Name: Configurando um Microscópio folha de luz simples para Em Toto Imagem de C. elegans Desenvolvimento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-05T16:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprenda a configurar um microscópio de folha de luz para imagem in vivo de embriões de C. elegans. Este método permite capturar divisões celulares e dinâmica de proteínas com menor fototoxicidade que a microscopia confocal.

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Agradecemos a todos os membros da Lenne e laboratórios Bertrand, em particular Olivier Blanc para desenvolvimento de software e Jérémie Capoulade para discussão. Agradecemos também a facilidade de imagem PICsL-IBDM, em particular Claude Moretti e Brice Detailleur para suporte técnico. Este trabalho foi apoiado por subsídios Atip do CNRS (a P.-FL e VB), o Labex INFORMAR concessão (para P.-FL e VB) e uma bolsa da Sanofi-Aventis (para VB). Reconhecemos infraestrutura France-BioImaging apoiado pela Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-InSb-04-01, chamada &quot;Investissements d&#39;Avenir&quot;).

1. Configuração da Folha de Luz eo Caminho de Detecção A Figura 1 apresenta um esquema geral da configuração óptica. <ol><li> Coloque e fixe o microscópio e os lasers na mesa óptica. </li><li> Combine lasers 488 nm, 561 nm e 405 nm, com os correspondentes espelhos dicróicas. Após os espelhos dicróicos, os lasers têm de ser precisamente co-alinhadas. Note-se que a escolha dos comprimentos de onda de laser, os espelhos dicróicos, filtros ópticos e é determinada a partir dos espectros de absorção dos marcadores fluorescentes específicos utilizados nas experiências. </li><li> Coloque o filtro sintonizável acústico-ótico (AOTF). Use a folha de teste fornecido pelo fornecedor para ajustar a frequência ea potência do AOTF. Quando bem alinhada, cerca de 90% da energia do laser é transmitido a um máximo de ajuste tal como medido por um powermeter. Note que alguns lasers pode ser totalmente controlado por software, o que poderia tornar o AOTF desnecessário. </li><li> Coloque e fixeo telescópio. Note-se que o telescópio é composta por duas lentes que ampliam o feixe com uma largura igual ou maior do que o diâmetro da abertura da parte de trás da lente objectiva iluminação. A lente com distância focal menor deve vir em primeiro lugar. </li><li> Lugar, alinhar e fixar o periscópio trazendo para cima do percurso óptico mais perto da abertura da parte de trás da lente cilíndrica. Note-se que os dois espelhos do periscópio são montados de uma forma que o seu eixo longo está colocando na inclinação do espelho para refletir o feixe totalmente expandida. </li><li> Coloque a lente cilíndrica próxima da saída de periscópio. Note-se que a lente cilíndrica focaliza o feixe em um sentido e deixa colimada na outra direção, formando assim uma folha de luz. </li><li> Recentrar a folha de luz resultante usando a lente objetiva iluminação. Note-se que o ponto focal imagem da objectiva de iluminação deve coincidir com o ponto focal do objecto o objectivo de detecção. Projeto do feixeem uma tela (por exemplo, uma parede) em uma longa distância. Mova o objetivo de iluminação ao longo do eixo do feixe de iluminação para obter na tela contornos nítidos da folha de luz. </li><li> Coloque a linha quad (405/488/561/638) filtro de emissão no lugar reservado no microscópio (cubo). </li><li> Coloque a câmara EMCCD na porta de saída do microscópio. </li><li> Fixar o primeiro estágio de translação manual sobre o palco de microscópio por meio de parafusos em furos na platina do microscópio. Note-se que a borda da plataforma de translação tem de ser posicionado a cerca de 2 cm de distância a partir do centro da platina do microscópio, de modo a que a tina é centrado por baixo da lente objectiva de detecção. </li><li> Fixar o segundo estágio de translação manual sobre o primeiro. As direções das duas etapas tem que ser perpendicular (X e Y traduções). </li><li> Fixar a fase Z piezoeléctrico no topo das duas fases anteriores. Note-se que uma plataforma motorizada pode ser utilizado em vez do estágio piezeléctrico. </li><li> Fixe o holde tinar (ver Figura 2), na parte superior das fases. A cuvete irá, assim, ser colocado na intersecção do caminho de iluminação e o caminho de detecção, que são perpendiculares um ao outro. </li></ol> 2. Verificar a folha de luz <ol><li> Encha uma tina de vidro com solução fluorescente, e colocá-lo no porta-amostras no cruzamento dos dois caminhos ópticos. A folha de luz é assim visível. Tem de ser horizontal, e simétrico / centrada em relação à lente objectiva de detecção. </li><li> Retirar a lente cilíndrica e adquirir uma imagem para medir a espessura da folha de luz. Note-se que a espessura da folha de luz depende da abertura numérica (AN) da iluminação da lente objectiva (cerca de 3-4 mm para NA = 0,3). Note-se que para uma dada lente, a espessura da folha, a luz pode ser aumentada reduzindo o tamanho do feixe de entrar na abertura traseira, com uma fenda. Note-se que as microesferas fluorescentes pode ser utilizado para medir o machadoial e resolução lateral do microscópio. </li><li> Volte a colocar a lente cilíndrica antes de iniciar o experimento. </li></ol> 3. A montagem de C. elegans Embriões Os passos seguintes são apresentados na Figura 3. <ol><li> Use uma caneta de marcação de diamante para cortar um pedaço de uma lâmina de vidro de 10 x 20 x 1 mm. </li><li> Prepare 5% bacto-agar na água, fervê-lo e mantê-lo em um bloco de aquecimento a 60 ° C. </li><li> Adicionar 50 ul de poli-L-lisina sobre um lado da peça de corte da lâmina, deixá-lo secar. </li><li> Coloque uma lâmina de microscópio no banco e corrigi-lo. </li><li> Justapor a peça de corte de lâmina com a lâmina fixa e adicionar uma gota de agar derretido no topo. Esprema o agar usando outra lâmina de microscópio limpa para obter um bloco de ágar fina. </li><li> Permitir que o bloco de ágar para secar antes de retirar o top slide. </li><li> Cortar a almofada de ágar sobre o lado da lâmina fixa, de modo a deixar um excesso de cerca de 3 mm of agar e remova cuidadosamente a lâmina fixa. </li><li> Adicionar 50 mL de poli-L-lisina sobre o agar e deixe secar completamente. </li><li> Coloque vermes grávidas em meio M9 em um vidro de relógio. </li><li> Cortar os vermes ao nível da vulva com um bisturi para libertar os embriões. </li><li> Sob um binóculo identificar os embriões na fase de interesse e recolhê-las usando uma pipeta microcapilar. </li><li> Colocar os embriões na parte do agar revestidos com poli-L-lisina, que se projecta a partir da peça de corte da lâmina. Coloque os embriões apenas junto à fronteira do slide. Não posicione os embriões na fronteira do agar, porque não vai ser estável o suficiente. Remover cuidadosamente o líquido, de modo que os embriões vai ficar sobre a camada de poli-L-lisina. </li><li> Alinhar rapidamente os embriões para evitar a dessecação. </li><li> Colocar a lâmina de corte em um prato de plástico Petri e adicione delicadamente meio M9 para cobrir o slide. </li><li> Verifique sob um binóculo que os ovos ainda estão presos no ágar. </li&gt; </ol> 4. Gravação de C. Desenvolvimento elegans <ol><li> Fixar a preparação anterior (corte deslizante, além de embriões de agar) no suporte de amostra e coloca-se numa cuvete. Figura 4 descreve o titular caseiro e A Figura 5 mostra uma vista da tina em contexto de observação. </li><li> Fixar a cuvete na fase piezoeléctrico. </li><li> Identificar a posição dos embriões com iluminação de campo brilhante. </li><li> Inicie o software feito em casa controlando a AOTF, a câmera eo estágio piezoelétrico. Note-se que um software livre, tal como micromanager, também pode ser utilizado. </li><li> Selecione a linha de laser e de energia (AOTF). </li><li> Ajustar a posição da folha de luz utilizando a fase três instruções de suporte da lente cilíndrica e a lente de iluminação. Mover o palco ao longo da direcção lateral (X) para obter o sinal mais brilhante. Ajustar então a posição Z da folha de luz, e a posição longitudinal (Y) para obter the melhor relação sinal-ruído. Note-se que a posição do foco folha de luz pode ter de ser ajustada a partir de um embrião de um outro para corrigir as diferenças de comprimento de caminho de luz. </li><li> Para adquirir imagens de lapso de tempo, selecione o tempo de exposição, o ganho, o tempo entre duas imagens, bem como o número de imagens a serem adquiridas, eo poder do laser. Para 2 aquisição de cores, selecione uma segunda linha de laser. Duas imagens coloridas são adquiridos de forma consecutiva. </li><li> Para adquirir pilha az, selecione também a distância entre as duas fatias, eo início e fim posições do piezoelétrico. </li></ol>

<ol><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305, 1007-1009 (2004).</li>
<li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136, 1963-1975 (2009).</li>
<li>Reynaud, E. G., Krzic, U., Greger, K., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet-based+fluorescence+microscopy%3A+more+dimensions%2C+more+photons%2C+and+less+photodamage%5BTitle%5D)+AND+%22HFSP+J%22%5BJournal%5D)">Light sheet-based fluorescence microscopy: more dimensions, more photons, and less photodamage.</a> HFSP J. 2, 266-275 (2008).</li>
<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 100, 64-119 (1983).</li>
<li>Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+embryonic+morphogenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans.</a> Methods Cell Biol. 106, 377-412 (2011).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverted+selective+plane+illumination+microscopy+%28iSPIM%29+enables+coupled+cell+identity+lineaging+and+neurodevelopmental+imaging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 17708-17713 (2011).</li>
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<li>Gao, L., Shao, L., Higgins, C. D., Poulton, J. S., Peifer, M., Davidson, M. W., Wu, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+Imaging+beyond+the+Diffraction+Limit+of+3D+Dynamics+in+Thickly+Fluorescent+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noninvasive Imaging beyond the Diffraction Limit of 3D Dynamics in Thickly Fluorescent Specimens.</a> Cell. 151, 1370-1385 (2012).</li>
<li>Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiview+light-sheet+microscope+for+rapid+in+toto+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging.</a> Nat Methods. 9, 730-733 (2012).</li>
<li>Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+high-speed+imaging+of+entire+developing+embryos+with+simultaneous+multiview+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy.</a> Nat Methods. 9, 755-763 (2012).</li>
<li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Even+fluorescence+excitation+by+multidirectional+selective+plane+illumination+microscopy+%28mSPIM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Even fluorescence excitation by multidirectional selective plane illumination microscopy (mSPIM).</a> Opt Lett. 32, 2608-2610 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo descreve uma configuração fácil de microscopia folha de luz para imagem in vivo de C. elegans embriões. Os elementos ópticos necessários para criar e alinhar a folha de luz, incluindo lasers, expansor de feixe, colimação e lentes de foco, pode ser facilmente montado em um banco óptico. Em combinação com um microscópio vertical para o caminho detecção ea câmera, este fornece uma solução simples de configurar uma folha de microscópio de luz. Essa geometria faz com que o ambiente de exemplo simples. O espécime vivo é colocado em uma cuba de vidro, que é realizada, posicionado e movido por um pequeno conjunto de peças mecânicas. Como microscopia iluminação folha é uma técnica de campo grande com capacidade de corte, apenas um único eixo motorizado movimento é necessário para imagens 3D. Isto limita o requisito de sincronização para um único elemento de varrimento e facilita o desenvolvimento do software. Comparado com ISPIM 6 nossa geomet verticalry permite o uso de elevados lente objectiva NA para detecção. Comparada com as configurações SPIM com lentes objectivas em relação ao plano horizontal da montagem da amostra e a imagem de uma série de embriões são mais fáceis. Ao todo, a implementação desta técnica é simples e pode ser alcançado com pouca experiência em ótica. Isto é uma alternativa mais barata a microscopia confocal, com as vantagens de uma maior velocidade e fototoxicidade reduzida, mas inconveniente de uma resolução axial inferior. Também desenvolvemos uma maneira fácil e reprodutível para montar C. embriões elegans para imagem in vivo utilizando este sistema. O procedimento de montagem é rápida (15 minutos) e é adequado para experiências diárias. Para C. elegans imagem, as vantagens desta configuração simples são pelo menos duas dobras: (i) em imagem toto é possível sem rotação e, portanto, a reconstrução 3D é simples; (Ii) a montagem da amostra é fácil e vários embriões podem ser visualizados sequencialmenteno mesmo slide. Nós mostramos exemplos de filmes de lapso de tempo com resolução temporal suficiente para observar as divisões celulares e alterações na forma celular. O poder de microscopia folha de luz para estudar C. desenvolvimento elegans também foi ilustrado recentemente por outros 6, 7, 8. Portanto, esta técnica vai ser muito útil para estudar a morfogénese e padronização da C. elegans embrião. Este sistema pode também ser utilizado para analisar o desenvolvimento de outros organismos modelo? É importante reconhecer que a implementação de microscopia de iluminação folha para pequenas e transparente organismo, como C. elegans é menos rigorosa do que para organismos maiores, como embriões de Drosophila. In toto imagens de Drosophila normalmente requer rotação e multi-view reconstruções 9, 10. Excitação de dois lados com lentes objetivas de excitação colineares também pode reduzir os efeitos de sombra causados ​​pela attenuatíon da luz 11. No entanto, a configuração aqui apresentada é ainda adaptado para a imagem de um lado dos embriões de Drosophila, com baixo branqueamento e baixo photoxicity. Esta configuração também pode ser útil para imagem pequenas e transparentes embriões como ascídias ou peixe-zebra.

A formação ea formação de um organismo envolve movimentos celulares, mudanças no formato da célula, divisão celular e diferenciação celular. Compreender a progressão e coordenação destes processos exigem ferramentas de imagem rápidos com capacidade de três dimensões e resolução subcelular. Entre as técnicas com estes em recursos de imagem in vivo, microscopia de iluminação luz folha também chamada microscopia de iluminação avião single / seletiva tem a vantagem única de produzir efeitos de baixa phototoxic e baixa fotodegradação 1,2. Em microscopia de iluminação da folha, a amostra é iluminada a partir do lado de uma folha de luz, o qual executa o corte óptico. O caminho de iluminação e o caminho de detecção são perpendiculares uns aos outros e a folha leve está alinhado de forma a coincidir com o objecto plano focal da lente objectiva de detecção. A amostra é colocada na intersecção dos dois caminhos, umnd pode ser movido ao longo do eixo para permitir a detecção de imagem 3D. Apenas o plano de interesse é iluminado e todos os pontos deste plano são detectados ao mesmo tempo. Isto aumenta significativamente a velocidade de aquisição e reduz a fotodegradação, bem como fototoxicidade em comparação com microscopia confocal 3. Praticamente, microscopia de iluminação folha é fácil de configurar e align: para dois imagem dimensional, sem varredura é necessário nem para a parte de detecção, nem para a parte de iluminação; como uma técnica de campo largo com capacidade de corte, a imagem tridimensional pode ser obtida através de um único movimento do eixo da fase, com a amostra. Aqui apresentamos a criação de um microscópio simples folha de luz e sua implementação no toto imagens de C. elegans embriões. C. elegans embriões são bem adaptados para viver in vivo imaging devido a sua transparência, linhagem invariante e estereotipada célula posiciona 4,5. A configuração da folha de luz desenvolvido baseia-se num microscópio vertical padrão para a detecção. O protocolo apresentado abaixo detalha como construir e alinhar o módulo de excitação / caminho, testar e caracterizar a folha de luz e montar a amostra para geração de imagens 3D. Ele também fornece exemplos de filmes time-lapse adquiridos com a configuração em várias cepas expressando marcadores fluorescentes.

<table><tbody><tr><td>SPIM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Microscópio vertical de detecção</td></tr><tr><td></td><td>ZEISS</td><td>Axiophot 1</td><td></td></tr><tr><td>100x W objetiva (NA 1.1, W.D. 2.5mm)&nbsp;</td><td>NIKON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EMCCD retroiluminado</td><td>ANDOR</td><td>DU-885K-CS0-#VP</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Iluminação</td></tr><tr><td>LASER 488 nm / 60 mW</td><td>TOPTICA</td><td>iBeam smart</td><td></td></tr><tr><td>LASER 405 nm / 120 mW</td><td>TOPTICA</td><td>iBeam smart</td><td></td></tr><tr><td>LASER 561 nm / 500 mW</td><td>COBOLT</td><td>JIVE 500</td><td>&nbsp; para imagens de lapso de tempo, 50 ou 100mW é suficiente</td></tr><tr><td>filtro Banda de rejeição de laser de linha quádrupla ZET 405/488/561/638</td><td>AHF</td><td>F57-405</td><td></td></tr><tr><td>Dicróico 405</td><td>AHF</td><td>F38-405</td><td></td></tr><tr><td>Dicróico 488</td><td>SEMROCK</td><td>Di01-R488</td><td></td></tr><tr><td>AOTF</td><td>AA</td><td>AOTFnC-400.650-TN</td><td></td></tr> lente <tr><td>espelhada</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mm</td><td>THORLABS</td><td></td><td>telescópio lente 5X</td></tr><tr><td>200 mm</td><td>THORLABS</td><td></td><td>telescópio 5X</td></tr><tr><td>periscópio</td><td>THORLABS</td><td>RS99/M</td><td></td></tr><tr><td>lente cilíndrica f=100mm</td><td>THORLABS</td><td>ACY254-100-A</td><td></td></tr><tr><td>10X NA 0,3</td><td>NIKON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>xyz stage</td><td>NEWPORT</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Amostra</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Bectkton Dickinson</td><td>214010</td><td>5% em solução de</td></tr><tr><td>Poli-L-Lisina em água&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Capilares GC100F-10, 1,0 mm oD, 0,58 mm ID, 100 mm L</td><td>Havard Appartus</td><td>30-0019</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de aspiração (pipeta de boca)</td><td>Dutsher</td><td>55005</td><td></td></tr><tr><td>M9 médio:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>KH2PO4 (3g/L)</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 (6g/L)</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCL (5g/L)</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 (1 mM final)</td> <td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de suporte de cubeta</td><td>FEITO EM CASA feito</td><td></td><td>por Brice Detailleur&nbsp;</td></tr><tr><td>porta-amostras</td><td>HOME MADE</td><td></td><td>feito por Claude Moretti&nbsp;</td></tr><tr><td>x estágio</td><td>NEWPORT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lamínula 50x20x1 mm</td><td>MARIENFELD</td><td></td><td>cortado em seguida em 10x20x1mm</td></tr><tr><td>piezo palco elétrico com amplificador/controlador</td><td>PI</td><td>P-622. Cubeta ZCD / E-625.CR</td><td></td></tr><tr><td>40mmx40mmx10mm</td><td>HELLMA</td><td>704.002-OG.40 mm- 10mm de altura</td><td></td></tr><tr><td>Lápis de marcação de vidro com ponta de diamante</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software</td></tr><tr><td>C++ (Qt) software</td><td></td><td></td> caseiro <td>desenvolvido por Olivier Blanc e Claire Chard&egrave; s, disponível mediante solicitação. Soluções alternativas: micromanager ou labview&nbsp;</td></tr></tbody></table>

configurando um microscópio folha de luz simples para<em&gt; em toto</em&gt; imagem de<em&gt; c. elegans</em&gt; desenvolvimento

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Técnicas rápidas e baixas de imagem phototoxic são pré-requisito para estudar o desenvolvimento de organismos in toto. Microscopia folha de luz com base reduz foto-branqueamento e ação fototóxica em comparação com a microscopia confocal, proporcionando imagens em 3D com resolução subcelular. Aqui apresentamos a configuração de um microscópio folha base de luz, que é composto por um microscópio vertical e um pequeno conjunto de elementos opto-mecânico para a geração da folha de luz. O protocolo descreve como construir, alinhar o microscópio e caracterizar a folha de luz. Além disso, ele detalha como implementar o método no toto imagens de C. elegans embriões utilizando uma câmara de observação simples. O método permite a captura de 3D e duas cores filmes time-lapse mais algumas horas de desenvolvimento. Isso deve facilitar o rastreamento de forma da célula, as divisões celulares e proteínas marcadas por longos períodos de tempo.

Três experimentos de gravação de lapso de tempo 3D a partir de três diferentes C. elegans estirpes ilustrar o tipo de dados que podem ser obtidos usando a configuração do microscópio folha de luz descrita acima. Nós verificamos que, nestas condições, os embriões se desenvolvem em velocidade normal e sobreviver a imagem, de acordo com relatórios anteriores, indicando que a imagem SPIM provoca apenas baixos níveis de fototoxicidade em C. elegans embriões 6,7. A primeira linhagem expressa uma histona fundida a GFP (zuIs178; stIs10024). A gravação foi realizada durante 2 horas, com uma pilha de fatias 20 (distância entre fatias de 1 um) feita a cada 37 seg. Figura 6 ilustra um plano da pilha em diferentes pontos de tempo. Ambos os núcleos interphasic (seta) e cromatina condensada mitótico (cabeça de seta) são claramente visíveis. A segunda estirpe expressa um tubulina fundido a GFP (ruIs57) e uma histonafundido com mCherry (itIs37; stIs10226). A gravação foi realizada durante 16 min, com uma pilha de fatias 20 (distância entre fatias de 1 um) feita a cada 105 s. Figura 7 ilustra diferentes planos da pilha e diferentes pontos de tempo. O filme associado 1 apresenta reconstruções 3D em três momentos sucessivos. Durante a divisão, o fuso mitótico (verde) e cromossomos condensados ​​(vermelho) são claramente visíveis, permitindo o acompanhamento das orientações de divisão celular durante o desenvolvimento. A terceira estirpe expressa a apolipoproteína VIT-2 fundido a GFP (pwIs23) e uma membrana ligada mCherry (ltIs44). O registo foi feito durante 25 minutos, com uma pilha de fatias 10 (distância entre fatias de 1 um) feita a cada 30 seg. Figura 8 ilustra diferentes planos da pilha e diferentes pontos de tempo. Os movimentos rápidos das partículas de gema de lipoproteínas (verde) no interior das células podem ser facilmenteseguido. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1: configuração óptica SPIM composto da iluminação e detecção de unidades, frente e vista para o fundo. Na unidade de iluminação, os lasers combinados pelos espelhos dicróicos entrar AOTF, o qual controla a potência de cada laser independentemente. Em seguida, o telescópio aumenta o tamanho do feixe por 4 vezes e a periscópio traz para a altura do microscópio. A lente cilíndrica forma a folha de luz, que é reorientada pelo objectivo iluminação. A unidade de detecção é integrado no microscópio vertical e é composta principalmente por a lente de detecção, o filtro, o tubo de lente e o EMCCD. A amostra é colocada na intersecção entre os caminhos de iluminação e detecção. A fase piezoeléctrico permite vertical (Z) deslocamentos de amostrapara a aquisição 3D. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2:. Titular Cuvette O portador consiste em três placas de alumínio e é enroscado sobre a fase piezoeléctrico. A cuba de vidro é realizado por uma mola (em vermelho). <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3: Montagem protocolo de C. elegans embriões para experiências SPIM. A peça cortada de vidro é revestido com poli-L-lisina. Uma almofada de ágar é posicionada sobre a superfície revestida. Poli-L-lisina Adiciona-se então para a almofada de ágar. Finalmente, C. elegans embriões são alinhados na almofada de ágar revestidos com poli-L-lisina. Figura 4: Exemplo de titular. O detentor encaixa às dimensões interiores da tina de vidro. Duas molas (em vermelho) manter a lâmina de vidro (descrito na Figura 3). Este suporte é então colocado dentro da tina de vidro. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5:... Suporte da amostra no contexto observação embriões são imobilizadas sobre a lâmina de vidro de acordo com o protocolo resumido na Figura 3 A corrediça é mantida pelo suporte de amostras descrito na Figura 4 O suporte de amostra é inserida na cuvete de vidro, detida pelo titular descrito na Figura 2. A folha de luz é horizontal e illuminates os embriões a partir do lado. A lente da objectiva de detecção esteja na vertical, por cima da amostra. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6: a gravação de um C. elegans embrião expressar uma fusão histona :: GFP imagens individuais de um embrião transgênico avião expressar uma histona :: fusão GFP (zuIs178; stIs10024) em momentos diferentes imagens extraídas de uma gravação de lapso de tempo 3D:.. pilhas feitas de 20 fatias ( distância entre fatias de 1 mm); tempo de exposição por fatia: 30 ms; intervalo de tempo entre as pilhas: 37 seg; tempo de aquisição total: 2 horas. Arrow: núcleo interphasic, cabeça da seta: cromatina condensada mitótico. No instante t = 0 min, o embrião está na fase de 2 células-e a t = 120 min, o embrião contém cerca de 70 células como esperado sob s normais de desenvolvimentoxixi (notar que apenas as células contidas num mesmo plano são visíveis nas imagens e não todas as células do embrião). O poder de iluminação foi de 30 μW a 488 nm (medido na saída do objectivo de iluminação). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure6.avi" target="_blank">Clique aqui para ver este vídeo.</a> <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig7highres.jpg" width="500" /> Figura 7: A gravação de um C. elegans embrião expressando um Tubulin :: fusão GFP e uma histona :: fusão mCherry. Imagens extraídas de uma gravação de lapso de tempo 3D de um C. elegans embrião expressando um Tubulin :: fusão GFP (ruIs57) e um Histone :: fusão mCherry (itIs37; stIs10226). Condições de gravação: a aquisição de uma pilha de 20 fatias (distância entre fatias 1mm) a cada 105 seg; tempo de aquisição total: 16 min; tempo de exposição: 200 ms para cada canal. O painel A mostra 10 fatias da mesma pilha. O painel B mostra a mesma fatia cada 210 seg. O poder de iluminação foi de 30 μW e 300 μW, para 488 e 561 nm, respectivamente lasers (medido na saída do objectivo de iluminação). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure7.avi" target="_blank">Clique aqui para ver este vídeo.</a> <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig8highres.jpg" width="500" /> Figura 8: a gravação de um C. elegans embrião expressando uma VIT-2 :: GFP Fusion e um alvo a membrana mCherry. Imagens extraídas de uma gravação de lapso de tempo 3D de um C. elegans embrião expressando uma fusão VIT-2 :: GFP (PWIs23) e um mCherry direcionados à membrana (ltIs44). Condições de gravação: aquisição de uma pilha de 10 fatias (distância entre fatias 1 mícron) a cada 30 seg; tempo de aquisição total: 25 min; tempo de exposição por canal: 200 ms. O painel A mostra as 5 primeiras fatias da mesma pilha. O painel B mostra a mesma fatia cada 30seg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure8.avi" target="_blank">Clique aqui para ver este vídeo.</a>

Este protocolo descreve a configuração de uma folha de microscópio de luz e sua implementação para imagem in vivo de C. elegans embriões.

Configurando um Microscópio folha de luz simples para<em&gt; Em Toto</em&gt; Imagem de<em&gt; C. elegans</em&gt; Desenvolvimento

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens do desenvolvimento de C Allergan utilizando microscopia de folha de luz por fluorescência. Isso é realizado primeiramente configurando o microscópio baseado em folha de luz, composto por um microscópio invertido e um pequeno conjunto de elementos optomecânicos para gerar uma folha de luz. O segundo passo do procedimento é montar o embrião.As últimas etapas consistem em ajustar a folha de luz sobre o embrião e registrar seu desenvolvimento. Os resultados podem mostrar a dinâmica de proteínas marcadas com fluorescência durante o desenvolvimento de CL egan por meio da análise de vídeos tridimensionais e de lapso de tempo. As principais vantagens da microscopia de folha de luz em comparação com outros métodos existentes, como a microscopia confocal, são que ela permite uma aquisição de imagens mais rápida com menor fototoxicidade.Terceiro, este método pode fornecer informações sobre o selo contra o desenvolvimento. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como roil ou peixe-zebra. A demonstração do procedimento será clara.Shales, um engenheiro do meu laboratório, e Pauline Linac, uma engenheira do laboratório de van. Esta seção descreve a montagem do conjunto, que pode permanecer montada para todos os experimentos. Uma vez que os lasers, filtros, telescópio e periscópio tenham sido posicionados na mesa óptica, fixe a lente cilíndrica para gerar a folha de luz.Uma lente diferente é ajustada para focar. O ponto focal da objetiva de iluminação deve coincidir com o ponto focal objeto da objetiva de detecção. Agora, projete o feixe na parede ou na tela e mova a objetiva de iluminação ao longo do eixo do feixe até que os contornos da projeção estejam nítidos.Inclua um filtro de emissão com quatro linhas e uma câmera E-M-C-C-D na configuração do microscópio. Fixe o segundo estágio de translação manual ao primeiro de maneira perpendicular. Parafuse o conjunto ao estágio existente do microscópio.Após remover o objetivo de iluminação com lente cilíndrica fixa, posicione o conjunto no microscópio e recoloque o conjunto de iluminação nas platinas. Fixe o suporte qve na interseção perpendicular entre o caminho de iluminação e o caminho de detecção. Agora, verifique a lâmina de luz.Encha um vete de vidro com solução de fluoresceína e coloque-o no suporte sobre as plataformas. A folha de luz deve ser visível. Deve estar horizontal e centralizada em relação à lente do objetivo de detecção.Em seguida, remova a lente cilíndrica. Otimize a folha de luz com a translação tridimensional do objetivo de iluminação e adquira uma imagem para medir a espessura da folha de luz. Isso depende da abertura da lente objetiva.Em seguida, certifique-se de substituir a lente cilíndrica. Primeiro, corte um pedaço de vidro com um milímetro de espessura, com 10 milímetros por 20 milímetros. Utilize uma caneta de marcar com ponta de diamante.Em seguida, adicione 20 microlitros de poli-L-lisina em um dos lados e, após secar, posicione-o ao lado de um segundo lâmina. Em posição fixa, adicione uma gota de ágar a 5% e alise-a com o peso de uma terceira lâmina colocada por cima. Após a secagem do ágar, remova a terceira lâmina e corte o bloco de ágar a três milímetros da borda das duas lâminas restantes, sobre a lâmina sem poli-L-lisina.Em seguida, remova o lâmina fixada, deixando uma sobra de ágar. Cubra o ágar com 20 microlitros de poli-L-lisina e deixe secar. Agora, coloque os vermes GR em um copo de vidro contendo meio M nove sob um microscópio estereoscópico.Corte os vermes com uma lâmina de bisturi ao nível da vulva, liberando assim os ovos. Em seguida, identifique os embriões que estão no estágio de interesse e colete-os com uma pipeta capilar de micro. Transfira os embriões para a saliência de ágar acima da lâmina preparada, posicionada logo ao lado da borda da lâmina, não na borda do ágar.Em seguida, alinhe os embriões com uma pipeta de micropipeta capilar enquanto remove o líquido. Por aspiração, os embriões aderirão à poliolisina. É muito importante posicionar corretamente os embriões para obter uma boa gravação, e isso exige uma micropipeta com a abertura adequada.Se for muito pequeno, será difícil liberar os embriões. Se for muito grande, será difícil controlar rigorosamente o fluxo vazado e alinhar os embriões. Cubra a lâmina com meio M nove em uma placa de Petri e confirme, com auxílio de ampliação, que os embriões ainda estão aderidos ao ágar. Agora, fixe a lâmina preparada com os embriões ao suporte de amostra que se encaixa em um vete.O suporte é um dispositivo feito internamente, projetado para se encaixar em um vete. Em seguida, fixe o vete a uma plataforma piezoelétrica e, sob iluminação em campo claro, localize um embrião. Agora inicie o pacote de software que controla o filtro acusto-óptico sintonizável.Filtre a câmera e o estágio. Este software foi desenvolvido internamente, mas o software gratuito Micromanager também pode ser utilizado. Primeiro, selecione a linha do laser.Em seguida, ajuste o estágio ao longo do eixo x até que a lâmina de luz esteja em seu brilho máximo. Depois, ajuste as outras duas dimensões, Y e Z, até que a relação sinal-ruído esteja na sua melhor condição. Isso pode precisar ser repetido para cada embrião.Esta chave é fundamental para otimizar a relação sinal-ruído a fim de obter uma gravação adequada, traduzindo o estágio livre, o suporte e a eliminação do objetivo quando existe uma simples relação para alcançar uma simulação contínua do embrião e o melhor contraste. Agora, adquira imagens em lapso de tempo, ajustando a potência do laser, o tempo de exposição, o ganho e o intervalo de aquisição de acordo com o nível de fluorescência do embrião e a velocidade do processo biológico analisado. Para Zack.A aquisição de imagens definiu a distância entre as fatias e suas posições iniciais e finais em C. elegans expressando um construto de histona GFP. Foram realizadas aquisições com intervalo de duas horas, com 20 pilhas de fatias obtidas a cada 37 segundos. As divisões celulares foram claramente visíveis em uma linhagem que expressa tubulina fundida à GFP e histona fundida à mCherry. Gravações foram realizadas durante 16 minutos a cada 105 segundos.Renderizações 3D são mostradas em três pontos temporais. Os fusos mitóticos e os cromossomos condensados são claramente visíveis e facilmente rastreados ao longo das divisões celulares. Em uma terceira linhagem, a lipoproteína APO vit dois fundida à GFP foi observada com marcação de mCherry na membrana celular.Em mais de 13 minutos, foram obtidas 10 pilhas de fatias a cada 27 segundos. As partículas de lipoproteínas em movimento rápido foram fáceis de acompanhar. Aqui, utilizamos a folha de luz formada por métodos mais complexos para produzir.A folha de luz pode ser implementada para melhorar ainda mais a resolução espacial.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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