Quantificação de cancro da mama invasiva das células usando um modelo (3D) tridimensional

O objetivo geral do procedimento a seguir é avaliar a capacidade invasiva de células cancerígenas utilizando um ensaio de invasão tridimensional. Isso é realizado primeiramente cultivando-se as células cancerígenas em uma matriz da membrana basal. A invasão celular da matriz é então observada por cinco ou mais dias por meio de microscopia de luz.

No passo final, as células são marcadas com anticorpos fluorescentes para a localização das proteínas de interesse. Em última análise, a taxa de invasão de células cancerígenas e as alterações resultantes na expressão proteica podem ser analisadas por microscopia de imunofluorescência. A principal vantagem desta técnica em relação às técnicas existentes, como o ensaio de invasão em câmara Transwell, é que o ensaio de invasão em gel matriz 3D simula melhor o ambiente in vivo no qual o câncer cresce e se desenvolve.

A implicação desta técnica no tratamento do câncer é a identificação de novas proteínas envolvidas na invasão e metástase do câncer. Antes de iniciar o procedimento de cultivo, coloque a matriz da membrana basal, uma pipeta P200 e ponteiras sobre gelo durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, utilize a ponta da pipeta de 200 microlitros gelada para espalhar 50 microlitros da matriz em um padrão espiral sobre o fundo de um recipiente de vidro de fundo óptico número um para microscopia confocal.

Em seguida, coloque a placa em uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por pelo menos 30 minutos enquanto a matriz está sofrendo solidificação. Adicione tripsina aos olhos, uma placa de 100 milímetros de células com 70 a 80% de confluência, assim que as células começarem a se desprender. Inative a tripsina com 10 mililitros de meio e, em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugue as células por três minutos a 100 Gs e 4 graus Celsius enquanto as células estão sedimentando.

Aliquotar 50 microlitros de matriz em um tubo microcentrífugo de um mililitro para cada placa de matriz da membrana basal e colocar os tubos no gelo assim que as células terminarem de centrifugar. Aspirar o sobrenadante sem perturbar o pellet e, em seguida, ressuspender. Suspender as células em um mililitro de meio e contá-las em seguida.

Transfira 2,5 vezes 10 à quarta potência de células para um novo tubo de microcentrífuga, completando a suspensão celular com meio até um volume final de 50 microlitros. Em seguida, adicione 50 microlitros de matriz da membrana basal gelada às células numa proporção de um para um, obtendo um volume final de 100 microlitros. Plaque suavemente a mistura de matriz e células sobre a matriz da membrana basal solidificada e deixe as células incorporarem-se à matriz no incubador de cultura celular.

Após 30 minutos, cubra a matriz com dois mililitros de meio e devolva a placa ao incubador, trocando o meio a cada dia durante toda a duração do experimento. Utilize o objetivo de 10 x de um microscópio óptico uma vez ao dia durante todo o período do experimento para obter 20 imagens de contraste de interferência diferencial das colônias suspensas na matriz da membrana basal. Analise as imagens de forma cega para determinar a formação estelar das colônias celulares.

Uma colônia é considerada estelada se forem observadas uma ou mais projeções a partir do corpo de células. Para examinar as características morfogênicas das colônias tridimensionais, remova as células do incubador e coloque-as sobre uma bandeja com gelo. Aspire o meio e lave a colônia três vezes com dois mililitros de PBS frio.

Após a última lavagem, fixe as células em dois mililitros de solução contendo 20% de acetona e 80% de metanol por 20 minutos a quatro graus Celsius e, em seguida, retorne as placas à temperatura ambiente. Assim que a matriz da membrana basal atingir a temperatura ambiente, aspire o fixador e lave a placa três vezes com PBS, conforme acabou de ser demonstrado. Após a lavagem final, bloquee quaisquer ligações inespecíficas nas células com dois mililitros de BSA 3% por pelo menos 30 minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, incubar as células nos anticorpos primários de interesse diluídos em BSA 3% à temperatura ambiente. Após uma hora, remover a solução de anticorpo primário lavando o anticorpo primário não ligado três vezes com PBS, adicionar o anticorpo secundário dissolvido em BSA 3% na diluição apropriada e incubar as células por uma hora à temperatura ambiente no escuro. Após lavar o anticorpo secundário não ligado com PBS, corar os núcleos das células em dois mililitros de hext 3,3',2,5,8 em PBS por cinco minutos no escuro.

Em seguida, lave as células cinco vezes para remover o hext não ligado com PBS. Após a quinta lavagem, adicione o meio de montagem diretamente sobre a mistura de matriz com células e cubra cuidadosamente o meio de montagem com uma lamínula de vidro para evitar qualquer comprometimento da integridade da mistura de matriz da membrana basal com as células. Seque a placa durante a noite à temperatura ambiente e, então, obtenha imagens com um microscópio de fluorescência nos comprimentos de onda apropriados para os anticorpos utilizados nestas imagens.

Células MDA MB 2 3 1 invadindo uma matriz 3D são ilustradas. As células foram incorporadas à matriz no primeiro dia e começaram a formar estruturas estelares invasivas a partir do terceiro dia. No quinto dia, pôde-se observar uma invasão completa da matriz.

O número de colônias estreladas formadas foi então contado e expresso como uma porcentagem do número total de colônias invasivas e não invasivas por placa. Além disso, como as medições foram realizadas diariamente durante cinco dias, a taxa de invasão também pôde ser avaliada nessas imagens de imunofluorescência. Colônias estreladas invasivas representativas de células MDA MB 2 3 1, exibindo perda da integridade da membrana e localização difusa da proteína da membrana basal laminina cinco, são mostradas em forte contraste com o observado nas células de câncer de mama MDA MB 2 31.

A laminina cinco foi localizada em uma camada íntegra da membrana basal que envolve os ácinos de memória das células MCF 10 A não malignas e não tratadas. Após este procedimento, pode-se realizar o cultivo em co-cultura com células estromais para responder perguntas adicionais, como se as células cancerígenas estabelecem comunicação cruzada com as células estromais no microambiente após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de oncologia explorarem a invasão e a migração do câncer, ambas necessárias para a disseminação metastática das células tumorais.