Name: Identificação de novos genes associados com alginato de Produção em Pseudomonas aeruginosa Usando Mini- Himar1 Mutagênese Mariner Transposon mediada (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-10T21:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Aprenda a identificar novos genes associados à produção de alginato em Pseudomonas aeruginosa usando mutagênese por transposon mini-himar1. Este método permite caracterizar reguladores genéticos envolvidos na formação de biofilmes.

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Este trabalho foi apoiado pelo Aeronautics and Space Administration West Virginia Space Grant Consortium Nacional (NASA WVSGC), Cystic Fibrosis Foundation (CFF-YU11G0) e NIH P20RR016477 e P20GM103434 à Rede IDeA West Virginia for Biomedical Research Excellence. Agradecemos Vonya M. Eisinger para a assistência técnica com este trabalho.

1. Preparação de Estirpes Bacterianas e biparentais Conjugação <ol><li> Inocular E. coli SM10/λpir/pFAC em 5 ml de caldo de Luria (LB) suplementado com 15 ug / ml de gentamicina e colocar num incubador com agitação durante a noite a 37 ° C. </li><li> Inocular P. aeruginosa PAO1 tensão em 5 ml de LB, e coloque em uma incubadora de agitação durante a noite a 42 ° C. </li><li> Meça OD 600 de culturas durante a noite e misture quantidades iguais de PAO1 e E. coli PFAC de tal modo que o volume final é entre 1-1,4 ml. </li><li> Centrifuga-se a mistura de 6000 g durante 5 min. </li><li> Por outro lado, secar as placas de LB para conjugação: deixar abertas as placas na incubadora a 37 ° C durante 10-15 min. </li><li> Remova todos, mas 50 ul de sobrenadante de mistura de células. </li><li> Ressuspender o sedimento de células nos restantes 50 ul de sobrenadante e pipeta para uma placa de LB seco em uma gotícula compacto. </li><li> Com cuidado, coloque a placa em um exaustor para secar (IMPONota RTANT: Não deixe que as células se espalham sobre a placa, isso vai diminuir significativamente a eficiência da conjugação). </li><li> Uma vez que a gotícula é seco, inverter a placa LB e incubar a 37 ° C durante 4-6 horas. </li><li> Enquanto a mistura de células é a incubação, preparar grandes placas PIA (150 x 15 mm OD) com 300 ug / ml de gentamicina. Antes da utilização, remover a humidade residual por colocar numa incubadora a 37 ° C durante 15-20 min. </li><li> Após a incubação da mistura de células está concluída, a colheita das células utilizando uma ansa de inoculação estéril e de um tubo de microcentrífuga contendo 1 ml de LB e vórtice, ou pipeta, para misturar completamente. </li><li> Espalhe as células uniformemente sobre as grandes placas PIA contém 300 mg / ml de gentamicina. (IMPORTANTE: Para este passo, é melhor adicionar volumes crescentes de a mistura de células para separar as placas (por exemplo, placa de 1: 10 ul, Placa 2: 50 ul, Placa 3: 100 ul, Placa 4: 500 ul, etc) . </li><li> Incubar durante a noite a 37° C. </li></ol> 2. Detecção e isolamento de colónias mucóides <ol><li> Remover placas da incubadora e examinar para colônias mucóides. </li><li> Isolar uma única colônia de muco e estrias para isolamento em pequenas placas (100 OD x 10 mm) com PIA e 300 mg / ml de gentamicina. </li><li> Incubar durante a noite a 37 ° C. </li><li> Repetir a etapa 2.2 em cultura durante a noite anterior. </li><li> Repita os passos de 2,2-2,4, mais duas vezes, para determinar a estabilidade do isolado mucóide. </li><li> Após o passo final de isolamento, o inocular 4,5 ml de LB com uma única colónia mucóide e incubar no agitador durante a noite a 37 ° C. </li><li> No dia seguinte, etiqueta 3 microtubos para cada mutante mucóide. </li><li> Prepare dois 1,25 ml alíquotas de cultura durante a noite em dois tubos para extração de DNA genômico e identificação do local de inserção do transposon (ver protocolo 3). </li><li> Adicionalmente, arquivar cada mutante mucóide pipetando 1 ml da cultura durante a noite em um DOTAÇÕEScriotubo ely-marcado contendo um volume igual de 10% de leite desnatado. Guarde-o em -86 ° C. </li></ol> 3. gDNA Restrição Digestão e ligadura <ol><li> Extrair ADNg do mutante mucóide usando qualquer método preferido (fenol-clorofórmio, a coluna de centrifugação, por exemplo., Etc.) </li><li> Determinar a concentração do ADNg, digerir com um total de 2 mg com 1 ul da endonuclease de restrição Sall, 0,5 ul de albumina de soro de bovino, 5 uL de tampão de enzima Sall (100 mM de NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM de MgCl2 , ditiotreitol 1 mM (DTT), pH 7,9 à temperatura ambiente), e o volume adequado de dH2O para obter um volume total de 50 ul. </li><li> Digerir o ADN durante a noite a 37 ° C. (IMPORTANTE:. Dependendo da eficiência do enzima de restrição, pode ser necessário adicionar um adicional de 1 ml para a digestão durante a noite e incubar a 37 ° C durante 1-2 hr Isto é em adição à digestão durante a noite.) </li><li> Purifica-se o DigeADN STED usando qualquer método preferido (por exemplo, purificação em gel de agarose, coluna de spin) e elui-se com 25 mL de tampão. </li><li> Ligar o DNA digerido, misturando 11 ul de ADN purificado com uma concentração preferida de ~ 10-20 ng / mL, 1,5 mL de ligadura Buffer (330 mM de Tris-acetato, pH 7,5, 660 mM acetato de potássio, 100 mM de acetato de magnésio, 5 mM DTT), 1,5 ul de ATP 100 mM e 1 uL de ligase de ADN. </li><li> Incubar a mistura durante 15 minutos à temperatura ambiente, e, em seguida, desactivar a enzima por incubação durante 15 min a 70 ° C. (Nota: A incubação da mistura à temperatura ambiente durante mais longa pode aumentar o sucesso da ligação). </li></ol> 4. PCR Inverso (IPCR) e Análise de Sequência <ol><li> Realizar IPCR no produto de ligação com a seguinte iniciadores directos e inversos e termociclagem condições: -Forward Primer (Gm3OUT): GGGCATACGGGAAGAAGTGA -Reverse Primer (Gm5OUT): GACTGCCCTGCTGCGTAACA Termociclador Condições: 1. 94 ° C durante 1 min. 2. 94 ° C durante 1 min. 3. 58 ° C durante 2 min. 4. 72 ° C durante 2 min. 5. 72 ° C durante 8 min. 6. 10 ° C preensão. Repita os passos 2-4 para 34 ciclos. (NOTA: Os produtos amplificados IPCR pode ser armazenado a 4 ° C.) </li><li> Realizar a electroforese em gel de agarose para confirmar a amplificação de IPCR bem sucedida. </li><li> Realizar a sequenciação do produto de IPCR utilizando os iniciadores Gm3OUT e Gm5OUT. O local de inserção e orientação de himar1 são mapeados. </li></ol>

<ol><li>Govan, J. R., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+pathogenesis+in+cystic+fibrosis%3A+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa+and+Burkholderia+cepacia%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia.</a> Microbiol. Rev. 60, 539-574 (1996).</li>
<li>Chitnis, C. E., Ohman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+the+alginate+biosynthetic+gene+cluster+of+Pseudomonas+aeruginosa+shows+evidence+of+an+operonic+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of the alginate biosynthetic gene cluster of Pseudomonas aeruginosa shows evidence of an operonic structure.</a> Mol. Microbiol. 8, 583-593 (1993).</li>
<li>Franklin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+AlgG+is+a+polymer+level+alginate+C5-mannuronan+epimerase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa AlgG is a polymer level alginate C5-mannuronan epimerase.</a> J. Bacteriol. 176, 1821-1830 (1994).</li>
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<li>Deretic, V., Gill, J. F., Chakrabarty, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+algD+coding+for+GDPmannose+dehydrogenase+is+transcriptionally+activated+in+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Gene algD coding for GDPmannose dehydrogenase is transcriptionally activated in mucoid Pseudomonas aeruginosa.</a> J. Bacteriol. 169, 351-358 (1987).</li>
<li>Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+control+of+the+algT+%28algU%29-encoded+sigma22+for+expression+of+the+alginate+regulon+in+Pseudomonas+aeruginosa+and+localization+of+its+antagonist+proteins+MucA+and+MucB+%28AlgN%29.%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN).</a> J. Bacteriol. 179, 3711-3720 (1997).</li>
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<li>Damron, F. H., Goldberg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+regulation+of+alginate+overproduction+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa.</a> Mol. Microbiol. 84 (4), 595-607 (2012).</li>
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<li>Damron, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Pseudomonas+aeruginosa+regulon+controlled+by+the+sensor+kinase+KinB+and+sigma+factor+RpoN%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Pseudomonas aeruginosa regulon controlled by the sensor kinase KinB and sigma factor RpoN.</a> J. Bacteriol. 194, 1317-1330 (2012).</li>
<li>Qiu, D., Eisinger, V. M., Rowen, D. W., Yu, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+proteolysis+controls+mucoid+conversion+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Regulated proteolysis controls mucoid conversion in Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 8107-8112 (2007).</li>
<li>Schurr, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Which+bacterial+biofilm+exopolysaccharide+is+preferred%2C+Psl+or+alginate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Which bacterial biofilm exopolysaccharide is preferred, Psl or alginate.</a> J. Bacteriol. 195, 1623-1626 (2013).</li>
<li>Wong, S. M., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+footprinting+with+mariner-based+transposition+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic footprinting with mariner-based transposition in Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10191-10196 (2000).</li>
<li>Lampe, D. J., Akerley, B. J., Rubin, E. J., Mekalanos, J. J., Robertson, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactive+transposase+mutants+of+the+Himar1+mariner+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hyperactive transposase mutants of the Himar1 mariner transposon.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 11428-11433 (1999).</li>
</ol>

O autor Hongwei D. Yu é a Ciência Officer e co-fundador da progênese Technologies, LLC Chefe.

É importante notar que este método pode ser utilizado em outras espécies de Pseudomonas com essas alterações: incubar P. e P. fluorescens putida a 30 ° C, e P. stutzeri a 42 ° C; p stuzeri devem ser cultivadas em placas de LB suplementadas com 150 ug / ml de gentamicina; no passo 1.11, P. células stutzeri deve ser transferido para 500 mL de LB em vez de 1 ml. Para além disso, existem dois passos críticos para este protocolo. Em primeiro lugar, a estirpe reci...

A capacidade do oportunista, patógeno Gram-negativa Pseudomonas aeruginosa a produzir alginato é um fator importante na sua capacidade de estabelecer um biofilme. A superprodução de alginato é um fenótipo muitas vezes referida como mucoidy. O isolamento das colônias mucóides de amostras de escarro de indivíduos que sofrem de fibrose cística (FC) é indicativo de uma infecção crônica, e está diretamente associado a um declínio geral na saúde do paciente 1. Atualmente, entende-se que a regulamentação e produção de alginato em P. aeruginosa ocorre principalmente em dois operões. O primeiro é o operon biossintética alginato, que contém 12 genes (algD - alg8 - alg44 - algK - Alge - algG - algX - algL - ALGI - algJ - algF - alga) que são responsáveis ​​pela síntese e exportação do polímero alginato através periplasma para o Environme extracelularnt 2-5. A segunda operon é um conjunto de genes que começa com o fator sigma alternativo Algu / T e continuando com Muca, mucB e mucD. Algu / T é um regulador positivo, enquanto mucAB-D são classificados como reguladores negativos da produção de alginato de 6-8. Além disso, reguladores de transcrição, tais como ALGB, AlgQ, AlgR, e RPON, bem como pós-transcricional e modificação pós-tradução pela repressão catabólica de controlo, a actividade da cinase (KinB) e proteólise intramembrane, têm também sido mostrado para ser envolvido em alginato regulação 9-14. O vetor de transposon mini-himar1 conhecido como PFAC foi originalmente criado em laboratório Dr. Mekalanos &#39;na Harvard Medical School 15. O plasmídeo PFAC consiste de um elemento transponível flanqueado por duas repetições invertidas de 27 pb e uma cassete de resistência à gentamicina no meio (aacC1: 534 pb), um gene que codifica para a hyperactive transposase marinheiro 16, e um gene que codifica a β-lactamase (bla) (Figura 1). A informação da sequência para o elemento transponível de PFAC está disponível com o número de acesso do GenBank: DQ366300 13. Em PFAC, há um local de clonagem múltipla (MCS) atrás do gene aacC1 que é utilizado para a identificação do local de inserção cromossómico utilizando PCR inversa. Uma grande vantagem com o uso do transposon mini-himar1 há fatores do hospedeiro específicas são necessárias para a transposição (mutagênese). Além disso, existe uma grande abundância de sítios de inserção dinucleotidicos TA encontrados em todo o genoma de P. aeruginosa. Por exemplo, locais de inserção dinucleotide TA ocorre 94.404 e 100.229 vezes no PAO1 (6.264.404 bps, GenBank número de acesso NC_002516.2) e PA14 (6.537.648 bps; número de acesso GenBank NC_008463) genomas, respectivamente. Devido à abundância de TA dinucleotide no genoma, mini-himar1 </em&gt; Transposão pode causar a maior densidade e mutagénese aleatória, que é particularmente adequada para a análise de genes de virulência e os genes que são altamente regulados. Teoricamente, o transposão mini-himar1 pode inserir qualquer gene não essencial no genoma de P. aeruginosa. Isto fornece cerca de 18 locais de inserção TA por quadro de leitura aberta no genoma PAO1. Aqui, nós descrevemos um protocolo usando a mutagênese mediada por transposon mini-himar1 para identificar novos reguladores de mucoidy em P. aeruginosa. Mais especificamente, o vector biparentally conjugado PFAC contendo um transposão mini-himar1 de E. coli SM10/λpir no PAO1 tensão prototrófico nonmucoid. Após o transposão está integrado no genoma, a estirpe receptora é cultivado em Pseudomonas isolamento de agar (AIP) contendo triclosan, que inibe o crescimento de E. coli. Assim, uma biblioteca de mutantes de <em&gt; P. aeruginosa podem ser seleccionados pelo crescimento na placa PIA suplementado com gentamicina e a presença do fenótipo mucóide. Note-se, um contra um mutante integração mediada por transposon verdadeiro terá um fenótipo resistente e sensível à carbenicilina gentamicina. Neste estudo, aproximadamente 80.000 mutantes de inserção de PAO1 foram isolados por meio de quatro conjugações separadas. Em seguida, rastreados para isolados mucóides, e determinado o local de inserção por digestão com enzimas de restrição, ligação e PCR inversa. Foram realizadas análises de Southern blot utilizando a cassete de resistência a gentamicina como uma sonda para ver o número de inserção por genoma. Determinou-se que mais de 90% de mutantes obtidos por conjugação utilizando este protocolo tinha uma única cópia do himar1 no genoma e exibido o fenótipo de resistência à carbenicilina e sensíveis à gentamicina. Foi identificado um total de 32 isolados mucóides, 22 deles foram mapeados para diferentes loci da P. aeruginosa PAO1cromossomo. Esta taxa de inserção fornece uma cobertura adequada para identificar vários novos reguladores de superprodução alginato.

<table><tbody><tr><td>Caldo Luria</td><td>Difco</td><td>240230</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Pseudomonas ágar isolamento</td><td>Difco</td><td>292710</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Pratos Pequenos (100 O.D. x 10 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-13</td><td></td></tr><tr><td>Pratos Grandes (150 O.D. x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-14</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de agitação de bancada</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 4080</td><td>agitar a 200 rpm</td></tr><tr><td>Incubadora de armário</td><td>VWR</td><td>1540</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga de bancada</td><td>Sorvall</td><td>75-003-287</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>SmartSpec Plus Espectrofotômetro</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>ou método/fornecedor preferido</td></tr><tr><td>Loops de inoculação diposable</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-597</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Frascos criogênicos de 2,0 ml</td><td>Corning</td><td>430659</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Tubos de 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>Leite desnatado</td><td>Difco DF0032-17-3</td><td></td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>DNeasy Sangue e Tecido (250)&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>ou método/fornecedor preferido</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>ou método/fornecedor preferido</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>ou método preferido/fornecedor</td></tr><tr><td>Kit de ligação de DNA FastLink II</td><td>Epicentre Technologies</td><td>LK6201H</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Accu block Digital Dry Bath&nbsp;</td><td>Labnet</td><td>NC0205808</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Sal1, endonuclease de restrição</td><td>New England BioLabs</td><td>R0138L</td><td></td></tr><tr><td>EasyStart Micro 50</td><td>Molecular BioProducts</td><td>6020</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Taq DNA Polimerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0267L</td><td></td></tr><tr><td>iCycler, Termociclador</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8740</td><td></td></tr><tr><td>LE agarose</td><td>Genemate</td><td>3120-500</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Gentamycin Sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP918-1</td><td></td></tr><tr><td>Frascos criogênicos de 2,0 ml</td><td>Corning</td><td>430659</td><td>via Fisher Scientific</td></tr></tbody></table>

identificação de novos genes associados com alginato de produção em<em&gt; pseudomonas aeruginosa</em&gt; usando mini-<em&gt; himar1</em&gt; mutagênese mariner transposon mediada

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria Gram-negativa, do meio ambiente com as capacidades metabólicas versáteis. P aeruginosa é uma bactéria patogênica oportunista que estabelece infecções pulmonares crônicas em pacientes com fibrose cística (FC). O excesso de produção de um polissacarídeo capsular chamado alginato, também conhecido como mucoidy, promove a formação de biofilmes mucóides que são mais resistentes que as células planctônicas a quimioterapia antibiótico e as defesas do hospedeiro. Além disso, a conversão do nonmucoid para fenótipo mucóide é um marcador clínico para o início da infecção crónica em CF. Superprodução alginato por P. aeruginosa é um processo endergonic que tributa pesadamente energia celular. Portanto, a produção de alginato é altamente regulado em P. aeruginosa. Para compreender melhor regulação alginato, nós descrevemos um protocolo utilizando a mutagénese de transposões mini-himar1 para a identificação de novos regulador alginatos em um PAO1 cepa protótipo. O processo consiste em duas etapas principais. Em primeiro lugar, nós transferimos o transposon mini-himar1 (PFAC) do host E. coli SM10/λpir em destinatário P. aeruginosa PAO1 por conjugação entre parentes para criar uma biblioteca de mutantes de inserção de alta densidade, que foram seleccionados em placas de agar de isolamento Pseudomonas suplementado com gentamicina. Em segundo lugar, nós analisamos e isoladas as colónias mucóides para mapear o local de inserção por meio de PCR inversa utilizando iniciadores de ADN que apontam para fora a partir da cassete de gentamicina e sequenciação de ADN. Usando este protocolo, foram identificados dois reguladores novas alginato, Muce (PA4033) e kinB (PA5484), em PAO1 tensão com um tipo selvagem Muca que codifica o fator anti-sigma MUCA para o alginato regulador mestre Algu (ALGT, σ 22) . Este protocolo de mutagénese de alto rendimento podem ser modificados para a identificação de outros genes de virulência causando alterações no colomorfologia ny.

Tal como ilustrado na Figura 1, o vector de mariner transposão mini-himar1, PFAC, contém duas repetições invertidas com 27 pb que flanqueia os locais de inserção de TA a cassete de resistência à gentamicina aacC1, com o seu promotor σ 70-dependente, e um local de clonagem múltipla (MCS). Além disso, o vector contém os genes que codificam PFAC transposase altamente activa himar1, β-lactamase (bla), e o operão transferência tra. Os locais de inserção...

Aqui nós descrevemos um protocolo com o marinheiro mutagênese mini-himar1 mediada por transposon para gerar uma biblioteca de mutantes de inserção de alta densidade para a tela, isolar e identificar novos reguladores de alginato no protótipo PAO1 cepa Pseudomonas aeruginosa.

Identificação de novos genes associados com alginato de Produção em<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Usando Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mutagênese Mariner Transposon mediada

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

O objetivo geral deste procedimento é identificar novos genes associados à produção do exopolissacarídeo alginato em Pseudomonas aeruginosa utilizando mutagênese mediada por transposon mini-Himar1. Isso é realizado primeiramente cultivando dois cultivos separados, incubados durante a noite, da linhagem doadora, Escherichia coli Lambda pir carregando o plasmídeo pAC, e das células receptoras, Pseudomonas aeruginosa, PAO1. Em seguida, o plasmídeo pAC é conjugado por cocultivo de E. coli Lambda pir com Pseudomonas aeruginosa.PAO1 e conjugados trans são selecionados em ágar de isolamento de pseudomonas, então colônias com morfologia são identificadas e isoladas em placas de PIA. Por fim, a localização e orientação do transposon mini-he-mar1 no sítio de inserção são identificadas no genoma de Pseudomonas aeruginosa PAO1. Em última análise, o uso da mutagênese mediada por transposon mini-he-R1 identifica e caracteriza os genes associados à produção de alginato em Pseudomonas aeruginosa.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de microbiologia e genética bacteriana, como a identificação de locos genéticos envolvidos na regulação de diferentes funções celulares, demonstrando o procedimento que será realizado com o sistema. Um estudante de pós-graduação do meu laboratório, o mini he R one Mariner transposon no vetor P fac contém repetições invertidas de 227 pares de bases com sítios de inserção TA que flanqueiam o cassete de resistência à Gentamicina A CC um, com seu promotor dependente de Sigma 70 localizado a montante de um sítio de clonagem múltipla. O vetor PFAC também contém genes que codificam a transposase he R one altamente ativa, a beta-lactamase e a operação de transferência TRA.Os sítios de inserção TA permitem uma integração eficiente no genoma de cepas de pseudomonas aerogen. A precisão na identificação e seleção de mutantes OID é essencial para o sucesso geral na determinação dos locos gênicos envolvidos na regulação da alginato. Para preparar as cepas bacterianas, comece inoculando e coli SM 10 Lambda peer P fac em cinco mililitros de lb, suplementado com 15 microgramas por mililitro de Gentamicina e coloque em um incubador com agitação durante a noite a 37 graus Celsius no mesmo dia.Inocule a linhagem posa PO em cinco mililitros de LB e coloque em incubadora com agitação durante a noite a 42 graus Celsius no dia seguinte. Meça a DO 600 das culturas noturnas e misture quantidades iguais de PAO 1 e E. coli P fac, de modo que o volume final fique entre um mililitro e 1,4 mililitro. Centrifugue a mistura a 6.000 × g durante cinco minutos.Enquanto isso, seque as placas de LB para conjugação deixando-as abertas em uma incubadora a 37 graus Celsius por 10 a 15 minutos. Remova todo o sobrenatante da mistura celular, exceto 50 microlitros. Em seguida, ressuspenda.Suspenda o pellet celular nos 50 microlitros restantes do sobrenadante e pipete sobre uma placa LB seca. Em uma gota compacta, coloque cuidadosamente a placa em uma cabine de segurança para secar. Não permita que as células se espalhem pela placa.Isso diminuirá significativamente a eficiência da conjugação. Uma vez que a gota estiver seca, inverta a placa de LB e incube a 37 graus Celsius por quatro a seis horas, enquanto a mistura celular estiver incubando. Prepare placas grandes de ágar isolamento de pseudomonas ou PIA com 300 microgramas por mililitro de gentamicina.Após a incubação, use um alça de inoculação estéril para coletar esta única gota de células em um tubo de microcentrífuga contendo um mililitro de lb, vortex ou pipete para misturar completamente antes de espalhar as células uniformemente nas grandes placas PIA. Incube as placas durante a noite a 37 graus Celsius. Retire as placas do incubador e examine as colônias OID.Isole uma colônia única de moid e faça um esgotamento para isolamento em placas pequenas com PIA e 300 microgramas por mililitro de gentamicina. No dia seguinte, isole uma única colônia de moid e repita o esgotamento. Repita o isolamento de colônia única mais duas vezes para determinar a estabilidade do isolado moid após o isolamento inicial.Passo: inocular 4,5 mililitros de LB com uma única colônia OID e incubar em agitador durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, rotular três tubos de microcentrífuga para cada mutante OID. Preparar duas alíquotas de 1,25 mililitro da cultura de overnight para extração de DNA genômico e identificação do sítio de inserção do transposon.Além disso, arquive cada mutante OID pipetando um mililitro de cultura de crescimento noturno em um tubo criogênico devidamente rotulado contendo volume igual de leite desnatado a 10%. Armazene a menos 86 graus Celsius. Após extrair o DNA genômico do mutante MOID.Usando qualquer método preferido e determinando sua concentração, digira um total de dois microgramas com um microlitro da endonuclease de restrição S um em um volume total de 50 microlitros durante a noite a 37 graus Celsius. Após a purificação do DNA digerido usando qualquer método preferido em um volume total de 25 microlitros, prepare uma reação de ligação usando cerca de 11 microlitros de DNA e incube a mistura por pelo menos 15 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, inative-a a 70 graus Celsius por 15 minutos, realize a PCR inversa no produto da ligação usando os seguintes primers direto e reverso e condições de termociclagem.Em seguida, verifique a amplificação em um gel AROS antes de finalmente utilizar os iniciadores GM três out e GM cinco out para sequenciar a reação. Exemplos de isolados MOID e não MOID são mostrados nesta figura. Com base no protocolo demonstrado neste vídeo, cada conjugação deve produzir um banco de cerca de 20.000 mutantes em 15 a 20 placas grandes devido à superprodução de alginato.A colônia deve ser clara ou branca na cor e ter aparência cremosa ou viscosa. Se a mutagênese e a amplificação do DNA forem bem-sucedidas, deve haver um único amplicon no tamanho apropriado, conforme ilustrado nesta figura. Há ausência do amplicon de IPCR em PAO um.No entanto, detectamos um único amplicão de aproximadamente 1.400 pares de bases e cerca de 1000 pares de bases em PA, O um VE dois e PA O um VE 13, respectivamente. O tamanho desses amplicões corresponde à inserção do transposon mariner HER um na região promotora de PA 4 0 3 3 em PA oh um VE dois e internamente em PA 5 4 84 em PA oh um VE 13 PA oh um DNA genômico. O DNA que passou por restrição, digestão e ligação pode ser usado como controle negativo.Assim, uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em três ou quatro dias, se for executada corretamente. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de incubação das cepas bacterianas na temperatura apropriada antes da conjugação bioparental.

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Research

JoVE Journal

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Identificação de novos genes associados com alginato de Produção em Pseudomonas aeruginosa Usando Mini- Himar1 Mutagênese Mariner Transposon mediada (Vídeo) | JoVE Journal

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