Configurando um Microscópio folha de luz simples para Em Toto Imagem de C. elegans Desenvolvimento
May 5th, 2014
Este protocolo descreve a configuração de uma folha de microscópio de luz e sua implementação para imagem in vivo de C. elegans embriões.
O objetivo geral deste procedimento é obter imagens do desenvolvimento de C Allergan usando microscopia de folha de luz fluorescente. Isso é feito primeiro configurando o microscópio baseado em folha de luz composto por um microscópio vertical e um pequeno conjunto de elementos optomecânicos para gerar uma folha de luz. A segunda etapa do procedimento é montar o embrião.
Os últimos passos são ajustar a folha de luz no embrião e registrar seu desenvolvimento. Os resultados podem mostrar a dinâmica de proteínas marcadas com fluorescência durante o desenvolvimento de CL egan por meio da análise de vídeos 3D e de lapso de tempo. As principais vantagens da microscopia lightship em relação a outros métodos existentes, como a microscopia confocal, é que ela permite imagens mais rápidas e com menor fototoxicidade.
Terceiro, esse método pode fornecer informações sobre a vedação contra o desenvolvimento. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como roil ou zebrafish. A demonstração do procedimento será clara.
Shales, um engenheiro do meu laboratório e Pauline Linac, uma engenheira do laboratório de van. Esta seção descreve o conjunto de instalação e ele pode ser deixado montado para todos os experimentos. Uma vez que os lasers, filtros, telescópio e periscópio tenham sido posicionados na mesa óptica, prenda a lente cilíndrica para gerar a folha de luz.
Uma lente diferente é ajustada para foco. O ponto focal da objetiva de iluminação deve coincidir com o ponto focal do objeto da objetiva de detecção. Agora, projete o feixe na parede ou tela e mova a objetiva de iluminação ao longo do eixo do feixe até que os contornos da projeção fiquem nítidos.
Inclua um filtro de emissão de linha quádrupla e uma câmera EMCD na configuração do microscópio. Fixe o segundo estágio de tradução manual ao primeiro de maneira perpendicular. Aparafuse o conjunto ao microscópio existente
Depois de remover a objetiva de iluminação da lente cilíndrica definida, posicione o conjunto no microscópio e coloque de volta a iluminação definida nos estágios. Fixe o suporte qve na interseção perpendicular do caminho de iluminação e do caminho de detecção. Agora, verifique a folha de luz.
Encha um copo com solução de fluoresceína e coloque-o no suporte nos palcos. A folha de luz deve estar visível. Deve ser horizontal e centralizado em relação à lente objetiva de detecção.
Em seguida, remova a lente cilíndrica. Otimize a folha de luz com a tradução 3D da objetiva de iluminação e adquira uma imagem para medir a espessura da folha de luz. Isso depende da abertura da lente objetiva.
Em seguida, certifique-se de substituir a lente cilíndrica. Primeiro, corte um pedaço de vidro de um milímetro de espessura, 10 milímetros por 20 milímetros. Use uma caneta de marcação de diamante.
Em seguida, adicione 20 microlitros de poli L lisina de um lado e, uma vez seco, justaponha-o a uma segunda lâmina. Em uma posição fixa, adicione uma gota de 5% de ágar e alise-o com o peso de um terceiro slide colocado no topo. Depois que o ágar secar, remova a terceira lâmina e corte a almofada de ágar três milímetros da borda das duas lâminas restantes sobre a lâmina sem poli L lisina.
Em seguida, remova a corrediça fixa, deixando uma saliência de ágar. Cubra o ágar com 20 microlitros de poli L lisina e deixe secar. Agora coloque os vermes GR em um vidro de relógio cheio de meio M nove sob um microscópio de dissecação.
Corte os vermes com um bisturi na altura da vulva, liberando assim os ovos. Em seguida, identifique os embriões que estão no estágio de interesse e colete-os com uma pipeta microcapilar. Transfira os embriões para a saliência do ágar fora da lâmina preparada ao lado da borda da lâmina, não na borda do ágar.
Em seguida, alinhe os embriões com uma pipeta microcapilar enquanto remove o líquido. Por aspiração, os embriões aderirão ao poliol lisina. É muito importante posicionar bem os embriões para obter um bom registro, e isso requer um capilar com a atura correta.
Se for muito pequeno, será difícil liberar os embriões. Se for muito grande, será difícil controlar rigidamente o fluxo vazado e alinhar os embriões, Cubra a lâmina com meio M nove em uma placa de Petri e confirme se os embriões ainda estão presos ao ágar usando ampliação. Agora, fixe a lâmina preparada com embriões no porta-amostras que se encaixa em um vete.
O suporte é uma engenhoca feita internamente que é projetada para caber em um vete. Em seguida, prenda o veterinário em um estágio elétrico Pizo e, sob iluminação de campo claro, localize um embrião. Agora inicie o pacote de software que controla o ajuste óptico acústico.
Filtre a câmera e o palco. Este software aqui foi escrito internamente, mas o freeware micromanager também pode ser usado. Primeiro, selecione a linha de laser.
Em seguida, ajuste o palco ao longo do eixo x até que a folha de luz esteja mais brilhante. Em seguida, ajuste as outras duas dimensões, Y e Z até que o sinal para o ruído esteja no seu melhor. Isso pode precisar ser repetido para cada embrião.
Esta chave para otimizar a relação sinal-razão para obter uma boa gravação traduzindo ly o de um estágio livre, apoiando o objetivo e eliminação quando eu apenas relacionamento para obter uma simulação ous do embrião e o melhor contraste. Agora adquira imagens de lapso de tempo defina a exposição à potência do laser, o ganho de tempo e o intervalo de imagem de acordo com o nível de fluorescência do embrião e a velocidade do processo biológico analisado. Para Zack.
A imagem definiu a distância entre as fatias e suas posições inicial e final em c elgan expressando uma construção de histona GFP. A imagem de lapso de tempo de duas horas foi feita com 20 pilhas de fatias tiradas a cada 37 segundos. As divisões celulares eram claramente visíveis em uma cepa expressando tubulina fundida à GFP e sua pedra fundida à cereja As gravações foram feitas por 16 minutos a cada 105 segundos.
As renderizações 3D são mostradas em três pontos de tempo. Os fusos mitóticos e os cromossomos condensados são claramente visíveis e facilmente rastreados através das divisões celulares. Em uma terceira cepa, a lipoproteína APO vit dois fundida à GFP foi fotografada com marcação mCherry da membrana celular.
Ao longo de 13 minutos, 10 pilhas de fatias foram retiradas a cada 27 segundos. Partículas de lipoproteína em movimento rápido eram fáceis de seguir. Aqui usamos a folha de luz formada por métodos mais complexos para produzir.
A folha de luz pode ser implementada para melhorar ainda mais a resolução espacial.
Visão Geral
Este protocolo descreve a configuração de um microscópio de luz em folha e sua implementação para imagens in vivo de embriões de C. elegans. O método permite imagens mais rápidas com menor fototoxicidade em comparação com a microscopia confocal.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biofísica
- Microscopia
Fundo
- A microscopia de luz em folha oferece uma abordagem única para a imagem de amostras biológicas.
- Esta técnica é particularmente útil para observar embriões vivos.
- Minimiza o fotodano, permitindo a imagem rápida.
- As aplicações se estendem a vários organismos modelo além de C. elegans.
Propósito do Estudo
- Visualizar o desenvolvimento de embriões de C. elegans usando microscopia de luz em folha com fluorescência.
- Analisar a dinâmica de proteínas marcadas com fluorescência durante o desenvolvimento.
- Demonstrar as vantagens da microscopia de luz em folha sobre métodos tradicionais.
Métodos Utilizados
- Configuração de um microscópio de luz em folha com elementos optomecânicos.
- Montagem de embriões em lâminas preparadas com pastilhas de ágar.
- Otimização do alinhamento da folha de luz para a imagem.
- Imagem time-lapse de embriões para capturar processos de desenvolvimento.
Principais Resultados
- Imagem bem-sucedida de divisões celulares e dinâmicas de proteínas em embriões de C. elegans.
- Renderizações 3D de fusos mitóticos e cromossomos foram obtidas.
- Demonstrou a capacidade de rastrear proteínas de movimento rápido.
- Forneceu insights sobre os processos de desenvolvimento do organismo.
Conclusões
- A microscopia de luz em folha é uma ferramenta poderosa para imagem in vivo.
- Este método melhora a compreensão do desenvolvimento embrionário.
- Pode ser adaptado para uso com outros organismos modelo.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Light sheet microscopy enables high-resolution, low-phototoxicity imaging of whole-organism development, supporting target validation in early discovery by providing quantitative, dynamic phenotypic data. This approach reduces biological uncertainty in preclinical models by allowing longitudinal tracking of cellular processes and protein dynamics in live systems. The method enhances predictive confidence in lead identification by delivering reproducible, scalable imaging outputs compatible with high-content screening workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through subcellular-resolution visualization of protein dynamics and cell divisions in developing embryos.
- Operational Value: Supports biological de-risking by providing reproducible, quantitative readouts of developmental phenotypes under low-phototoxic conditions.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by generating longitudinal, multi-parameter datasets that correlate molecular perturbations with developmental outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers standardized, 3D time-lapse imaging with subcellular resolution, enabling reliable compound effect assessment in whole-organism contexts.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through precise light sheet alignment and stabilization, minimizing variability in longitudinal imaging sessions.
- Scalability: Compatible with multi-well observation chambers and automated stage control, supporting medium-throughput screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by enabling consistent phenotypic assessment across model systems using standardized imaging protocols.
- Mechanistic De-risking: Allows direct observation of target engagement effects on developmental processes, reducing ambiguity in mechanism-of-action studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides quantitative thresholds for go/no-go decisions based on developmental toxicity and phenotypic normalization metrics.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead optimization, offering a non-destructive, quantitative imaging modality for phenotypic screening and mechanistic studies in whole-organism models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling real-time tracking of fluorescently labeled proteins and cellular structures during embryogenesis.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized slide preparation, light sheet characterization, and embryo mounting protocols that ensure imaging consistency.
- Analytics: Generates quantitative 3D and time-lapse readouts (e.g., mitotic spindle dynamics, protein trafficking) that enable objective comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing disease-relevant phenotypic readouts in C. elegans, a validated model for conserved developmental pathways.
- Enterprise Reuse: Designed as a modular, left-assembled system on an optical table, enabling repeated use across projects with minimal recalibration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct, longitudinal observation of protein dynamics and cellular behavior.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability via standardized opto-mechanical alignment, slide preparation, and embryo mounting procedures.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of developmental toxicity, reducing late-stage attrition due to unidentified biological risks.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering quantitative, imaging-based phenotypic scores that inform advancement decisions across target classes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical alignment, fluorescence microscopy, and sample preparation for live imaging.
- Needs stable optical table, laser sources, objectives, translation stages, and EM-CCD or sCMOS camera for detection.
- Demands cross-team standardization of slide preparation, embryo staging, and imaging parameters to ensure reproducibility across users and sites.
- Adaptation considerations include embryo size, optical clearing, and mounting medium compatibility when extending to other model systems (e.g., zebrafish, Drosophila).
- Practical limitations include embryo immobilization efficiency and light sheet uniformity over large fields of view, which may require optimization for longer imaging sessions.
