A lignina Down-regulação da Zea mays Via dsRNAi e Klason Análise lignina

A interferência de RNA fita dupla (dsRNAi) técnica é empregada para baixo-regular a coenzima A redutase cinamoil milho gene (ZmCCR1) para diminuir o teor de lignina da planta. A lignina sub-regulação da parede da célula é visualizada por meio de análises microscópicas e quantificada pelo método de Klason. São analisadas as mudanças de composição em hemicelulose e celulose cristalina.

O objetivo geral deste procedimento é regular negativamente o teor de lignina no labirinto via RNAi para facilitar a produção de biomassa digestível para a produção de bioetanol e medir o teor de lignina usando o protocolo de medição de lignina Clayson. Isso é feito primeiro construindo o plasmídeo CCR um RNAi do labirinto para regular negativamente o gene relacionado à biossíntese de lignina syn oil COA redutase. Em seguida, dois calos embrionários altos de milho são transformados com o ZM CCR uma construção de RNAi Usando bombardeio de partículas e linhas transgênicas homozigóticas são geradas.

Em seguida, as alterações fenotípicas são observadas por meio de um ensaio histológico e por microscopia eletrônica de varredura realizada na primeira, segunda e terceira gerações do labirinto transgênico. Finalmente, a lignina insolúvel em ácido ou clason das linhas de labirinto transgênicas é medida e comparada com o teor de lignina em plantas de labirinto não transgênicas. Em última análise, são obtidos resultados que mostram uma redução de 10% de lignina em CCR uma planta de labirinto transgênica em comparação com plantas do tipo selvagem usando bombardeio de partículas e conforme determinado pela medição de lignina de Clayson A demonstração visual final deste método é crítica porque algumas das etapas são difíceis de aprender e essas etapas difíceis de aprender incluem a preparação de milho Embry, Cali sob revestimento de condição estéril de tanques em partículas com DNA de plasmídeo e bombardeio de partículas do Cali, Dr.Hossein Aladin e Dr.Gli Brew Han e graduação.

Donald estaria demonstrando essa pesquisa mostrando os procedimentos por meio do bombardeio de partículas. As implicações da técnica de medição de lignina clayson para a produção de bioetanol são que ela não apenas fornece informações sobre as quantidades de lignina clayson em diferentes materiais de lignanocelose, mas também fornece informações sobre a resistência da biomassa de lano cellose às enzimas da celulite durante o pré-tratamento. Para preparar partículas de tungstênio, comece colocando 60 miligramas de contas de tungstênio em um tubo de 1,5 mililitro.

Lave-os adicionando um mililitro de etanol a 70% e vórtice por dois minutos. Em seguida, incubar a 23 graus Celsius por 10 minutos e centrifugar a 18.894 vezes G por dois minutos antes de descartar o sobrenadante. Use um mililitro de etanol 100% para lavar as contas três vezes.

Em seguida, adicione um mililitro de glicerol estéril a 50% para trazer a concentração de micropartículas para 60 miligramas por mililitro. Para preparar o DNA para o bombardeio, coloque 50 microlitros de grânulos de tungstênio em glicerol em um tubo de 1,5 mililitro e adicione o seguinte vórtice entre cada edição. Um micrograma de IV 1.1 ZM CCR um DNA de plasmídeo de RNAi, preparado de acordo com o protocolo de texto.

50 microlitros de cloreto de cálcio 2,5 molar e 20 microlitros de espermatozóides 0,1 molar. Após um vórtice final, centrifugar a mistura a 18.894 vezes G durante 30 segundos. Em seguida, despeje o sobrenadante e use 140 microlitros de etanol a 70% para lavar o pellet duas vezes após descartar a lavagem final, adicione 48 microlitros de etanol a 100% às contas e use-as imediatamente ou armazene no gelo por até quatro horas antes do bombardeio, pelo menos quatro horas antes do bombardeio.

Coloque um labirinto gênico de três a cinco centímetros de altura e dois embriões Calli no meio de uma placa de Petri de 100 milímetros contendo N seis meios OSM. Prepare o dispositivo de entrega de partículas de hélio PSD 1000 de acordo com as instruções do fabricante e use etanol a 70% para esterilizar a parede da câmara. Em seguida, carregue um disco de ruptura estéril de 650 PSI na tampa de retenção estéril.

Em seguida, espalhe de cinco a seis microlitros da solução de DNA M 10 na superfície de um macrotransportador e seque brevemente. Antes de carregar o suporte macro e a tela de parada no conjunto de lançamento do micro transportador, coloque o conjunto de lançamento do micro transportador e o calo do labirinto na câmara a uma distância selecionada da tela de parada e feche a porta. Acelere em um vácuo de 27 PSI contra a tela de malha de arame.

Pressione o botão de disparo até que o disco de ruptura estoure e a pressão do hélio caia para zero no medidor. Em seguida, solte o botão de disparo. Transfira os calos bombardeados para uma placa de Petri contendo N seis OSM e incube por 16 horas no escuro a 27 graus Celsius.

Em seguida, quebre o Calo em cerca de 10 pedaços e transfira-os para N seis E ou meio de indução caloso em placas de Petri e incube por cinco dias no escuro a 27 graus Celsius. Após cerca de oito a 10 semanas, os setores brancos de crescimento rápido crescerão a partir dos setores não proliferantes e parcialmente necróticos. O olho da mãe C excisa os tecidos brancos de crescimento rápido e os transfere para um meio de seleção fresco, continuando a incubá-los, transfere o Cali embrionário branco e de crescimento rápido para o meio de regeneração e incuba no escuro a 27 graus Celsius por uma semana antes de mudar para um período de 16 horas de luz do dia e oito horas de escuridão a 25 a 27 graus Celsius.

Após três a quatro semanas, transfira os brotos regeneradores para o meio de enraizamento em um tubo de tenda de vidro e continue a incubar em um ciclo claro e escuro Depois que o desenvolvimento substancial da raiz aparecer, use água da torneira para lavar as raízes com cuidado. Em seguida, transplante as mudas para vasos de dez centímetros com terra. Cubra os vasos com sacos plásticos para manter as plantas úmidas.

Depois de dois dias, faça pequenos furos nos sacos plásticos. Depois de cinco a seis dias, remova os sacos plásticos. Continue a incubar por mais cinco a seis dias.

Transfira as mudas para vasos de 18 polegadas com terra e mantenha em plena luz solar do verão ou luz de estufa. As plantas regeneradas iniciais são chamadas de T zero, enquanto as primeiras sementes pertencem à geração T um. Para fazer medições de lignina clayson, moa as amostras através de uma tela de dois milímetros.

Em seguida, use um analisador de umidade para determinar o teor de umidade de cada amostra e registrar o valor. Pese cerca de 1,5 gramas de cada amostra e registre o peso com um extrator de solvente automatizado. Use água para extrair as amostras.

Em seguida, use etanol para extraí-los uma segunda vez. Secar as amostras extraídas a 45 graus Celsius durante a noite. Em seguida, deixe-os esfriar no desidratado antes de pesá-los novamente.

Em seguida, meça 0,3 gramas de cada amostra extraída a seco em três tubos de alta pressão com tampa de rosca e registre os pesos com precisão de 10 miligramas. Em seguida, adicione três mililitros de ácido sulfúrico a 72% a cada tubo de pressão. Use varetas de vidro ou Teflon para misturar as amostras e deixe as varetas de agitação nos tubos.

Incube os frascos a 30 graus Celsius por 60 minutos a 150 RPM. Em seguida, adicione 84 mililitros de água deionizada para diluir a concentração de ácido a 4% misturando com a haste de agitação. Tome cuidado para não deixar grandes quantidades de amostra nas laterais do frasco acima da linha d'água.

Depois de selar bem as rolhas em todos os frascos, coloque-as em uma prateleira de metal ou copos grandes e autoclave-as a 121 graus Celsius. Usando um ciclo de esterilização líquida por uma hora, deixe-os esfriar até a temperatura ambiente antes de abrir. Pré-incinerar os cadinhos filtrantes em um forno a 575 graus Celsius por pelo menos quatro horas.

Em seguida, deixe os cadinhos esfriarem em um dessecador por pelo menos uma hora usando um adaptador de borracha para prender cada cadinho a vácuo, filtre a solução de cada tubo através de um cadinho separado. Use água deionizada para enxaguar as partículas de cada tubo. Secar o resíduo de lignina a 105 graus Celsius durante, no mínimo, quatro horas antes de registar o peso do cadinho seco e do resíduo.

Usando um forno de 575 graus Celsius. Pré-aqueça as amostras em um bico de bunsen até que não haja fumaça ou cinzas visíveis antes de colocá-las no forno por 24 horas. Retire os cadinhos do forno e deixe esfriar no dessecador.

Por último, calcular o resíduo insolúvel em ácido utilizando a seguinte equação, em que M pré é igual à massa da biomassa extraída pré-ex M post é igual à massa da biomassa extraída a postex. O frasco para injetáveis M é igual à massa da biomassa extraída adicionada ao frasco para injetáveis O resíduo M é igual à massa do cadinho e do resíduo de lignina. M ash é igual à massa do cadinho e ash e mc é igual ao teor de humidade da biomassa pré-extraída ex

A redução total do peso com base no conteúdo de lignina no labirinto via transformação de bombardeio de partículas de RNAi DS rendeu aproximadamente 30% de silenciamento gênico de zm CCR um foi consistentemente observado em T zero a T duas gerações em comparação com plantas controle. Os transgênicos cresceram de forma semelhante, exceto pela coloração marrom na folha, casca da costela central e caule, como mostrado aqui. A análise histológica revelou que as linhagens mutantes exibem uma redução significativa na espessura da parede celular das fibras do escleenma.

No entanto, o fluxo dos vasos do xilema e as células da bainha pareciam semelhantes às plantas do tipo selvagem, sugerindo que não há efeitos prejudiciais ao transporte de água, transferência de nutrientes ou resistência mecânica aos caules nas linhagens mutantes. Esta figura mostra a quantidade de lignina clason insolúvel em ácido em linhas transgênicas de RNAi de labirinto selvagem e zm CCR one. Três linhagens transgênicas mostraram uma redução estatisticamente significativa na lignina em comparação com as plantas do tipo selvagem para determinar se o fluxo de carbono foi deslocado da via biossintética da lignina para as vias de biossíntese de carboidratos da parede celular.

A celulose foi analisada pelo método dos grafos, como visto neste gráfico. Duas linhagens mutantes zm CCR e RNAi continham níveis significativamente aumentados de celulose cristalina. A análise do teor de hemicelulose, no entanto, não revelou alterações nas linhagens mutantes após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de visualização visual transgênica de plantas. Essa técnica fornecerá orientação aos pesquisadores que precisam introduzir um gene de interesse em altas frequências de transformação. Além disso, a tecnologia de bombardeio de partículas que usamos também pode ser aplicada à transferência de genes para outras monocotiledôneas, como trigo, arroz, sorgo e outras plantas até mesmo dichot.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como medir a lignina clayson a partir de li, sem biomateriais de celulose. É importante mencionar que trabalhar com ácido sulfúrico a 72% pode ser extremamente perigoso, portanto, qualquer pessoal que manuseie o produto químico deve ser muito cauteloso e manter os produtos químicos e os armários de segurança e trabalhar com ele apenas sob uma capela de exaustão.