça uma câmara ambiental transparente com controle térmico a 37 graus Celsius. A câmara deve conter portas para inserção de tubos de silicone e uma conexão elétrica para uma válvula solenoide.Preencha uma seringa de vidro de 50 mililitros com fechamento de segurança com 10 mililitros de água destilada estéril. Em seguida, acople um trecho de tubo de silicone de 25 centímetros à porta da seringa e insira a seringa em uma bomba de infusão. Ajuste a taxa de aspiração da bomba de acordo com as instruções do fabricante da lâmina microscópica para manter uma tensão de cisalhamento de 0,05 pascals ou 0,5 dinas por centímetro quadrado.Descarte os êmbolos de duas seringas de cinco mililitros e conecte os cilindros aos dois orifícios de entrada de uma válvula solenoide eletrônica utilizando um centímetro de tubo de silicone. Em seguida, conecte doze centímetros de tubo de silicone à saída da válvula. Insira tampão de lavagem livre de células em ambas as válvulas de seringa e purgue a válvula solenoide eletrônica.Certifique-se de que o tampão esteja fluindo de um barril através da válvula e para dentro da tubulação de silicone de saída. Em seguida, gire o interruptor da válvula para o outro barril e verifique se o tampão continua fluindo. Remova todas as bolhas do sistema.Em seguida, substitua o tampão de lavagem em um dos frascos pela suspensão de linfócitos contendo um vezes 10 à sexta células por mililitro. Conecte a tubulação de silicone da bomba de seringa a uma das entradas de um canal microscópico escolhido, utilizando um adaptador para lâmina microscópica. Em seguida, conecte a tubulação de silicone da válvula de saída à entrada oposta no mesmo canal da lâmina microscópica, também com um adaptador para lâmina microscópica.Em seguida, fixe a lamínula na platina do microscópio com clipes ou fita para evitar movimento. Configure o microscópio para a objetiva de 10 x com o ajuste de contraste de fase apropriado antes de iniciar a perfusão. Certifique-se de que uma câmera esteja corretamente conectada ao microscópio e pronta para transmitir imagens a um monitor para gravação.Assegure-se de que a monocamada endotelial esteja em foco e, utilizando uma bomba de seringa, perfunda a camada endotelial com tampão de lavagem sem células por dois minutos, iniciando a retirada da bomba de seringa para remover qualquer detrito ou anticorpo bloqueador não ligado. Em seguida, troque a válvula para permitir uma infusão em bolus de solução de linfócitos por cinco minutos a uma parede constante. Tensão de cisalhamento de 0,05 pascals durante os últimos dois minutos da infusão em bolus de linfócitos.Registre 10 campos aleatórios ao longo do comprimento da lâmina microscópica durante 10 segundos. Cada movimentação entre os registros deve ser feita contra a direção do fluxo. Para evitar registrar a mesma célula rolante duas vezes após o bolo de linfócitos, retorne a válvula à sua posição inicial para prosseguir com um bolo de cinco minutos de tampão de lavagem sem células.Registre uma segunda passagem de 10 campos selecionados aleatoriamente, durante cinco segundos cada. Durante os últimos dois minutos deste bolus, o movimento de rolamento dos linfócitos pode ser facilmente visualizado usando esta técnica de ensaio de fluxo. As células em rolamento são identificadas pela velocidade reduzida sobre a superfície endotelial em comparação com as células em fluxo.Neste ensaio de fluxo, menos de 10% dos linfócitos aderentes rolaram persistentemente sobre células endoteliais estimuladas, o que confirma que o ensaio de fluxo reflete o ambiente dos sinusoides hepáticos. A gravação do bolo de tampão de lavagem é utilizada para avaliar a aderência total dos linfócitos.Células firmemente aderidas são definidas como células estacionárias ou com alteração de forma e comportamento de rastejamento lento. São mostrados aqui campos representativos de uma lâmina controle e de uma lâmina pré-tratada com molécula de adesão intercelular, um anticorpo bloqueador. O grau de aderência de linfócitos em cada condição é expresso como células aderidas por milímetro quadrado por milhão de células perfundidas.Após este procedimento, outros métodos podem ser realizados, como microscopia confocal, para responder perguntas adicionais, tais como a localização exata da migração transendotelial ou as alterações no citoesqueleto que ocorrem durante o recrutamento sob estresse cisalhante após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores que estudam inflamação no fígado ou em outros órgãos explorarem como populações específicas de células endoteliais de órgãos regulam o processo de recrutamento de leucócitos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como avaliar o recrutamento de linfócitos através de células endoteliais humanas do fígado e enumerar células imunes em diferentes estágios da cascata de adesão.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este relatório fornece uma representação visual de placas paralelas análise câmara de fluxo para o estudo de interações leucócitos endoteliais sob tensão de cisalhamento fisiológico. Este método é particularmente útil para investigar o papel do endotélio (E)-selectina e E-selectina leucócitos ligantes que leucócitos gatilho rolando na superfície das células endoteliais.

Análise da Rolling Leucócitos Fisiológica E-Selectina-Mediated no endotélio microvascular

Este é um método para visualizar a adesão de leucócitos ao endotélio em vasos pressurizados colhidas. A técnica permite estudar de adesão vascular sob fluxo de cisalhamento com diferentes pressões intraluminal até 200 mmHg, assim, imitam-ing as condições fisiopatológicos da pressão arterial elevada.

Imagem adesão leucocitária ao endotélio vascular na pressão intraluminal de alta

Câmaras de fluxo microfluídicos gravados por fotolitografia e fabricada a partir de PDMS são aplicados para sondar os resultados funcionais associados com disfunção CE e inflamação. Numa experiência representativa, a capacidade de tensão de cisalhamento diferencial para modular a adesão celular monocítica a citocina activado CE monocamadas é demonstrada.

On-Chip fenotipagem endotelial Inflamatória

Este vídeo demonstra um ensaio baseado em fluxo laminar para caracterizar a interação de leucócitos e parceiros celulares, como células endoteliais. Este método fornece informações dinâmicas sobre adesão, desadesão e transmigração de leucócitos quando perfundidos sobre uma camada intacta e confluente de células vasculares.

Um ensaio baseado em fluxo laminar para estudar as interações entre leucócitos e células endoteliais

As câmaras de fluxo usadas em experimentos de adesão geralmente consistem em caminhos de fluxo lineares e requerem vários experimentos em diferentes taxas de fluxo para gerar um mapa de adesão de cisalhamento.  O SynVivo-SMN permite a geração de mapa de adesão de cisalhamento usando um único experimento utilizando volumes de microlitros, resultando em economia significativa de tempo e consumíveis.

Geração de cisalhamento Adesão Mapa Usando SynVivo Networks microvasculares sintético

Um método de quantificação da aderência de neutrófilos é relatado. Este método cria um ambiente dinâmico de fluxo semelhante ao encontrado em um vaso sanguíneo. Ele permite a investigação de adesão de neutrófilos, quer moléculas de adesão purificadas (ligando) ou substrato de células endoteliais (HUVEC) num contexto semelhante ao ambiente in vivo com tensão de cisalhamento.

Fluxo de Neutrófilos Humanos Secção Ensaio de Adesão

Aqui, nós apresentamos um protocolo que permite ao investigador para avaliar a dinâmica de recrutamento de leucócitos ex vivo, ligando uma câmara revestida com moléculas de adesão endoteliais derivados de para o sistema circulatório de um rato. Este método oferece vantagens significativas, uma vez que permite a avaliação de leucócitos em condições biológicas relativos.

Avaliando interação leucócito-endotélio em condições de fluxo em um Ex Vivo Autoperfused Microflow Câmara Assay

Este ensaio de adesão fluxo fornece um modelo de impacto simples, alta de interações celulares de células-epitelial T. Uma bomba de seringa é utilizado para gerar a tensão de corte, e microscopia confocal captura imagens para efeitos de quantificação. O objectivo destes estudos é o de quantificar eficazmente a adesão de células T utilizando condições de fluxo.

Ensaio de Adesão Sob tensão de cisalhamento para o Estudo da Linfócitos T-Molécula de adesão de Interações

Leucócitos, avidamente, interagir com células vasculares e plaquetas após lesão de parede do vaso ou durante a inflamação. Aqui, descrevemos um simples ensaio baseado em fluxo laminar para caracterizar os mecanismos moleculares que fundamentam as interações entre os leucócitos e os seus parceiros de celulares.

Ensaios baseados em fluxo laminar para investigar o recrutamento de leucócitos em culturas de células vasculares e plaquetas aderentes

Aqui, apresentamos um protocolo integrado que mede subpopulação de monócitos tráfico sob fluxo in vitro pelo uso de marcadores de superfície específicas e microscopia de fluorescência confocal. Este protocolo pode ser usado para explorar etapas sequenciais de recrutamento, bem como perfil de outros subtipos de leucócitos usando outros marcadores de superfície específicos.

Estudo simultâneo do recrutamento de monócitos subpopulações sob fluxo In Vitro

Este protocolo passo a passo fornece uma descrição detalhada da instalação experimental e análise de dados para a avaliação das respostas inflamatórias em hiPSC-ECs e a análise da adesão de leucócitos sob fluxo fisiológico.

Microfluidic ensaio para a avaliação da adesão de leucócitos ao humano Induced Pluripotent células-tronco derivadas de células endoteliais (ECs-hiPSC)

Aprenda a estudar o recrutamento de leucócitos através de células endoteliais hepáticas humanas sob estresse de cisalhamento fisiológico. Este método utiliza microscopia de contraste de fase para analisar interações celulares e identificar alvos terapêuticos para doenças inflamatórias crônicas do fígado.

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