Name: Um ensaio para a lateral de Regeneração de Linha em Zebrafish Adulto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-08T19:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Aprenda um ensaio quantitativo de regeneração da linha lateral em peixe-zebra adulto usando Gentamicina e microscopia confocal. Este método permite analisar a recuperação de neuromastos e células ciliadas em modelos de doenças neurológicas.

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Os autores não têm nada a divulgar.

Todos os procedimentos são realizados seguindo as diretrizes descritas em &quot;Princípios de Laboratório Animal Care&quot; (Institutos Nacionais de Saúde não publicação. 85-23, revisado em 1985) e do protocolo de animais Comitê Institucional Animal Care e Use Rosalind Franklin University aprovado 08-19. 1. Gentamicina-indução de necrose das células do cabelo <ol><li> Prepare de sulfato de gentamicina em solução salina normal com uma concentração final de 0,004% (4,32 mM). </li><li> Coloque o peixe adulto (D. rerio, 4-6 meses de idade) em um recipiente que contém a 0,004% (4,32 mM) solução de gentamicina. Qualquer recipiente pode ser usado, mas utiliza um recipiente de peixe a partir de um sistema aquático Pharmacal que é 7, em largura, 6 de alta, e em 7 de comprimento. Colocar o recipiente com o peixe numa incubadora a 28 ° C durante 24 hr. Definir o volume total de fluido no tanque a um nível suficiente para manter os peixes num estado viável para o período de 24 horas. Nota: O arejamento do fluido de gentamicina não é necessary se volume suficiente é usado para o número de peixes a serem tratados. </li></ol> 2. Coloração Vital das células ciliadas <ol><li> Prepara-se uma concentração de 0,08% (em solução salina normal) do corante vital fluorescente [4-4-diethylaminostyryl iodeto)-N-metilpiridínio (485 nm de excitação e 603 nm λ λ emissão em metanol) a partir de uma solução de estoque de trabalho de 15 mg / ml em etanol. </li><li> Para determinar se o tratamento foi eficaz gentamicina um subconjunto de controlo e gentamicina peixes tratados são corados imediatamente através da colocação de peixe no poço de uma placa de 6 poços de cultura que contém o corante vital. Use um número suficiente de peixe (e placas de cultura, conforme exigido para significância estatística a ser alcançado. Baseado na velocidade do examinador de contagem neuromasto, coloque o peixe nas placas de forma escalonada ao longo do tempo para que os peixes não estão manchadas por mais de 75 min tal como descrito na etapa 2.3. </li><li> Coloque as placas a partir do passo 2.2 em uma gaveta banco pelo microscópio de fluorescência paraser utilizados para exame de neuromastos coradas. Desligue as luzes da sala para evitar a extinção do corante vital durante o período de coloração 1 hora em temperatura ambiente. </li><li> Prepare tanto corante wash-out e tanques de água anestésicos. Dye lavar-out água é água peixe normal e para água anestésico, adicione suficiente 2-fenoxietanol para que uma diluição 1:1.000 em peixes de água normal é alcançado. </li><li> Coloque o peixe na água em excesso peixes normais para enxaguar corante vital excesso e avançar para o passo 3.1 para observação de corante vital manchado peixes. </li><li> Para examinar a regeneração de neuromastos, transferir tratados pela gentamicina peixe que foram lavados em água de peixe normal de uma incubadora para entre 8-16 horas a 28 ° C. </li><li> Em diversos momentos entre 8-16 horas, os peixes são removidos da incubadora, lavado e corados tal como indicado nos passos 2,1-2,4. Avance para o passo 3.1 para observação de corante vital manchado peixes. </li></ol> 3. Anestesiar Fish and Counting fluorescente de neuromastos <ol><li&gt; Seque cada peixe em um papel toalha para remover o excesso de líquido e, em seguida, colocá-lo em um pedaço de papel de filtro umedecido que é centrada na tampa de uma placa de Petri de plástico. </li><li> Colocar a tampa sobre a plataforma de um microscópio estéreo fluorescente para obter uma imagem digital das corante neuromastos coradas vitais dos pontos do corpo médio. </li><li> Use uma câmera digital colocada no microscópio estéreo fluorescente definir uma ampliação de 2X para capturar imagens para análise quantitativa posterior. Nota: A configuração de ampliação do microscópio estéreo pode depender da marca do microscópio usado, mas a definição deve permitir uma fácil visualização e contagem de neuromastos individuais dentro de meados dos pontos do corpo. </li><li> Determinar a quantidade de regeneração através da contagem do número de neuromastos visíveis dentro dos quatro pontos designados no lado inferior mais ventral do peixe apenas proximal à barbatana peitoral direita (ver figura 1). Para a análise estatística utilizar um ensaio apropriado, tal como o ANOVAr T-teste de Student. Experimentos deve utilizar um mínimo de 5 peixes por ponto de tempo e todos os experimentos devem ser repetidos um mínimo de 3x. </li><li> Com base na curva de tempo de regeneração neuromasto (ver Figura 3), a contagem de neuromastos entre 8-16 horas pós gentamicina lava--se na fase linear da curva de regeneração. Nota: O uso da fase de tempo linear permite a análise quantitativa adequada entre os grupos controle e experimentais. </li></ol> 4. Counting fluorescentes das células ciliadas individual para obtenção de maior resolução da Análise Quantitativa Se a análise neuromasto não é estatisticamente significativa <ol><li> Se a análise quantitativa no nível de neuromastos não é significativa, a análise ao nível da célula individual do cabelo também pode ser utilizada para obter um elevado grau de resolução. Selecione peixe num determinado ponto de tempo pós gentamicina wash-out (ponto de tempo com base nos estudos anteriores neuromasto), corante vital ruaain o peixe, conforme descrito no Protocolo 2, e depois sacrificá o peixe usando 2-fenoxietanol na diluição de 1:500 por 1-5 min. </li><li> Na luz suave para evitar extinção, fazer quatro incisões para que uma preparação retalho de pele quadrado é feita da seguinte forma. Faça uma incisão ao longo das costelas superiores do peixe até que esteja alinhado com as barbatanas anais, em seguida, fazer uma incisão em toda a barriga e, finalmente, fazer duas incisões verticais de cada lado dessas incisões para que o retalho de pele quadrado é criado. Nota: Esta preparação da pele irá incorporar os pontos do corpo meados utilizados nos experimentos neuromasto. </li><li> Coloque a amostra de pele numa lâmina de vidro e, em seguida, coloque uma circular lamínula de vidro sobre a amostra de pele excisadas para ajudar a ancorar e achatar o tecido de imagem digital subseqüente. </li><li> Utilizando as amostras de pele a partir do passo 4.3, obter imagens digitais de células ciliadas em cada neuromasto dos pontos do corpo médio. Tire fotos com uma ampliação de pelo menos 60X e depois contar o ce cabelolls dentro neuromastos individuais para análise quantitativa comparativa dos grupos controle e experimental (ver Figura 4). </li></ol>

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Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de pesquisa da Iacocca Family Foundation, National Institutes of Health Grant DK092721 (para RVI) e fundos iniciais da Rosalind Franklin University. Nenhum potencial conflito de interesse relevante para este artigo foi relatado. G.C.P., S.M.M e N.D. pesquisaram dados. M.P.S. Jr. e RI supervisionaram o projeto, contribuíram para a discussão dos dados e supervisionaram a redação e edição do manuscrito.

Com base no extenso corpo de literatura que foi estabelecido para a análise da linha lateral (LL) em regeneração embrionário e larval do peixe-zebra 8,24,25, o objetivo de nosso estudo foi o desenvolvimento de um ensaio quantitativo para a regeneração da linha lateral em peixes-zebra que poderia ser aplicada aos modelos de doenças que são mais bem estudados no peixe adulto. Descobrimos que certos pontos críticos são importantes quando se aplica procedimentos desenvolvidos para peixes embrionário / larval do p...

A linha lateral sistema (LL) é um órgão mecanosensorial encontrado em ambos os peixes e anfíbios que é responsável pela audição, equilíbrio, reotaxia e comportamentos de mediação, tais como escolaridade e evitar predadores 1-5. É composta de agregados de células ciliadas rodeadas por células de suporte, os quais estão posicionados em estruturas chamadas neuromastos 6. Estes neuromastos são normalmente organizados em linhas verticais (chamados pontos) ao longo do eixo longitudinal do corpo e cauda com alguns pontos horizontais observados na cabeça do peixe. No adulto, neuromastos são significativamente maiores em número dentro dos pontos em comparação com as de peixes embrionários ou larvar 6. Estudos biomédicos no peixe-zebra têm-se centrado sobre o efeito do tratamento com antibióticos, trauma induzida por ruído, infecção crônica, etc. em células ciliadas 7,8, numa tentativa de compreender melhor os seus efeitos nos seres humanos. Diferentemente da maioria dos vertebrados, teleosts, tais como peixe-zebra (Danio rerio), têm a capacidade de regenerar células capilares perdidas. Peixe-zebra são particularmente úteis por causa do seu tempo de desenvolvimento rápido e elevada capacidade regeneradora. Até o momento, no entanto; estudos sobre o desenvolvimento de peixe zebra linha lateral e / ou regeneração têm utilizado principalmente o peixe estágio embrionário e larval, devido ao número reduzido de neuromastos linha lateral que facilita a contagem e análise 6,9,10. No entanto, como muitos modelos de peixe-zebra de doenças neurológicas e não neurológicas 11-16 são estudadas no peixes adultos e as larvas não, nós nos concentramos no desenvolvimento de um ensaio de regeneração da linha lateral no peixe-zebra adulto usando gentamicina (um aminoglicosídeo usado anteriormente em larvas do peixe e mais recentemente usado com peixe adulto 17), de modo que um ensaio estava disponível que poderia ser aplicada para adultos modelos actuais de doenças de peixes-zebra. Embora os procedimentos publicados anteriormente por Van Trump et al. 17 estabeleceu as condições para a ablação de células ciliadas no peixe adulto, eles não estabelecer uma curva padrão para a regeneração neuromasto que é necessário para comparação quantitativa entre os grupos controle e experimentais, como a utilização de linhas de zebrafish transgênicos ou estados patológicos induzidos farmacologicamente em peixes-zebra 18. Por isso, seguiu os procedimentos de Van Trump et al. 17 para ablação de células ciliadas, mas construída sobre o seu trabalho para estabelecer uma curva padrão de regeneração neuromasto para permitir aos investigadores usar os nossos dados ao comparar os grupos controle e experimentais, tais como modelos de doenças com peixe-zebra adulto . O ensaio também foi concebida para permitir a extensão da análise para a célula de cabelo individual, quando é necessário um elevado nível de resolução.

<table><tbody><tr><td>Solução de sulfato de gentamicina (50 mg/ml)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>2 Fenoxietanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1126</td><td></td></tr><tr><td>4-4-Dietilaminotriril-N-metilpiridínio iodeto (4-Di-2-Asp) em metanol</td><td>Aldrich</td><td>D-3418</td><td>485 nm excitação &lambda; e emissão de 603 nm &lambda;</td></tr><tr><td>Placas de 6 poços</td><td>Mid Sci</td><td>TP92006</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-13</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Micropoços com Fundo de Vidro</td><td>Matek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Dissecação&nbsp; Microscópio</td><td>Nikon</td><td>TMZ-1500</td><td>Qualquer microscópio de dissecação é bom.</td></tr><tr><td>Câmera para imagem</td><td>Imagem Nikon</td><td>Q</td><td>Qualquer câmera é adequada.</td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>NIH Image</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td>Qualquer software de imagem é adequado.</td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Olympus</td><td>FV10i</td><td>Qualquer microscópio fluorescente de alta resolução é adequado</td></tr><tr><td>Sistema Aquático</td><td>KG Aquatics ZFS Rack System</td><td></td><td>Qualquer sistema aquático pode ser usado</td></tr></tbody></table>

um ensaio para a lateral de regeneração de linha em zebrafish adulto

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Devido à importância clínica da audição e no equilíbrio do homem, de organismos-modelo, como o peixe-zebra foram usados ​​para estudar o desenvolvimento da linha lateral e regeneração. O peixe-zebra é particularmente atraente para tais estudos por causa de seu tempo de desenvolvimento rápido e sua alta capacidade de regeneração. Até o momento, os estudos de peixe-zebra de regeneração da linha lateral têm utilizado principalmente peixes dos estágios embrionários e larvais por causa do menor número de neuromastos nestes estágios. Isso fez com que a análise quantitativa da linha de regeneração e / ou mais fácil o desenvolvimento nas fases de desenvolvimento anteriores lateral. Porque muitos modelos de peixe-zebra de doenças neurológicas e não neurológicas são estudados os peixes adultos e não no embrião / larvas, que focada no desenvolvimento de um ensaio quantitativo linha regenerativa lateral, no peixe-zebra adultos de modo que um ensaio estava disponível que poderia ser aplicada a corrente modelos de doenças zebrafish adultos. Construir em estudos anteriores por Van Trump et al. 17, que descreve os procedimentos de ablação de células ciliadas adulto mexicano peixes cegos da caverna e peixe-zebra (Danio rerio), nosso ensaio foi concebido para permitir a comparação quantitativa entre os grupos controle e experimentais. Isto foi conseguido através do desenvolvimento de uma curva padrão neuromasto regenerativo com base na percentagem de reaparecimento neuromasto ao longo de um período de tempo de 24 horas a seguir a necrose induzida por gentamicina de células ciliadas em uma região definida da linha lateral. O ensaio também foi concebida para permitir a extensão da análise ao nível da célula individual do cabelo quando é necessário um elevado nível de resolução.

Otimização dos procedimentos para quantificar a regeneração neuromasto da linha lateral no peixe-zebra adulto. Os neuromastos de zebrafish larval são facilmente quantificáveis; no entanto, a linha lateral do peixe-zebra adulto tem um número muito maior de neuromastos por ponto fazendo análises quantitativas mais difícil 6,17,19,20. Como visto na Figura 1A, a cabeça tem um número significativamente maior de neuromastos comparação com qualquer seção...

Porque muitos modelos de peixe-zebra de doenças neurológicas e não neurológicas são estudadas no peixe adulto, em vez de o embrião / larvas, foi desenvolvido um ensaio quantitativo regenerativa linha lateral, que pode ser aplicada aos modelos de doenças de peixes-zebra adultos. O ensaio envolveu a resolução neuromasto 1) e 2) os níveis de células de cabelo individuais.

Um ensaio para a lateral de Regeneração de Linha em Zebrafish Adulto

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

O objetivo geral deste procedimento é desenvolver um ensaio quantitativo de regeneração da linha lateral que possa ser aplicado a um modelo de doença em peixe-zebra adulto. Isso é realizado primeiramente ablatando a linha lateral de peixes-zebra adultos mediante tratamento com Gentamicina por 24 horas. Em seguida, a Gentamicina é removida por lavagem e os peixes são deixados regenerar os neuromastos por diversos períodos em água fresca.Os peixes são então corados com um corante vital para visualizar a recuperação da linha lateral em pontos de tempo predeterminados. Para confirmar que a droga foi eficaz na ablação dos neuromastos, alguns peixes devem ser corados imediatamente após a lavagem do gentamicina. Em seguida, os neuromastos das linhas laterais de peixes ou preparações de pele são contados utilizando imagens obtidas com microscópio fluorescente ou confocal.Por fim, os grupos experimentais são comparados quantitativamente ao grupo controle utilizando uma curva padrão de neuromastos regenerativos. Em última análise, a microscopia fluorescente e confocal é utilizada para monitorar a regeneração da linha lateral em modelos de doenças de peixe-zebra adultos. Desenvolvemos esta té

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Após transecção espinhal, adulto zebrafish tem recuperação funcional por seis semanas após a lesão. Para tirar proveito da transparência larval e recuperação mais rápida, apresentamos um método para seccionar a medula espinhal larval. Após transecção, observamos recuperação sensorial começando em 2 dias após a lesão, e movimento C-curva por 3 dias após a lesão.

Transecção medular nos larval Zebrafish

Para lançar luz sobre os mecanismos celulares e moleculares da neurogênese e regeneração do peixe-zebra adulto, desenvolvemos um protocolo para cirurgia invasiva causando lesões mecânicas no telencéfalo adulto do peixe-zebra e subsequente monitoramento de alterações no hemisfério esfaqueado por imuno-histoquímica ou hibridização in situ.

Stab ferida ferimento do peixe-zebra adulto Telencéfalo: Um método para investigar Vertebrados Cérebro Neurogênese e Regeneração

Apresentamos um protocolo para capturar a dinâmica da regeneração da barbatana caudal de larvas de peixe-zebra em uma escala de tecido inteiro usando estereomicroscopia baseada em campo claro. Esta técnica permite capturar a dinâmica de regeneração com resolução de célula única. Esta metodologia pode ser adaptada a qualquer estereomicroscópio equipado com uma câmera CCD e software de lapso de tempo.

Captura de Reparo de Tecidos em Zebrafish larvas com a Time-lapse Brightfield lupa estereoscópica

Aqui descrevemos o fluxo de trabalho para usar o sistema TetON para alcançar a expressão gênica específica do tecido na barbatana caudal do peixe-zebra em regeneração adulta.

Uso do Sistema de Teton para estudar os mecanismos moleculares de Regeneração Zebrafish

A ablação a laser é uma tecnologia amplamente aplicável para estudar a regeneração em sistemas biológicos. O protocolo apresentado descreve o uso de um microscópio confocal padrão de varredura a laser para ablação a laser e imagens subsequentes de lapso de tempo de células interneuromast regeneradoras na linha lateral do zebrafish.

Ablação e Regeneração a laser baseada em microscópio confocal em células interneuromast baseadas em zebrafish

A regeneração muscular esquelética é impulsionada por células-tronco musculares residentes em tecidos, que são prejudicadas em muitas doenças musculares, como distrofia muscular, e isso resulta na incapacidade do músculo de se regenerar. Aqui, descrevemos um protocolo que permite o exame da regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular.

Examinando a regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular

Capaz de recuperação funcional após lesão medular, o zebrafish adulto é um sistema modelo de elucidar mecanismos inatas de regeneração neural. Aqui, descrevemos a resistência à natação e os ensaios de comportamento de natação como leituras funcionais da regeneração da medula espinhal.

Avaliação da resistência ao natação e comportamento de natação em zebrafish adulto

O presente protocolo descreve um método para induzir lesões específicas de tecido e altamente reprodutíveis em larvas de zebrafish usando um sistema de lesão a laser combinado com uma plataforma microfluida automatizada para o manuseio de larvas.

Lesões semi-automatizadas semi-automatizadas controladas por laser para estudar a regeneração da medula espinhal em larvas de zebrafish

Este protocolo descreve a coleta e visualização de escamas elasmoides de zebrafish durante a regeneração in vivo . Além disso, é apresentado o cultivo ex vivo dessas cochonilhas por até 7 dias após a colheita.

Regeneração de Escamas de Zebrafish em Toto e Cultura Ex Vivo de Escamas

Aqui nós mostramos como fazer retro-orbital injeção em peixe-zebra adulto.

Retro-orbital de injeção no Zebrafish Adulto

Aprenda um ensaio quantitativo de regeneração da linha lateral em peixe-zebra adulto usando Gentamicina e microscopia confocal. Este método permite analisar a recuperação de neuromastos e células ciliadas em modelos de doenças neurológicas.

Um ensaio para a lateral de Regeneração de Linha em Zebrafish Adulto

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