Quantificação de cancro da mama invasiva das células usando um modelo (3D) tridimensional

O objetivo geral do procedimento a seguir é avaliar a capacidade invasiva das células cancerígenas usando um ensaio de invasão tridimensional. Isso é feito primeiro cultivando células cancerígenas em uma matriz de membrana basal. A invasão celular da matriz é então observada por cinco ou mais dias por meio de microscopia de luz.

Na etapa final, as células são marcadas com anticorpos fluorescentes para localização das proteínas de interesse. Em última análise, a taxa de invasão de células cancerígenas e as alterações resultantes na expressão de proteínas podem ser analisadas por microscopia imunofluorescente. A principal vantagem desta técnica sobre as técnicas existentes, como o ensaio de invasão da câmara de Transwell, é que o ensaio de invasão de gel principal 3D imita melhor o ambiente in vivo que o câncer resolve em crescimento.

A implicação desta técnica é para a terapia do câncer, onde novas proteínas podem ser identificadas no estudo, que estão envolvidas na invasão e metástase do câncer. Antes de iniciar o procedimento de cultura, coloque a matriz da membrana basal em uma pipeta P 200 e as pontas da pipeta no gelo durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, use a ponta da pipeta gelada de 200 microlitros para espalhar 50 microlitros da matriz em um padrão espiral sobre o fundo de um prato confocal com fundo de vidro número um.

Em seguida, coloque o prato em uma incubadora de cultura de células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por pelo menos 30 minutos enquanto a matriz está passando por olhos de tripsina solidificados, uma placa de células de 70 a 80% confluente de 100 milímetros assim que as células começarem a se desprender. Inative a tripsina com 10 mililitros de meio e, em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugue as células por três minutos a 100 Gs e quatro graus Celsius enquanto as células estão girando.

Alíquota de 50 microlitros de matriz em um tubo de microcentrífuga de um mililitro por prato de matriz de membrana basal e coloque os tubos no gelo quando as células terminarem de girar. Aspirar o sobrenadante sem perturbar o chumbinho e, em seguida, reutilizar. Suspenda as células em um mililitro de meio e conte-as em seguida.

Transfira 2,5 vezes 10 para as quartas células para um novo tubo de microcentrífuga, completando a suspensão celular com meio até um volume final de 50 microlitros. Em seguida, adicione os 50 microlitros de matriz de membrana basal gelada às células na proporção de um para um para um para um volume final de 100 microlitros. Coloque suavemente a mistura de matriz para célula na matriz da membrana basal solidificada e permita que as células fiquem embutidas na matriz na incubadora de cultura de células.

Após 30 minutos, cubra a matriz com dois mililitros de mídia e coloque o prato de volta na incubadora, trocando a mídia todos os dias durante o experimento, use a objetiva de 10 x de um microscópio de luz uma vez por dia durante o experimento para tomar 20 interferências diferenciais. Imagens de contraste das colônias suspensas na matriz da membrana basal. Analise as imagens cegamente para determinar a formação estrelada da colônia celular.

Uma colônia é considerada estrelada se uma ou mais projeções do esteróide das células forem observadas. Para examinar as características morfogênicas das colônias 3D, remova as células da incubadora e coloque-as em uma bandeja de gelo. Aspire o meio e lave a colônia três vezes com dois mililitros de PBS frio.

Após a última lavagem, fixe as células em dois mililitros de solução de acetona a 20% e metanol a 80% por 20 minutos a quatro graus Celsius e, em seguida, leve a louça de volta à temperatura ambiente. Assim que a matriz da membrana basal estiver à temperatura ambiente, aspire o fixador e lave a placa três vezes com PBS, conforme demonstrado. Após a lavagem final, bloqueie qualquer ligação não específica nas células com dois mililitros de 3% BSA por pelo menos 30 minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, incube as células nos anticorpos primários de interesse diluídos em 3% de BSA à temperatura ambiente. Após uma hora, remova a solução de anticorpo primário após lavar o anticorpo primário não ligado três vezes com PBS, adicione o anticorpo secundário dissolvido em 3% BSA na diluição apropriada e incube as células por uma hora em temperatura ambiente no escuro. Depois de lavar o anticorpo secundário não ligado com PBS, core os núcleos das células em dois mililitros de hext 3, 3, 2, 5 8 em PBS por cinco minutos no escuro.

Em seguida, lave o hext não ligado das células cinco vezes com PBS. Após a quinta lavagem, adicione o meio de montagem diretamente na mistura de matriz para célula e cubra cuidadosamente o meio de montagem com uma lamínula de vidro para evitar interrupções na integridade da matriz da membrana basal para a mistura de células. Seque o prato durante a noite à temperatura ambiente e, em seguida, adquira imagens com um microscópio fluorescente nos comprimentos de onda de laser apropriados para os anticorpos usados nessas imagens.

MDA MB 2 3 1 células invadindo uma matriz 3D são ilustradas. As células foram incorporadas à matriz no primeiro dia e começaram a formar estruturas estreladas invasivas no terceiro dia. No quinto dia, uma invasão completa da matriz pôde ser observada.

O número de colônias estreladas formadas foi então contado e expresso como uma porcentagem do número total de colônias invasoras e não invasivas por prato. Além disso, como as medições foram concluídas diariamente durante cinco dias, a taxa de invasão também pôde ser avaliada nessas imagens imunofluorescentes. Colônias estreladas invasivas representativas de células MDA MB 2 3 1 exibindo uma perda de integridade da membrana e localização difusa da proteína da membrana basal laminina cinco são mostradas em forte contraste com o que é observado nas células de câncer de mama MDA MB 2 31.

A laminina cinco foi localizada em uma camada de membrana basal intacta envolvendo a memória asinina das células MCF 10 A não malignas não tratadas. Após este procedimento, a co-cultura com células estromais pode ser realizada para responder a perguntas adicionais, como a conversa cruzada das células cancerígenas com as células estromais no microambiente após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da oncologia explorarem a invasão e migração do câncer, ambas necessárias para a disseminação metastática de células cancerígenas.