Captura de glicopeptídeos de Superfície Celular Proteômica

O objetivo geral deste procedimento é enriquecer proteínas da membrana da superfície celular de baixa abundância. Isso é feito primeiro desnaturando e digerindo as proteínas da membrana. O segundo passo é oxidar os glicanos e capturar os peptídeos glicosilados em uma superfície de resina.

Os não glicopeptídeos são então lavados da resina. A etapa final é a liberação dos glicopeptídeos ligados a N da resina para análise de lc MS. Em última análise, a sequência de peptídeos identificada pode ser mapeada de volta para proteínas para fins de identificação e quantificação.

Hoje vou demonstrar como funciona a captura de peptídeos Geico. A principal vantagem desta técnica de superdosagem, ex existentes, como a captura de glicoproteínas, é que a proteína de membrana será primeiro digerida e a captura do glicopeptídeo pode ser realizada em um vaso. A aplicação dessa técnica pode se estender à descoberta do biomarcador da doença.

Uma vez que a proteína do jacaré pode ser derramada no sangue e em outros fluidos corporais e a glicoproteína circulante no sangue, que são específicas do processo patológico, podem ser usadas como biomarcadores de prognóstico e diagnóstico. Primeiro, prepare quatro mililitros de tampão hipotônico com um a 100 coquetel de inibidores de protease. Adicione um mililitro de tampão hipotônico em um pellet de célula contendo aproximadamente 10 a oitava células e incube a mistura por 15 a 30 minutos No gelo, transfira as células para um frasco de dois mililitros e pique as células passando a amostra cinco a 10 vezes por uma agulha de seringa.

Em seguida, use um hemocitômetro e uma coloração trian blue. Para verificar a eficiência da lise, combine o lisado de um mililitro com três mililitros de tampão hipotônico restante. Gire o tubo a 3000 vezes G a quatro graus Celsius por 15 minutos.

Transfira o sobrenadante para um tubo de ultracentrífuga e armazene o pellet em um freezer negativo de 80 graus Celsius. Girar o tubo de ultracentrífuga a 100 000 vezes G a quatro graus Celsius durante duas horas. Em seguida, dissolva a fração microssomal em 200 microlitros de tampão de desnaturação e, em seguida, ferva a solução a 100 graus Celsius por 10 minutos.

Depois de resfriar a solução aquecida à temperatura ambiente, adicione pó de ureia de pureza ultra-alta para obter uma concentração final de oito molares e incube a amostra a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após a incubação, adicione 500 milimolares. Oto Solução-mãe de acetamida à amostra para obter uma concentração final de 15 milimolares.

Em seguida, incube a solução no escuro por 30 minutos em temperatura ambiente para alquilar os tióis livres na amostra. Em seguida, adicionar uma solução-mãe molar de TDT à amostra para obter uma concentração final de 10 milimolares e incubar a solução por mais 10 minutos à temperatura ambiente. Para extinguir o excesso de acetamida I oto, diluir a solução obtida 10 vezes com tampão tris 40 milimolar em PH oito e, posteriormente, adicionar tripsina à amostra na proporção de um para 20 de tripsina para quantidade total de proteína.

Obter a quantidade de proteína total utilizando o ensaio de Bradford. Mantenha a reação de digestão em um forno a 37 graus Celsius durante a noite para garantir que a reação seja concluída. Quando terminar, termine a digestão acidificando a solução da amostra a pH um com ácido clorídrico 10 milimolar, uma condição que também se degrada mais rapidamente.

O detergente então se degrada mais rapidamente a 37 graus Celsius por uma hora em uma incubadora. Após a incubação, remover a precipitação desenvolvida por centrifugação após centrifugação. Limpe o SUP natin que contém os peptídeos da amostra com um cartucho de extração em fase sólida C 18 e seque a amostra obtida com aspirador rápido.

Realize uma análise de página SDS de amostras antes e depois das viagens e digestão para confirmar a eficiência da digestão. Neste ponto, dissolva os peptídeos limpos em 200 microlitros de tampão de acoplamento. Depois de adicionar purificação de sódio à solução peptídica para obter uma concentração final de 10 milimolares.

Incube a amostra por 30 minutos no escuro à temperatura ambiente Quando a incubação estiver completa, tempere o excesso de ácido com sulfito de sódio para obter uma concentração final de 20 milimolares e pH de cinco após a incubação por 10 minutos à temperatura ambiente, introduza 200 microlitros de solução de resina derivada de hidrócitos, pré-equilibrado e tampão de acoplamento na solução peptídica. Incube a reação a 37 graus Celsius por um a dois dias com rotação de ponta a ponta para acoplamento completo. Quando terminar, remova os peptídeos não ligados lavando a resina duas vezes com um mililitro de água deionizada, um mililitro de cloreto de sódio 1,5 molar, um mililitro de metanol e um mililitro de 80% de aceto nitrilo.

Em seguida, colete o sobrenadante e as lavagens para a análise de peptídeos não ligados. Armazene as amostras em um freezer de 80 graus Celsius negativos até a análise. Em seguida, lave a resina três vezes com um mililitro de bicarbonato de amônio 100 milimolar a pH oito.

Finalmente, adicione 300 microlitros de bicarbonato de amônio no sample frasco. Para liberar os glicopeptídeos N da resina. Adicione PNG ACE F e incube a amostra a 37 graus Celsius com uma rotação de ponta a ponta.

Em seguida, colete os peptídeos liberados por centrifugação e, em seguida, lave a resina com um mililitro de acetilnitrilo a 80%. Combine a lavagem com a coletada anteriormente. Por fim, secar a solução obtida na velocidade VAC para análise lc MS.

O espectro de glicopeptídeos atípicos obtido após o método de enriquecimento é mostrado aqui no glicopeptídeo obtido. O glicano n foi removido e o glicano ligado depreciativamente foi convertido em ácido espártico por P-N-G-A-F. Portanto, o espectro pode ser prontamente pesquisado por qualquer mecanismo de pesquisa proteômica em bancos de dados de sequências de proteínas comuns.

Lc MS atípico. O resultado dos n glicopeptídeos capturados é mostrado aqui, no qual mais de 100 glicoproteínas podem ser identificadas a partir de uma única execução de lc MS de uma fração microssomal celular. A seletividade de enriquecimento para glicoproteínas e glicopeptídeos é geralmente superior a 90%Uma análise bem-sucedida pode ter uma seletividade de enriquecimento de 95%usando uma coluna SCX e gradiente de etapa para fracionar ainda mais. As amostras antes da análise LCMS geralmente dobram o número de identificações de glicoproteínas.

Às vezes, quando a quantidade de glicopeptídeos obtidos é baixa, a impureza acumulada dos frascos pode ser observada na amostra final. Esses contaminantes podem ser removidos por uma coluna MCX. Então, depois de assistir a este vídeo, espero que você tenha uma boa compreensão de como usar nossos métodos de captura de glicopeptídeos para estudar a proteína de membrana de autoatendimento.

Enquanto você está tentando esse protocolo, também é importante reservar amostras para cada etapa para solução de problemas. O volume do reagente também pode ser otimizado para o seu estudo específico.