Name: Captura de glicopeptídeos de Superfície Celular Proteômica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-09T20:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Aprenda a captura de glicopeptídeos de superfície celular para proteômica usando digestão enzimática e resina. Este método enriquece proteínas de membrana de baixa abundância para análise por LC-MS.

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Esta pesquisa foi financiada pelo fundo de arranque de Simon Fraser University.

1. Colheita Membranas <ol><li> Adicionar tampão hipotónico (10 mM Tris-HCl, 10 mM de KCl, 1,5 mM MgCl 2, pH 8,0) com o cocktail inibidor de protease para um agregado de células (~ 10 8 células) e incuba-se durante 15-30 minutos em gelo. Lyse as células por fazer passar a amostra através de agulhas de seringas (5-10 passagens) ou homogeneizar a amostra por um homogeneizador Dounce (15-30 AVC). Use um hemocitômetro e coloração azul de tripan para verificar a eficiência da lise. </li><li> Obter a fracção microssomal por uma centrifugação diferencial do ligado em 3000 gx 15 min e em seguida a 100.000 gx 2 hr. A primeira centrifugação obtém uma pelete que é a fracção nuclear, e a subsequente centrifugação do sobrenadante gera um segundo sedimento, que é a fracção microssomal que contém a membrana plasmática, bem como organelos ligados à membrana 8. O sobrenadante final é a fracção citosólica. Guarde as frações microssomais em freezer -80 ° C para mais analysé como se indica a seguir. </li></ol> 2. Dissolve, desnaturação e Digest Proteínas da Membrana <ol><li> Dissolve-se a fracção microssomal no tampão de desnaturação (Tris 40 mM, EDTA 10 mM, 10 mM de TCEP, 0,5% Rapigest, pH 8) e depois incubar a solução a 100 ° C durante 10 min. </li><li> Arrefece-se a solução aquecida até à temperatura ambiente, adicionar ultra-alta pureza ureia em pó a uma solução de 8 M de concentração final e incubar a amostra a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Adicionar solução de estoque de iodoacetamida à amostra de 15 mM de concentração final, e incubar a solução no escuro durante 30 min à temperatura ambiente para alquilar os tióis livres na amostra. Adicionar solução de estoque de DTT para a amostra a uma concentração final de 10 mM e incuba-se a solução durante mais 10 min à temperatura ambiente para extinguir o excesso de iodoacetamida. </li><li> Dilui-se a solução obtida com 10x tampão de Tris 40 mM a pH 8, e, subsequentemente, adicionar tripsina à amostra a uma razão de 01:20 trypsin para a proteína total. Manter a reacção de digestão durante a noite num forno de 37 ° C para assegurar o fim da reacção. </li><li> Terminar a digestão por acidificação da solução de amostra para pH 1 com HCl, uma condição que também divide o detergente, ou seja Rapigest. Degradar o Rapigest a 37 ° C durante 1 hora, e remover a precipitação desenvolvido por centrifugação. </li><li> Limpar o sobrenadante que contém péptidos de amostra por um cartucho C-18 de extracção em fase sólida (SPE) e secar a amostra obtida por speedvac. </li><li> Realizar uma análise de SDS-PAGE de amostras antes e depois de digestão com tripsina para confirmar a eficiência da digestão. </li></ol> 3. Captura glicopéptido <ol><li> Dissolve-se os péptidos limpas no tampão (acetato de sódio 100 mM, pH 5,5) de acoplamento. Adicionar periodato de sódio na solução de péptido com uma concentração final de 10 mM durante 30 min no escuro, à temperatura ambiente. Isto irá oxidar os grupos cis-diol em glicanos de aldeídos, Que permitem que os glicanos a par com a resina através de química hidrazida. Extingue-se o excesso de periodato de sulfito de sódio a uma concentração final de 20 mM e pH 5 durante 10 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Introduzir resina derivatizada com hidrazida para a solução de péptido com uma razão de 1:4 (resina de solução) para acoplar glicopéptidos à resina. Incubar a reacção a 37 ° C durante 1-2 dias com a rotação de ponta a ponta para o acoplamento completo. </li><li> Remover os péptidos não ligados por lavagem da resina duas vezes com 1 ml de cada um dos seguintes: água DI, 1,5 M de NaCl, 80% de metanol e acetonitrilo. Finalmente, lava-se a resina 3x com 1 ml de NH 4 HCO 3 a 100 mM, pH 8 para trocar o tampão do sistema de NH 4 HCO 3 a 100 mM. <ol><li> Recolhe-se o sobrenadante e as lavagens para a análise de péptidos não ligados (opcional). </li></ol></li><li> Soltar os N-glicopéptidos a partir da resina por PNGase F numa incubação durante a noite a 37 ° C com umn fim-de-final da rotação. Recolha os peptídeos liberados por centrifugação e lavagem acetonitrila 80%. Seca-se a solução obtida no Speedvac para análise por LC-MS. </li></ol> 4. Fraccionamento adicional (opcional) Para simplificar ainda mais a complexidade da amostra, fracionar as N-glicopeptídeos obtidos. Por exemplo, dissolver-se os péptidos secos em 10 mM de formato de amónia, pH = 3 com 20% de acetonitrilo e utilizar de permuta catiónica forte (SCX) de cromatografia para fraccionar os péptidos. Seca-se o eluente obtido, e, em seguida, analisar as fracções de péptido obtidas por inversão de fases LC-MS 8,17,18. 5. Limpeza de N-glicopeptídeos Lançado (Opcional) Se levantar preocupações para o potencial de contaminação dos péptidos, redissolver os péptidos secos em ácido fórmico a 0,1% e usar uma coluna SPE MCX para limpar ainda mais os péptidos antes de fase reversa A análise por LC-MS. <strong&gt; Nota: Os parâmetros de busca de banco de dados. Durante a clivagem selectiva de N-glicopéptidos fora da resina, PNGase F converte a asparagina ligada de N-glicanos de um ácido aspártico. Portanto, existe um deslocamento de massa de 0,9840 Da dos libertadas N-glicopéptidos. Para identificar com precisão estes péptidos, esta modificação pode ser adicionada para os parâmetros de pesquisa juntamente com modificações comuns, tais como o carbamidomethylation de cisteína e à oxidação do que a metionina.

<ol><li>Cho, W., Stahelin, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-protein+interactions+in+cell+signaling+and+membrane+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biophysics+and+biomolecular+structure%22%5BJournal%5D)">Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking.</a> Annual review of biophysics and biomolecular structure. 34, 119-151 (2005).</li>
<li>Tadevosyan, A., Vaniotis, G., Allen, B. G., Hebert, T. E., Nattel, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((protein-coupled+receptor+signalling+in+the+cardiac+nuclear+membrane%3A+evidence+and+possible+roles+in+physiological+and+pathophysiological+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">protein-coupled receptor signalling in the cardiac nuclear membrane: evidence and possible roles in physiological and pathophysiological function.</a> The Journal of physiology. 590, 1313-1330 (2012).</li>
<li>White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+dissection+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biophysical dissection of membrane proteins.</a> Nature. 459, 344-346 (2009).</li>
<li>Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-protein+topology.+%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Membrane-protein topology. </a> Nature reviews Molecular cell biology. 7, 909-918 (2006).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+high-resolution+proteomics+for+data-driven+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology.</a> Annual review of biochemistry. 80, 273-299 (2011).</li>
<li>Lamond, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+cell+biology+through+proteomics+in+space+and+time+%28PROSPECTS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Advancing cell biology through proteomics in space and time (PROSPECTS).</a> Mol Cell Proteomics. 11, (2012).</li>
<li>Savas, J. N., Stein, B. D., Wu, C. C., Yates 3rd, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+accelerates+membrane+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+biochemical+sciences%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry accelerates membrane protein analysis.</a> Trends in biochemical sciences. 36, 388-396 (2011).</li>
<li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+glycopeptide+capture+approach+coupled+with+mass+spectrometry+for+comprehensive+glycoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Shotgun glycopeptide capture approach coupled with mass spectrometry for comprehensive glycoproteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 141-149 (2007).</li>
<li>Lowe, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation%2C+immunity%2C+and+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Glycosylation, immunity, and autoimmunity.</a> Cell. 104, 809-812 (2001).</li>
<li>Dodds, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas-phase+dissociation+of+glycosylated+peptide+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+spectrometry+reviews%22%5BJournal%5D)">Gas-phase dissociation of glycosylated peptide ions.</a> Mass spectrometry reviews. 31, 666-682 (2012).</li>
<li>Kaji, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lectin+affinity+capture%2C+isotope-coded+tagging+and+mass+spectrometry+to+identify+N-linked+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Lectin affinity capture, isotope-coded tagging and mass spectrometry to identify N-linked glycoproteins.</a> Nat Biotechnol. 21, 667-672 (2003).</li>
<li>Zhang, H., Li, X. J., Martin, D. B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+quantification+of+N-linked+glycoproteins+using+hydrazide+chemistry%2C+stable+isotope+labeling+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry.</a> Nat Biotechnol. 21, 660-666 (2003).</li>
<li>Hagglund, P., Bunkenborg, J., Elortza, F., Jensen, O. N., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strategy+for+identification+of+N-glycosylated+proteins+and+unambiguous+assignment+of+their+glycosylation+sites+using+HILIC+enrichment+and+partial+deglycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">A new strategy for identification of N-glycosylated proteins and unambiguous assignment of their glycosylation sites using HILIC enrichment and partial deglycosylation.</a> J Proteome Res. 3, 556-566 (2004).</li>
<li>Bond, M. R., Kohler, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+methods+for+glycoprotein+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Chemical methods for glycoprotein discovery.</a> Current opinion in chemical biology. 11, 52-58 (2007).</li>
<li>Pasini, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+analysis+of+the+membrane+and+cytosolic+proteome+of+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In-depth analysis of the membrane and cytosolic proteome of red blood cells.</a> Blood. 108, 791-801 (2006).</li>
<li>Wollscheid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometric+identification+and+relative+quantification+of+N-linked+cell+surface+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins.</a> Nat Biotechnol. 27, 378-386 (2009).</li>
<li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Glycoproteome+of+E14.Tg2a+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">N-Glycoproteome of E14.Tg2a mouse embryonic stem cells.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li>
<li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycocapture-assisted+global+quantitative+proteomics+%28gagQP%29+reveals+multiorgan+responses+in+serum+toxicoproteome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Glycocapture-assisted global quantitative proteomics (gagQP) reveals multiorgan responses in serum toxicoproteome.</a> J Proteome Res. 12, 2034-2044 (2013).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Aqui apresentamos uma estratégia de captura de glycopeptide para perfilar as proteínas da superfície celular. O método pode ser aplicado para estudar as proteínas segregadas, tal como aqueles em sangue, assim como em outros fluidos corporais, ou em meios de cultura de células. O sucesso do método que se baseia na digestão completa de amostras; por conseguinte, uma caracterização de SDS-PAGE da eficiência da digestão é necessário, especialmente para a análise pela primeira vez de uma amostra....

Proteínas da superfície da célula interagir com o ambiente extracelular e transmitir sinais a partir do exterior para o interior de uma célula. Assim, estas proteínas, incluindo proteínas de matriz extracelular, desempenham papéis críticos em todos os aspectos da biologia celular e fisiologia variando de proliferação, o crescimento, a migração, a diferenciação de envelhecimento e assim por diante. Proteínas de superfície de funcionar interagindo com outras células, proteínas e pequenas moléculas 1-3. Caracterização molecular de proteínas da superfície celular, é de grande interesse, não só para os biólogos, mas também para as empresas farmacêuticas, mais do que 60% ​​da droga são dirigidos a proteínas da superfície da célula 4. Espectrometria de massa em tandem (MS), com a sua sensibilidade superior, precisão e rendimento para a identificação de proteínas e peptídeos, tem sido uma ferramenta poderosa para estudos de proteômica globais 5,6. No entanto, as proteínas de superfície representam desafios significativos para proteômica baseada em MS, comoa maioria das proteínas de superfície existe em baixas quantidades, e com modificações pesados. As regiões que atravessam a membrana das proteínas de superfície de torná-los hidrófobos; este é especialmente o caso de proteínas transmembrana multipass. É, portanto, difícil de dissolver as proteínas de membrana em soluções aquosas, sem a ajuda de um detergente; no entanto, o uso de detergentes geralmente suprime o desempenho de HPLC e MS 1,7,8 na identificação de proteínas. Portanto, as proteínas da membrana foram mal caracterizado em proteômica baseada LC-MS diretos. A glicosilação é uma das modificações pós-tradução mais importantes e abundantes que ocorrem em proteínas da superfície das células 9. A enorme complexidade e heterogeneidade dos glicanos dificultar sinal de 10 MS &#39;peptídeos. No entanto, vários métodos proteomic usaram esta modificação única para enriquecer as proteínas de superfície e para remover as porções de açúcar a partir de proteínas antes da análise por LC-MS. Estes métodos incluem baseada em lectina de captura por afinidade e 11 à base de ácido de captura 12 ou químico bórico à base de hidrazida, bem como separações cromatográficas hidrofílicos 8,13. A remoção dos glicanos transforma as proteínas da membrana de proteínas e regulares drasticamente simplifica a caracterização MS. Porque glicosilação também ocorre em proteínas secretadas que têm alta solubilidade em contraste com a membrana proteínas, muitos métodos glycoproteomic são otimizados para proteínas solúveis, e tendem a ter menor seletividade glycopeptide e sensibilidade ao ser implantado para a membrana proteínas 8,14. Outros métodos também existe para o enriquecimento, em particular, as proteínas da superfície celular, tais como aqueles utilizando ultracentrifugação 15 e estratégias de rotulagem 16. Uma comparação detalhada entre o nosso método e outros métodos existentes para a caracterização de proteínas de membrana foi realizada recentemente 17, e os resultados indicaram que o método pode executar igualmente bem, se nãomelhor, do que todos os métodos de comparação proteómica membrana, mas com maior simplicidade. Para ajudar os pesquisadores a utilizar este método, detalhamos aqui um protocolo geral. Este método integra várias vantagens de estratégias glycoproteomics existentes e é concebido especificamente para glicoproteínas de membrana, no entanto, o método funciona igualmente bem para as proteínas secretadas. As características deste método incluem: 1) uma solubilização completa de proteínas de membrana, 2) um enriquecimento de glicopéptidos em vez de glicoproteínas para eliminar o potencial impedimento espacial quando se utiliza um substrato de captura de sólidos, 3) a utilização da química de hidrazida para formar ligações covalentes entre glicopéptidos e o substrato de captura, de modo a que os glicopéptidos ligados tolera lavagens rigorosas para alta glycoselectivity, e 4) a capacidade de realizar o processo de captura de todo em um tubo para a perda de amostra reduzida ea duração do procedimento encurtado. Depois de implementar este método para estudar uma variáveledade de amostras biológicas, incluindo células e tecidos, observou-se uma selectividade elevada (&gt; 90%) às glicoproteínas 8,17,18.

<table><tbody><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamida</td><td>Sigma</td><td>A3221</td><td></td></tr><tr><td>Rapigest SF</td><td>Waters</td><td>186001860</td><td></td></tr><tr><td>Periodato de sódio</td><td>Sigma</td><td>311448</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F</td><td>New England Biolabs</td><td>P0704S</td><td></td></tr><tr><td>Affi-Gel Hz gel hidrazida</td><td>Bio-Rad</td><td>153-6047</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Worthington Biomedical</td><td>LS02115</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak Cartucho C-18</td><td>Waters</td><td>WAT054955</td><td></td></tr><tr><td>Oasis MCX Waters</td><td></td><td>186000252</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de protease coctail</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Ureia</td><td>Amersco</td><td>568</td><td></td></tr><tr><td>Sulfito de sódio</td><td>Caledon</td><td>8360-1</td><td></td></tr><tr><td>Invertase</td><td>Sigma</td><td>I0408</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-1 tripsina</td><td>Sigma</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Ribonulease B</td><td>Sigma</td><td>R7884</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>Sigma</td><td>A9275</td><td></td></tr><tr><td>Ovalbumina</td><td>Sigma</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>Conalbumina</td><td>Sigma</td><td>C0755</td><td></td></tr></tbody></table>

captura de glicopeptídeos de superfície celular proteômica

Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics

Proteínas de superfície celular, incluindo as proteínas da matriz extracelular, participam em todos os principais processos e funções celulares, tais como o crescimento, a diferenciação e proliferação. A caracterização detalhada destas proteínas fornece informações ricas para a descoberta de biomarcadores, a identificação do tipo de célula, e seleção-alvo da droga, bem como ajudando a avançar a nossa compreensão da biologia celular e fisiologia. Proteínas de superfície, no entanto, colocam desafios analíticos significativos, devido à sua inerente baixa abundância, alta hidrofobicidade, e pesadas modificações pós-traducionais. Aproveitando a glicosilação em proteínas de superfície predominante, apresentamos aqui uma abordagem de captura de glicopéptido de alto rendimento, que integra as vantagens de vários meios N-glycoproteomics existentes. Nosso método pode enriquecer os glicopeptídeos derivados de proteínas de superfície e remover seus glicanos para proteômica fáceis utilizando LC-MS. A N-glycoproteome resolvido compreende a informação de identidade e quantidade de proteína, bem como os seus locais de glicosilação. Este método foi aplicado a uma série de estudos em diversas áreas, incluindo o cancro, as células estaminais, e a toxicidade da droga. A limitação do método reside na fraca abundância de proteínas de membrana de superfície, de tal modo que uma quantidade relativamente grande de amostras é necessária para esta análise em comparação com estudos centrados em proteínas citosólicas.

Uma carta do procedimento experimental fluxo representativo é resumido na Figura 1. A rotulagem e as novas medidas de fracionamento são opcionais e os detalhes estão descritos em uma publicação recente 18. Uma outra opção é para analisar os péptidos não modificados, que não reagem com a resina. As vantagens da análise dos péptidos não modificados incluem a identificação potencial de peptídeos e proteínas não glicosiladas, tais como claudinas nas junções apertadas; uma vantagem adicional é a q...

As proteínas de superfície são biologicamente importantes e amplamente glicosilada. Apresentamos aqui uma abordagem de captura de glycopeptide para solubilizar, enriquecer e deglycosylate estas proteínas para análise proteômica baseada LC-MS fáceis.

Captura de glicopeptídeos de Superfície Celular Proteômica

Cell surface proteins, including extracellular matrix proteins, participate in all major cellular processes and functions, such as growth, ...

O objetivo geral deste procedimento é enriquecer proteínas de membrana de superfície celular de baixa abundância. Isso é realizado primeiramente desnaturando e digerindo as proteínas de membrana. O segundo passo é oxidar os glicanos e capturar os peptídeos glicosilados em uma superfície de resina.Os glicopeptídeos não ligados são então lavados fora da resina. O passo final é a liberação dos glicopeptídeos N-ligados da resina para análise por LC-MS. Em última instância, a sequência do peptídeo identificado pode ser mapeada de volta às proteínas para fins de identificação e quantificação.Hoje vou demonstrar como funciona o método de captura de peptídeos Geico. A principal vantagem desta técnica em relação às existentes, como a captura de glicoproteínas, é que a proteína de membrana será primeiro digerida e a captura do glicopeptídeo pode ser realizada em um único recipiente. A aplicação desta técnica pode estender-se à descoberta de biomarcadores de doenças.Como a proteína gator pode ser liberada no sangue e em outros fluidos corporais, e a glicoproteína circulante no sangue, específica para o processo patológico, pode ser utilizada como biomarcador de prognóstico e diagnóstico. Prim

glycopeptide-capture-for-cell-surface-proteomics

Research

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Biologia

Contas lectina-conjugada POROS foram empregadas para HPLC. Padrões glicopeptídeo serviram como controle positivo e negativo. MARS-14 empobrecido, tripsina-digerida plasma humano foi cromatografada e flow-through (FT) e frações ligado coletadas para análises ESI-LC-MS/MS. Glicopeptídeos foram enriquecidos na fração ligada quando comparado com FT.

Um método HPLC Lectin enriquecer Peptídeos seletivamente glicosilada de Complexo Amostras Biológicas

O onipresente segundo mensageiro c-di-GMP controla o crescimento e o comportamento de muitas bactérias. Desenvolvemos uma nova tecnologia baseada em espectrometria de massa composta de captura para identificar e caracterizar bioquimicamente as proteínas de ligação c-di-GMP em praticamente qualquer espécie bacteriana.

Captura de Espectrometria de Massa Compound - uma ferramenta poderosa para identificar novos c-di-GMP efetoras Proteínas

Um protocolo de alto rendimento foi desenvolvido para purificação combinada de proteômica e glicômica e quantificação de LC-MS/MS no plasma. A análise de desamidação de motivos de glicosilação ligados a N foi específica para locais desglicosilados. A quantificação precisa de N-glicanos foi alcançada acoplando a separação de N-glicanos auxiliada por filtro à normalização da individualidade ao marcar com a estratégia de marcadores de hidrazida de glicano.

A Quantitative Glycomics e Proteomics Combinada estratégia de purificação

Aqui descrevemos protocolos para romper as células de mamíferos por moagem em estado sólido a uma temperatura criogénica, produzem um extracto celular a partir do pó de células resultante, e isolar complexos proteína de interesse por captura de afinidade sobre esferas paramagnéticas escala mícron acoplado com anticorpo.

Proteína de captura por afinidade complexos a partir de células de mamíferos Cryomilled

Este artigo descreve um método para preparar as amostras de tecido para análise MS cardiovasculares que permite (1) a análise da composição de proteínas de ECM, (2) a identificação de locais de glicosilação, e (3) a caracterização da composição de formas de glicano. Esta metodologia pode ser aplicada, com pequenas modificações, para o estudo da ECM em outros tecidos.

Glicoproteômica da matriz extracelular: um método de análise GLICOPï¿½TIDOS Intact Usando Espectrometria de Massa

Apresentamos um método para a purificação, detecção e identificação de peptídeos diGly que se originam de proteínas ubiquitinadas de amostras biológicas complexas. O método apresentado é reprodutível, robusto e supera os métodos publicados em relação ao nível de profundidade da análise ubiquitinome.

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Modificações pós-translacionais (PTMs) alteram estruturas e funções proteicas. Métodos para o enriquecimento simultâneo de vários tipos de PTM podem maximizar a cobertura nas análises. Apresentamos um protocolo utilizando cromatografia de afinidade metálica ti(IV) automobilizada duplamente, seguida de espectrometria de massa para o enriquecimento simultâneo e análise da proteína N-glicosilação e fosforilação em tecidos pancreáticos.

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Um protocolo é apresentado para a determinação de biomarcadores de baixa abundância a partir de amostras secas de soro exemplificadas com o biomarcador progastrina-releasing peptide (ProGRP). Esferas magnéticas revestidas com anticorpos são usadas para a limpeza seletiva e enriquecimento de um peptídeo proteotípico ProGRP. O peptídeo capturado é posteriormente analisado por cromatografia líquida-espectrometria de massas em tandem.

Microamostragem em Análise de Proteínas de Baixa Abundância Baseada em Espectrometria de Massa

Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho proteômico para caracterização do proteoma da superfície celular de vários tipos de células. Esse fluxo de trabalho inclui enriquecimento de proteínas de superfície celular, preparação subsequente de amostras, análise usando uma plataforma LC-MS/MS e processamento de dados com software especializado.

Fluxo de trabalho de "captura de superfície celular" para quantificação sem rótulo do proteoma da superfície celular

Este protocolo detalha o método glicoproteômico guiado por glicômica, uma tecnologia ômica integrada que oferece informações abrangentes sobre o glicoproteoma heterogêneo em microambientes tumorais complexos necessários para entender melhor a glicobiologia dos cânceres.

A glicoproteômica guiada por glicômicos facilita o perfil abrangente do glicoproteoma em microambientes tumorais complexos 

Aprenda a captura de glicopeptídeos de superfície celular para proteômica usando digestão enzimática e resina. Este método enriquece proteínas de membrana de baixa abundância para análise por LC-MS.

Captura de glicopeptídeos de Superfície Celular Proteômica

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