Isolamento de células-tronco cancerosas em amostras de câncer de próstata humano

O objetivo geral deste procedimento é descrever o isolamento de células-tronco de câncer de próstata de tecido humano por fax. Isso é feito primeiro processando o tecido do câncer de próstata colhido de amostras cirúrgicas. Na segunda etapa, uma suspensão celular é gerada a partir das seções de tecido e as células são marcadas com anticorpos fluorescentes.

Na etapa final, as células-tronco do câncer de próstata são classificadas por fatos. Em última análise, os atributos moleculares e funcionais das células isoladas podem ser caracterizados por xenotransplante e perfil de expressão gênica. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do câncer de próstata, facilitando a caracterização molecular e funcional de células-tronco cancerígenas de amostras humanas.

Demonstrando o procedimento estarão Samuel Vidal, um estudante de doutorado em MD Aiden Quinn, um estudante de mestrado, e Jania. Nossa pesquisa A do laboratório Comece colhendo o excesso de tecido a granel das amostras de câncer não necessárias para diagnósticos clínicos em um tubo cônico de 50 mililitros contendo 15 mililitros de mídia. Armazene imediatamente o tubo a quatro graus Celsius para processamento dentro de 24 horas após a ressecção e, em seguida, trabalhe em um gabinete de biossegurança com bisturi estéril e fórceps.

Obtenha seções de tecido horizontais de dois a quatro milímetros de espessura dos nódulos tumorais macroscópicos dentro da amostra de tecido cancerígeno. Coloque essas seções em um novo tubo de 50 mililitros contendo mídia. Em seguida, separe uma porção e fixe-a em formalina a 10% para análise histológica para confirmar a presença de tecido de câncer de próstata para gerar suspensões celulares do tecido tumoral.

Em seguida, transfira cada uma das seções de tecido de dois a quatro milímetros para uma placa de cultura de 60 por 15 milímetros contendo um mililitro de PBS estéril Tritrate mecanicamente as amostras usando um bisturi estéril e fórceps e agrupe as suspensões celulares resultantes em um único tubo cônico estéril de 50 mililitros. Adicione outro mililitro de PBS ao prato de amostra, repetindo a iteração mais três a quatro vezes até que cada seção de tecido esteja completamente dissociada. Em seguida, use uma pipeta de cinco mililitros para misturar a solução celular.

Vortex as soluções celulares na velocidade máxima por um minuto e, em seguida, filtre a pasta celular resultante através de um filtro de célula de 35 micrômetros em um segundo tubo cônico estéril de 50 mililitros. Gire as células filtradas por 10 minutos a 450 vezes G à temperatura ambiente. Em seguida, ressuspenda o pellet em cinco mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos.

Após cinco minutos, gire as células novamente. Resus suspendendo o grânulo vermelho livre em uma pequena quantidade de PBS suplementado com 5% FBS para contagem por exclusão de trian blue. Depois de quantificar o número de células viáveis, dilua as células para uma vez 10 elevado a seis células por mililitro de suspensão e armazene-as no gelo por não mais de uma hora.

Para isolar as células-tronco do câncer de próstata, comece rotulando cinco tubos cônicos de 15 mililitros, conforme mostrado, para excluir as células hematopoiéticas e endoteliais durante a classificação. Divida a suspensão celular gerada a partir das seções de tecido tumoral entre os cinco tubos e, em seguida, incube as células com os anticorpos apropriados em uma diluição de um a 250 por 30 minutos no gelo. Em seguida, gire as células e lave os pellets em PBS estéril suplementado com 10% FBS Após a lavagem, incube os pellets em 10 microgramas por mililitro de DPI e filtre as soluções finais através de tampas de filtro de 35 micrômetros em tubos de poliestireno de 12 por 75 milímetros.

Use os primeiros quatro tubos para definir as portas para dispersão lateral direta dpi, fite e pe. Finalmente, use o tubo cinco para coletar as populações HLA Classe um negativa e HLA classe um positiva em tubos cônicos estéreis individuais de 15 mililitros contendo dois mililitros de RPMI suplementados com 10% de FBS. Em seguida, gire as suspensões de células classificadas e ressuspenda os pellets em 200 a 500 microlitros de meio para quantificação das células viáveis por exclusão de azul triano.

O protocolo demonstrado facilita o isolamento de células-tronco de câncer de próstata HLA Classe um negativas de espécimes cirúrgicos humanos. Essas imagens ilustram os nódulos tumorais macroscópicos grosseiramente visíveis que podem ser processados e confirmados por microscopia. Conforme demonstrado, as células viáveis são isoladas por sua coloração negativa de dapi, a frequência das células-tronco de câncer de próstata HLA Classe um negativas pode então ser determinada.

O número de células-tronco de câncer de próstata HLA Classe um negativas varia entre os pacientes, mas geralmente representa 0,5 a 8% da população viva total após este procedimento. Outros métodos, como perfil de expressão gênica e xenotransplante, podem ser usados para caracterizar melhor os mecanismos que contribuem para a resistência à quimioterapia e progressão da doença.