Induzida por laser Breakdown Spectroscopy: Uma Nova Abordagem para Mapeamento e Quantificação de nanopartículas em Organ Tissue

O objetivo geral deste procedimento é oferecer um método simples e robusto para mapear e quantificar elementos orgânicos e inorgânicos em tecidos biológicos, utilizando instrumentação de bancada totalmente compatível com a microscopia óptica convencional. Isso é realizado focalizando um pulso a laser sobre a amostra de interesse para iniciar a ruptura e a faísca do material. O plasma emite radiação que é posteriormente analisada por um espectrômetro.

O segundo passo é selecionar e identificar as linhas espectrais correspondentes aos elementos de interesse e escanear a superfície da amostra. Em seguida, realize medições de calibração para permitir a determinação das concentrações elementares. O passo final é construir o mapeamento elementar do tecido da amostra a partir de todos os espectros registrados, utilizando uma escala de intensidade relativa ou de concentração.

No fim das contas, a espectroscopia de ruptura induzida por laser é utilizada para mostrar a distribuição tecidual de diversos elementos sem qualquer marcação, em comparação com outros métodos existentes, como a microfluorescência de raios X ou técnicas baseadas em espectroscopia de massas. A espectroscopia de ruptura induzida por laser, ou LIBS, é simples de implementar, opera à pressão atmosférica e é compatível com a maioria dos sistemas de microscopia óptica.

Além disso, permite alcançar nível de sensibilidade em PPM com resolução na ordem de mícrons. Este método pode ajudar a responder uma questão fundamental na nanotecnologia aplicada a estudos biológicos, como a distribuição, em uma amostra de tecido, de nanopartículas contendo elementos metálicos, sem a necessidade de marcação das nanopartículas. A técnica pode ser estendida à patologia devido ao seu baixo limite de detecção na identificação de elementos metálicos anormais, tais como cobre, ferro e alumínio, que podem existir em diferentes órgãos do corpo, especialmente no cérebro. Por meio deste método, é possível obter informações sobre a detecção e identificação de nanopartículas.

Também pode ser aplicado a outros sistemas, como a detecção de elementos inorgânicos na TCU ou a distribuição heterogênea de elementos. Os cientistas que precisarem realizar tais experimentos terão de se esforçar com as configurações de aquisição para obter o máximo possível de sinal sem danificar excessivamente as amostras. Inicie o experimento preparando lâminas de amostra a serem estudadas para este protocolo.

Obtenha órgãos de camundongos com tumores, injetados com solução de nanopartículas de gadolínio para preparar lâminas. Coloque fatias de 100 micrômetros de espessura dos órgãos sobre uma lâmina de quartzo ou uma placa de Petri. Sempre armazene as lâminas a menos 80 graus Celsius.

Em seguida, prepare as amostras para calibração. Rotule vários frascos com as concentrações, começando em zero nanomolar e terminando em cinco milimolar. Para cada frasco, prepare 100 microlitros de uma mistura de gadolínio em água com a concentração apropriada.

Uma vez feito isso, prepare um lâmina. Meça cinco microlitros do primeiro frasco e coloque-os sobre a lâmina de quartzo ou a placa de Petri. Certifique-se de identificar a gota para uso posterior.

Desloque-se três milímetros ao longo da circunferência e coloque cinco microlitros da próxima concentração sobre a lâmina. Faça o mesmo para cada uma das soluções restantes. Seque o conteúdo da lâmina por 20 minutos à temperatura ambiente.

Esta configuração de LIP utiliza um laser de nanosegundo de itrio, alumínio e granada dopado com neodímio, que produz um feixe com comprimento de onda de 1064 nanômetros. Use uma parte do feixe para sincronizar o sistema espectrométrico. Direcione a outra parte através de um atenuador controlado por computador, utilizado para ajustar e estabilizar a energia do pulso do laser durante todo o experimento.

Em seguida, direcione o feixe para a região da amostra. Foque o feixe sobre a plataforma de translação controlada por software. Isso manterá o suporte da amostra e uma câmera CCD para monitorar a superfície montada da amostra.

Outro para monitorar o plasma da chama. Analise a luz proveniente da decomposição da amostra em um espectrômetro de rede com uma câmera ICCD mantida a menos 26 graus Celsius. Para a medição, comece estabilizando o laser e resfriando a câmera a menos 26 graus Celsius.

10 minutos antes do experimento. Quando estiver pronto, use o atenuador para ajustar a energia do pulso em cinco milijoules. Em seguida, retire uma lâmina de amostra para análise e prepare-se para montá-la na platina da amostra.

Fixe a amostra no suporte de amostras motorizado. Após isso, retorne ao computador. Para posicionar a amostra, mova a platina de modo que uma parte da amostra fique no feixe do laser.

Ajuste o foco do laser a cerca de 100 micrômetros abaixo da superfície da amostra. Quando isso for feito, o laser formará crateras de 50 micrômetros ou menos. Use o computador para definir o valor da fenda de entrada do espectrômetro em 40 micrômetros e os parâmetros do ICCD para a medição de mapeamento.

Ajuste a posição do suporte para direcionar-se a uma região da amostra. Faça uma imagem panorâmica de alta resolução da amostra utilizando uma fonte de luz de espectro amplo. Em seguida, utilize um software e a imagem capturada para definir a região de varredura e a resolução do libs.

Aqui, a grade é de 100 por 100, com 100 micrômetros entre os pontos. Inicie a aquisição automatizada dos dados em cada ponto da grade. Um espectro é medido e registrado em arquivo.

Quando as medições forem concluídas em cerca de 30 minutos, tire uma segunda imagem da fatia da amostra, depois consolide todos os espectros em um único arquivo de dados para uso posterior. Em seguida, remova a lâmina da amostra e prepare-se para montar as amostras de calibração. Fixe a lâmina de quartzo com as amostras de calibração na platina de translação junto ao computador.

Posicione o centro da primeira amostra de calibração no trajeto do laser. Mantenha os parâmetros do experimento e registre um espectro. Faça o mesmo para cada uma das amostras com diferentes concentrações de gadolínio.

Estes são exemplos de espectros de disparo único registrados de diferentes regiões do tecido renal. O espectro azul foi registrado na região central do rim. O espectro vermelho corresponde à membrana renal e o espectro verde é da área periférica.

As nanopartículas injetadas, baseadas em gadolínio, são compostas por uma matriz de polilano com íons de gadolínio quelatados por ligante doca em suas superfícies. Na faixa espectral de 286 nanômetros a 320 nanômetros utilizada, é possível detectar gadolínio, cálcio, ferro, silício e alumínio. Observe como as intensidades variam nas diferentes regiões da amostra, sugerindo uma grande heterogeneidade nas concentrações desses elementos. O mapeamento tecidual de gadolínio, silício e ferro em uma fatia de rim de camundongo foi realizado utilizando os dados de libs com uma resolução de cerca de 100 micrômetros.

A intensidade da escala é expressa em uma unidade arbitrária. Esta é uma imagem de luz natural. Para comparação, resultados semelhantes foram obtidos com amostras de tumor.

Como neste mapa do gadolínio e do tecido tumoral SQ 20 B, uma escala de cores falsa foi sobreposta à imagem em luz natural. Para este experimento, nanopartículas foram administradas diretamente no tumor. Após uma hora, o tumor foi removido e preparado para análise.

Observe que aproximadamente metade do volume do tumor contém algumas partículas em masters. Esta técnica pode ser realizada em menos de uma hora para amostras de um centímetro quadrado com uma resolução de 100 micrômetros, se for realizada corretamente. Ao realizar lips, é importante lembrar que as medições são feitas a partir do plasma induzido por laser e é crucial controlar todos os parâmetros durante todo o experimento, seguindo o procedimento.

Outros métodos podem ser realizados, como imunohistoquímica em cortes adjacentes, com o objetivo de responder perguntas adicionais, como o tipo de célula envolvida no processo de interesse após seu desenvolvimento. Esta técnica abre caminho para pesquisadores na área de nanotecnologia aplicada à biologia e à medicina explorarem a distribuição de compostos contendo elementos metálicos em tecidos biológicos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar as técnicas de lips para mapear múltiplos elementos em tecidos biológicos.