Name: Preparação de Primário Miogênica de Células Precursoras / Culturas de mioblastos de Vertebrados basais Linhagens (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Aprenda a preparar culturas primárias de células precursoras miogênicas de teleósteos para estudar miogênese in vitro. Este método envolve dissecação, dissociação mecânica e enzimática do tecido muscular epaxial com plaqueamento em substrato de Laminina.

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Os autores gostariam de estender muitos agradecimentos aos Drs.. Josep Planas e Juan Castillo por sua experiência profissional no desenvolvimento e aplicação do presente protocolo cultura para pequenos peixes e anfíbios. Agradecimentos também são devidos aos inúmeros indivíduos que incansavelmente assistida com a dissecção e dissociação do tecido muscular de muitos peixes (tanto em espécies e número), incluindo Matthew carregamento, Delci Christensen, Zachary Fowler, Brooke Franzen, Nathan Froehlich, Kira Marshall, Ben Meyer, Ethan Remily e Sinibaldo Romero. Este trabalho foi financiado pela Universidade de Alabama em Birmingham Departamento de Biologia fundos de arranque, Center for Research Protease NIH Grant # 2P20 RR015566, NIH NIAMS Grant # R03AR055350 e NDSU avançar NSF Grant # HRD-0811239 para PRB. O suporte também foi fornecido pela UAB Nutrição Obesidade Centro de Pesquisa prêmio # P30DK056336, NIH NIDDK. Seu conteúdo é de responsabilidade exclusiva de seus autores e não necessariamenterepresenta a visão oficial do NIH.

Declaração de Ética: Todos experimentação envolvendo animais vertebrados descritos aqui foi previamente aprovado pelo Comitê da Universidade de Alabama em Birmingham Institutional Animal Care e Use e é consistente com as diretrizes estabelecidas pela Secretaria de Laboratório Animal Welfare, National Institutes of Health de os EUA Departamento de Saúde e Serviços Humanos. 1. Preparação para a Cultura <ol><li> Preparar o meio de base da seguinte forma: 9 mM de NaHCO3 (1,51 g por 2 L), HEPES 20 mM (9,53 g por 2 L), em DMEM (13,48 g / L; 26,96 g por 2 L). <ol><li> Determinar o pH e ajustar a 7,40 com HCl ou NaOH. </li><li> Determinar e ajustar a osmolalidade ~ 300 mOsm com NaCl (se necessário). </li><li> Filtro esterilizar utilizando (2) sistemas de esterilização de 1 L de vácuo e armazenar a 4 ° C protegidos da luz durante até 2-3 meses. NOTA: Ver Tabelas 1 e 2 para o reagente completo, ferramentas, consumveis, e informações sobre o equipamento. </li></ol></li><li> Prepara-L-lisina-tratados poli placas por dissolução de 5 mg de irradiadas-γ poli-L-lisina (&gt; 300.000 mw) em 50 ml de água ultrapura esterilizada. Misturar suavemente por inversão durante 10 minutos à temperatura ambiente, assegurar a dissolução completa dos polímeros de lisina. </li><li> Pipetar a quantidade necessária de poli-L-lisina solução em cada poço, de acordo com o tipo de placa (Tabela 3). Permitir que as placas de suporte em fluxo laminar capuz durante 5 minutos. </li><li> Em seguida, remova-poli-L-lisina solução e lavar duas vezes com água estéril. Permitir placas para o ar seco em fluxo laminar capô por 20 minutos. </li><li> Obter 1 mg de laminina (origem Engelbreth-Holm-Swarm) e dissolver em 50 ml de meio de base para uma concentração final de 20 ug / ml. Aplicar a solução de laminina para placas de cultura celular de poli-L-lisina-tratados em 2 mg / cm 2. (Ver Tabela 3 para diferentes tamanhos de placas) </li><li> Agite suavemente a solução para garantir full bem cobertura. Selar as placas com fita laboratório e colocar em incubadora por 24 horas. A incubadora deve ser definido como a temperatura apropriada para a espécie a ser utilizadas (ver Tabela 7), e sem gases adicionais necessitam de ser adicionados à incubadora. NOTA: A laminina devem ser autorizados a aderir às placas por 24 horas antes de semear células. Não fazer isso irá resultar em pobre para não adesão celular. </li><li> Prepare mídia, como descrito na Tabela 4. Mídia completa é melhor preparada no dia de uso. </li><li> Em preparação para o isolamento de tecido, montar os seguintes itens e autoclave: 300-500 ml copo (s); pratos de vidro de Petri; bisturi alças; fórceps (fina e grossa); tesoura de dissecção; e várias folhas de papel autoclave repelente de água. NOTA: Para cada pessoa ajudar com o processo de dissecação, (2) alças de bisturi, (1) pinças (tipo dependendo da preferência pessoal), (1) tesoura de dissecção, e (5-10) folhas de papel autoclave repelente de água sãosuficiente. </li><li> Além dos artigos acima autoclavados, montar etanol a 70%, um equilíbrio do peso, 50 ml de tubos cónicos estéreis (número depende do tamanho da cultura), e gelo. </li></ol> 2. Dissecção de tecido <ol><li> Antes de começar, certifique-se de que um estoque suficiente de peixes. NOTA: A idade do peixe a ser utilizado é de importância crítica. Enquanto os peixes de duas espécies diferentes podem ser de pesos semelhantes, um peixe mais jovem de uma espécie irá possuir mais do que um peixe PPM mais velho de outra espécie. Como regra geral, os peixes mais novos, especialmente quando se trabalha com salmonídeos, são as melhores. Para danionins, peixe tão antiga como um ano pode ser utilizada de forma otimizada, enquanto salmonídeos de idade 4-6 meses ou mais jovens (até 15 g) são ideais. </li><li> Para cada 5 g de tecido a ser dissecado, alíquota de 25 ml do meio de isolamento para um estéril tubo de 50 ml. </li><li> Pesar, massa registro e número do tubo (s). Colocar os tubos em gelo. </li><li> Eutanásia 2-3 peixede cada vez, por imersão em&gt; 300 mg / L de sódio tamponada com bicarbonato de tricaina metanossulfonato. Permitir o movimento do opérculo cessar durante&gt; 5 minutos e, em seguida, mergulhe peixe em etanol a 70% (contida nos copos estéreis) durante 30 segundos. </li><li> Retire o peixe a partir de etanol 70% e colocar em autoclave papel repelente de água. Diretamente atrás do opérculo, usar um bisturi para fazer uma incisão superficial, superficial. Remover as escamas da pele e agarrando a pele através da incisão acima mencionado e puxar para cauda de peixe. </li><li> Após a remoção da pele, extirpar o epaxial, fast-glicolítico muscular &#39;branco&#39; do peixe de ambos os lados (evitando o músculo &#39;vermelho&#39; slow-oxidativo localizado perto da linha lateral) e coloque no meio de isolamento. Descartar o restante dos peixes tal como exigido pela instituição. Células Embora seja perfeitamente possível PPM cultura provenientes de músculo vermelho, quase todas as publicações usando teleósteos PPM tem utilizado isolados do epaxial m: NOTAyotome. </li><li> Repita os passos 2,4-2,6 até uma quantidade suficiente de músculo é obtido. Durante a dissecção, garantir que o tecido do músculo permanece reunido em gelo para manter a viabilidade celular. </li></ol> 3. Dissociação mecânica <ol><li> Despeje um tubo de 25 ml / 5 g de tecido muscular em uma placa de Petri de vidro. Usando dois bisturi lida com anexados # 10 lâminas de bisturi, tecido picada até obter uma consistência de chorume ou purê. Um movimento &quot;vai-e-vem&quot; de puxar as lâminas de bisturi após se funciona melhor. Nota: Enquanto homogeneizadores tecido pode parecer adequado, o número de células viáveis ​​serão drasticamente reduzidos, se não abolido. </li><li> Usando uma pipeta de 25 ml sorológica e pipeta sorológica, remover o tecido empapado e substituir no tubo cônico de origem. </li><li> Repita os passos 3,1-3,2 até todos os tecidos em todos os tubos foi dissociado mecanicamente. </li><li> Tecido Centrifugar durante 5 minutos a 300 xg e 10 ° C. </li><li> Folldevido a centrifugação, descartar os 25 ml de sobrenadante de mídia com uma pipeta 25 ml sorológico, aspirador a vácuo, ou por decantação cuidadosa. </li><li> Adicionar 25 ml de meio de lavagem a cada tubo de tecido, ressuspender e recentrifuge como acima. </li><li> Lavar duas vezes com meio de lavagem, remoção do sobrenadante de cada vez. </li></ol> 4. Dissociação enzimática <ol><li> Durante o passo 3.4, preparar uma solução de colagenase por combinação de 0,22 g de colagenase do tipo IV e de 44 ml de meio de base (ou quantidade suficiente para g/0.22 0,11 ml). </li><li> Misture um copo por 10-15 minutos a 4 ° C. Filtro esterilizar com uma seringa de 50 ml e um filtro de seringa de 0,45 um. NOTA: Mais do que um filtro de seringa pode ser necessário, dependendo da preparação da colagenase. Colagenase obtidos a partir de diferentes Worthington Biochemical fornecedores representa mais dificuldade durante a filtração. A colagenase é utilizado para dissociar ligações peptídicas em colagénio que constituem o endomísio. Estedigestão vai remover essa barreira protetora das fibras musculares. </li><li> Por cada grama de tecido muscular, ressuspender o tecido numa solução de colagenase a 0,2%. Para se 5 g de tecido muscular, adicionar 10 ml de solução de colagenase e de 15 ml de meio de base. </li><li> Adicionar 10 ul de PSF por ml de solução / meio base de colagenase (por exemplo, 250 ul para 25 ml). Certifique-se de que o tecido é bem suspenso, pois isso irá afetar a eficiência da digestão enzimática. </li><li> Incubar o tecido muscular em colagenase durante 60 minutos a 18 ° C com oscilação suave. Dependendo do grau de dissociação mecânica e espécies, a digestão de colagenase pode ser prolongado até 90 minutos, embora isto possa afectar a viabilidade celular. </li><li> Seguindo os tubos de digestão com colagenase, cónicos de centrifugação a 300 xg durante 5 minutos a 12 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender o tecido em 25 ml de meio de lavagem. </li><li> Recentrifuge a 300 x g durante 5 minutos a 126; C. Repita com o meio de lavagem uma segunda vez. </li><li> Depois de lavar duas vezes o tecido, o tecido do músculo ressuspender em 25 ml de meio de lavagem e tritura-se com uma pipeta 10 ml serológico até o tecido / homogenato médio passa dentro e para fora da pipeta com relativa facilidade. 5-10 triturações é geralmente suficiente. <ol><li> Repetir com uma pipeta de 5 mL e, em seguida, serológico cânula de metal de 16 gauge ligada a uma seringa. </li></ol></li><li> Tubos de centrífuga cónicos a 300 xg durante 5 minutos a 12 ° C. Decantar o sobrenadante. </li><li> Durante a centrifugação acima de 5 minutos, a preparação da solução de digestão de tripsina por combinação de 0,25 g de tripsina com 5 ml de meio de base. </li><li> Agita-se a 4 ° C durante 10-15 minutos e filtra-se esterilizar com uma seringa de 20 ml e de 0,45 um filtro de seringa. </li><li> Recuperar tubos cónicos e adicionar 100 ul de solução de tripsina e 4,9 ml de meio de dissociação para cada 1 g de tecido muscular de cada tubo. Para example, adicionar 500 mL de solução de tripsina e de 24,5 ml de meio de dissociação de 5 g de tecido muscular. NOTA: A tripsina é uma serina-protease que irá separar as células precursoras a partir de miogénicas a lâmina basal. </li><li> Tecido Ressuspender no tripsina / dissociação médio. Incubar durante 20 minutos a 18 ° C. </li><li> Após a primeira incubação com tripsina, tubos cónicos de centrifugação a 300 xg durante 1 min a 12 ° C. </li><li> Neutraliza-se a tripsina pela combinação dos sobrenadantes com meio de isolamento, a uma concentração de 1 volume de sobrenadante para 4 volumes de meio de isolamento. Armazenar a 4 ° C durante a segunda digestão com tripsina. </li><li> Para o sedimento restante do tecido, repetir os passos 4,12-4,15, combinando o sobrenadante seguinte passo 4.15 com o meio sobrenadante / isolamento a partir da primeira digestão de tripsina. </li><li> ALTERNATIVAMENTE: Os colagenase e tripsina digestões podem ser combinadas para optimizar os rendimentos de células. &lt;ol&gt; <li> Para fazer isto, tritura-se o digerir com colagenase usando uma cânula de metal (6 de comprimento e calibre 16 funciona melhor) ligada a uma seringa de 20 ml, até o homogeneizado passa facilmente através da cânula. </li><li> Para o homogeneizado, adicionar 500 mL de solução de tripsina (preparado no passo 4.10) e incubar a 18 ° C durante 20 minutos. </li><li> Seguindo os tubos de incubação, cónicos de centrifugação a 300 xg durante 1 minuto, a 12 ° C. </li><li> Neutraliza-se a tripsina pela combinação dos sobrenadantes com meio de isolamento, a uma concentração de 1 volume de sobrenadante para 4 volumes de meio de isolamento. </li><li> Armazenar a 4 ° C durante a segunda digestão com tripsina. </li><li> Prossiga com o passo 4.18 como com o protocolo padrão. </li></ol></li><li> Dispensar a final sobrenadante / isolamento mistura meio em tubos de 50 ml cônico e centrifugar a 300 xg durante 10 minutos a 12 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante tomando cuidado para não perturbar o celularpelotas. Pipeta de 2 ml de meio completo a cada tubo, dissolvendo cada sedimento celular. </li><li> Combinar as células suspensas em meio completo em um tubo de 50 ml. </li><li> Lavar cada tubo com 1 mL de meio completo, que combina com o conjunto de células ressuspensas anteriormente. </li><li> Tritura-se com uma cânula de metal e uma seringa de 5-10 vezes. </li><li> Filtrar a suspensão de células através de um coador de células de 100 mM, lavagem com meio completo. </li><li> Filtra-se a suspensão de células através de um coador de células de 40 ^ m. </li><li> Adicionar meio completo suficiente para 50 ml e centrifugar a 300 xg durante 10 minutos a 15 ° C. </li></ol> 5. Contar, diluição e Sementeira de Células <ol><li> Após a centrifugação final no passo 4.25, remover o sobrenadante por decantação cuidado ou com uma pipeta sorológica. Ressuspender o sedimento de células em 5 ml de meio completo. </li><li> Com células totalmente ressuspenso, remover 20 ul, De suspensão de células e colocar em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Adicionar 5 mL de corante azul de Tripan e aguarde 5 minutos. Usando um hemocitómetro, determinar o número de células viáveis. </li><li> Após a determinação, diluir as células com a concentração necessária. Teleósteos PPM são mais cultivadas a 150.000-200.000 células por cm 2. Para uma estratégia de seis cavidades, chapeamento, diluir as células a 1,5 x 10 6 - 2,0 x 10 6 por ml suporta a proliferação e diferenciação suficiente. </li><li> Recuperar-L-lisina-tratados poli, placas revestidas de laminina e células de sementes. (Veja a Tabela 5 para as diluições específica de placa e os volumes de chapeamento.) NOTA: A Tabela 6 descreve o número médio de células isoladas por grama de tecido de músculo isolado a partir de várias espécies de teleósteos. Truta arco-íris (O. mykiss) apresentam menos PPM por grama de tecido muscular do que peixe-zebra (D. rerio) e, assim, exigem mais peixe para isolar a partir de semeadura adequada. </li><li> Selar as placas com fita de laboratório e em lugar incubadora de refrigeração, à temperatura adequada. PPM de todas as espécies listadas aqui (exceto para os ratos) pode ser incubados sob condições atmosféricas normais, sem a suplementação de dióxido de carbono (CO 2). (Ver Tabela 7). </li><li> Em alternativa: Alguns laboratórios têm adotado um protocolo que exige permitindo PPM a aderir ao substrato de cultura para 40 minutos. <ol><li> Em seguida, lave as placas com os meios de lavagem para remover as células frouxamente unidas e não aderentes. Aviso: Esta etapa é muito importante para evitar a adesão &quot;não específica&quot; de outras células (por exemplo, os fibroblastos) para os substratos cultura. </li><li> Adicionar mídia completas e células lugar na incubadora e cuidar como detalhado abaixo. </li></ol></li></ol>

Não há nada a divulgar.

O programa miogénica, em qualquer espécies examinadas, pode ser mais facilmente estudado por meio de um sistema in vitro. Com efeito, após o isolamento, as células precursoras miogénicos (PPM) em peixes ou células myosatellite (MSCs) em mamíferos facilmente entrar neste processo altamente regulado que envolve a proliferação, a retirada do ciclo celular, e a diferenciação terminal de mioblastos e a fusão dos mioblastos em miotubos nascentes. A falta generalizada de linhagens transgênicas repórter gene de espécie...

Compreensão considerável de myogenesis mamíferos foi obtida através da recapitulação do processo em ambos os rato primária (Mus musculus) culturas de mioblastos ea linha celular derivada de rato bem descrita, C2C12 5. Começando nos anos 1950, 6, estas culturas conduziram a muito avanço na compreensão do programa murinemyogenic e, por extensão, miogenese em outros vertebrados. Além disso, uma única célula técnicas myofiber explantes têm aumentado a compreensão das interações entre células satélites e fibras musculares em torno 7-9. Culturas celulares são particularmente atraentes para as investigações de miogênese, devido ao curto espaço de tempo a partir de precursor de célula diferenciada 10, relativa facilidade de transfecção de RNAi 11-14, transgênico 15,16 e superexpressão estudos 14,17,18, a expansão in vitro seguida de transplante in vivo 18-20, e até mesmo uma miniaturaarison de células precursoras miogênicas e seus agentes reguladores em todo taxa 21,22. Embora as diferenças devidas ao meio artificial do sistema de cultura têm sido descritos 5,23, estes sistemas in vitro têm provado ser indispensável para a dissecção do programa que regula a formação de complexo de multinucleadas, myofibersfrom terminalmente diferenciada mononucleated células progenitoras proliferativas conhecidos como myosatellite células (MSCs) entre os mamíferos. Fora da classe Mammalia, no entanto, a conservação e / ou divergência de mecanismos que controlam myogenesis são mal compreendidos, em grande parte devido à dificuldade em cultura de células precursoras miogênicas (PPM) e mioblastos de vários táxons. De facto, as culturas de mioblastos primários apenas tenham sido descritas em três aves 24-26, um réptil 27, algumas anfíbios 28-30, e alguns peixes 1,3,4,31-33. Linhagens de células miogênicas contínuos de vediferentes roedores 34-36 rtebrates são ainda mais raros, com a única linha de não-mamíferos miogênica célula sendo derivado de codornas japonesas (Cortunix japonica), QM7 37. Apesar de muitas tentativas de imortalização, uma linha celular miogênica teleósteos permanece indefinida e um protocolo para a transfecção eficiente dessas células só foi publicado este ano 15. Assim, os protocolos claros e bem otimizadas para cultivar PPM primárias e mioblastos de uma variedade de vertebrados são muito necessárias, não só para expandir ainda mais o nosso conhecimento sobre a evolução do programa miogênica, mas para empregar o poder da fisiologia comparativa para fazer descobertas em o tratamento de doenças do músculo esquelético e distúrbios humanos. Enquanto a literatura contém muitos relatos de isolamento MPC / mioblastos 38-49, é comum que os autores descrevem os protocolos para esses isolamentos em breve, muitas vezes incompletos, formatos. Além disso, os protocolos mais instrutivas reported foram desenvolvidos para ratos 50-53, e algumas delas contam com seleção anticorpo 54,55 ou transgenes fluorescência 56,57, tornando estes protocolos inutilizável ou íntimos espécie não roedora impraticáveis ​​utilizadas por biólogos musculares. Com pouco sabe sobre piscine, anfíbio, réptil e miogênese, um protocolo detalhado e completo, descrito com orientação audiovisual e com eficiência demonstrada em espécies distantemente relacionadas, seria mais útil para o campo. Descrita pela primeira vez por Powell e seus colegas em 1989 58, o seguinte protocolo foi inicialmente desenvolvido para isolar PPM e mioblastos de peixes salmonídeos (ou seja, a truta arco-íris, Oncorhynchus mykiss, e salmão do Atlântico, Salmo salar) e alguns ciprinídeos maiores (ou seja, peixinho, Carassiusauratusauratus) . Em 2000, Fauconneau e Paboeuf otimizado uma cultura de mioblastos primário para truta arco-íris 59, e minoroptimizations made que o protocolo utilizável em vários peixinhos menores do clade Danioninae (peixe-zebra, Danio rerio, e Danio gigante, Devario aequipinnatus) 32, devido às muitas ferramentas genéticas disponíveis para o trabalho do peixe-zebra e, portanto, seus parentes próximos. Peixes teleósteos são organismos atrativos para estudo devido à sua estratégia de crescimento divergentes (pelo menos na maioria das espécies). Grandes salmonídeos, como a maioria dos peixes, crescer indeterminadamente, com potencial de crescimento desenfreado por uma assíntota na maturidade, mesmo em idade avançada 60-62. Ao contrário de peixe-zebra, grandes danionins como o Danio gigante 63 e potenciais de crescimento exibição Danio moustached típicos de peixes teleósteos, tornando a sua justaposição direta uma plataforma ideal para a compreensão se escolha o destino da célula MPC desempenha um papel na hiperplasia do músculo esquelético contra hipertrofia. Da mesma forma, temos demonstrado que este protocolo pode ser utilizado com ratos e axolotls, com rendimento relativamente alto celular e VIABíndices ILIDADE. Salamandras Urodelos, como a axolotl mexicano (Ambystomamexicanum), possuem a notável capacidade de regenerar tecidos, incluindo membros e caudas 64-66 inteiras. Esta característica faz com que esses anfíbios modelos interessantes de perda de massa muscular esquelética e envelhecimento. Usando o protocolo descrito abaixo, uma abordagem similar pode ser efectuada, como foi feito em muitas espécies de peixes, fornecendo um contexto comparativo ainda maior de tais estudos. Como muitos biólogos verdadeiramente apreciam comparativos, os avanços mais significativos em biologia básica e translacional biomedicina pode ser feita quando os dados são analisados ​​dentro do mais amplo espectro (aqui, toda a linhagem dos vertebrados).

<table><tbody><tr><td colspan="4">Tabela 1. Informações detalhadas sobre</td></tr><tr><td>reagentes Reagent</td><td>Company (Preferencial v. Alternativo)</td><td>Número de catálogo (Preferido v. Alternativo)</td><td>Quantidade por cultura</td></tr><tr><td>&gamma;-irradiado poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich (MP Biomedicals)</td><td>P5899 (ICN19454405)</td><td>5 mg</td></tr><tr><td>DMEM (glicose alta)</td><td>Sigma-Aldrich (cellgro)</td><td>MT-50-003-PB (D7777)</td><td>2 L</td></tr><tr><td>Laminina</td><td>BD Biosciences ( Sigma-Aldrich)</td><td>CB-40232 (L2020)</td><td>1 mg</td></tr><tr><td>de Bicarbonato de Sódio (NaHCO3)</td><td>Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)</td><td>BP328-500 (S5761)</td><td>1,51 g</td></tr><tr><td>HEPES (C8H18N2O4S)</td><td>Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)</td><td>BP310-1 (H6147)</td><td>9,53 g</td></tr><tr><td>Antibiótico/Antimicótico</td><td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td><td>SV3007901 (A5955)</td><td>17-20 mL</td></tr><tr><td>de Sulfato</td> <td>de GentamicinaLonza (Sigma-Aldrich)</td><td>BW17-519Z (G1397)</td><td>2-3 mL</td></tr><tr><td>de doador Equino Sera</td><td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td><td>SH3007403 (H1270)</td><td>75 mL</td></tr><tr><td>de soro fetal bovino</td><td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td><td>SH3007103 (F2442)</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>de colagenase (tipo IV)</td><td>Worthington (Sigma-Aldrich)</td><td>LS004189 (C9891)</td><td>0,44 g</td></tr><tr><td>de tripsina (do pâncreas)</td><td>MP Biomedicals (Sigma-Aldrich)</td><td>ICN15357125 (T5266)</td><td>1 g</td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 2. Consumíveis, Ferramentas e Equipamentos</td></tr><tr><td>Ferramentas de Consumo</td><td></td><td>Equipamento</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Cultura de Células</td><td>Fórceps (Grosso)</td><td>Pipetador</td><td></td>Serológico</tr><tr><td>Estéril 50 mL Tubos Cônicos</td><td>Fórceps (Fino)</td><td>Medidor</td><td></td></tr><tr><td>de pH Fita de Laboratório</td><td>Cabos de Bisturi</td><td>Incubadora de Resfriamento (Echotherm)</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &mu; m Sistemas de Esterilização a Vácuo</td><td>Lâminas de bisturi (#10, #11)</td><td>Capuz</td><td></td>de fluxo laminar</tr><tr><td>Autoclave repelente de água Papel</td><td>Tesoura cirúrgica</td><td>Coletor de vácuo Pipetas</td><td></td></tr><tr><td>sorológicas</td><td>de vidro Placas</td> de <td>Petri Medidor</td><td></td></tr><tr><td></td> de microosmolalidade <td>12-16 G Cânulas com Luer Locks</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 3. Volumes otimizados para revestimento de placas de cultura de células</td></tr><tr><td>Tamanho da placa</td><td>cm^2 por poço</td><td>Poli-L-lisina</td><td>*Laminina**</td></tr><tr><td>6 poço</td><td>9,5</td><td>1,6 mL</td><td>1</td></tr><tr><td>24 poço</td><td>1,9</td><td>0,32</td><td>0,2</td></tr><tr><td>48 poço</td><td>0,95</td><td>0,16</td><td>0,1</td></tr><tr><td>96 poço</td><td>0,32</td><td>0,06</td><td>0,03</td></tr><tr><td>*0,1 mg/mL concentração</td><td>** 0,020 mg/mL concentração</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 4. Meios para isolamento, dissociação e isolamento de</td></tr><tr><td>reagentes</td><td></td><td>de cultura Wash</td><td>Dissociação</td></tr><tr><td>Base Média</td><td>419,25 mL</td><td>395,40 mL</td><td>297,00 mL</td></tr><tr><td>Sulfato de gentamicina**</td><td>0,75 mL</td><td>0,60 mL-Soro</td><td></td></tr> <tr><td>Equino do Doador</td><td>75,00 mL</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino***</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>* PSF: penicilina/estreptomicina/coquetel de fungizona (100x); ** Concentração de 50 mg/mL; Caracterizado</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 5. Diluições recomendadas e volumes de revestimento</td></tr><tr><td>Tamanho da placa</td><td>cm^2 por poço</td> Volume <td>de revestimento</td>de <td>diluição</td></tr><tr><td>6 poços</td><td>9,5</td><td>1,5-2,0x10^6 células/mL</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>24 poços</td><td>1,9</td><td>1,5-2,0x10^6 células/mL</td><td>250 &mu; L</td></tr><tr><td>48 poço</td><td>0,95</td><td>1,5-2,0x10^6 células/mL</td><td>150 &mu; L</td></tr><tr><td>96 poço</td><td>0,32</td><td>1,5-2,0x10^6 células/mL</td><td>50-100 &mu; L</td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 6. Número médio de células por g de tecido</td></tr><tr><td>Espécie</td><td>Média # células/g de tecido</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Danio rerio</td><td>6.400.000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Danio dangila</td><td>1.783.000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Devario aequipinnatus</td><td>1.797.000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oncorhynchus mykiss</td><td>66.800</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 7. Temperaturas de incubação recomendadas</td></tr><tr><td>Temperatura</td><td></td><td></td><td>da espécie</td></tr><tr><td>Danio/ Devario spp.</td><td>26 - 28 &graus; C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oncorhynchus/Salmo spp.</td><td>10 * - 18 graus; C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ambystoma mexicanum</td><td>18&deg; C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>* Temperaturas mais baixas suportam taxas de proliferação mais baixas.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparação de primário miogênica de células precursoras / culturas de mioblastos de vertebrados basais linhagens

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Devido à dificuldade e tempo inerente envolvido com o estudo do programa miogênica in vivo, sistemas de cultura primários derivados das células-tronco adultas residentes do músculo esquelético, as células precursoras miogênicas (PPM), têm se mostrado indispensável para a nossa compreensão do desenvolvimento do músculo esquelético de mamíferos e crescimento. Particularmente entre a taxa basal de vertebrados, no entanto, os dados são limitados descrevendo os mecanismos moleculares que controlam a auto-renovação, a proliferação e diferenciação de PPM. De particular interesse são potenciais mecanismos que estão na base da capacidade de vertebrados basais a sofrer considerável postlarval esquelético myofiber hiperplasia (ou seja, peixes teleósteos) e regeneração completa após perda apêndice (ou seja Urodelos anfíbios). Além disso, o uso de mioblastos em cultura pode ajudar na compreensão da regeneração e da recapitulação do programa miogénica e as diferenças entre eles. Paraeste fim, que descrevem em pormenor um protocolo robusto e eficiente (e variações neles) para isolar e manter PPM e sua descendência, mioblastos e de miotubos imaturas, em cultura celular, como uma plataforma para a compreensão da evolução do programa miogénica, começando com o mais vertebrados basais. Capitalizando sobre o status organismo modelo do peixe-zebra (Danio rerio), relatamos a aplicação deste protocolo a pequenos peixes do clado ciprinídeo Danioninae. Em paralelo, este protocolo pode ser utilizado para realizar uma abordagem comparativa mais ampla, isolando PPM do axolotl mexicano (Ambystomamexicanum) e até mesmo roedores de laboratório. Este protocolo é agora amplamente utilizados no estudo myogenesis em várias espécies de peixes, incluindo a truta arco-íris, salmão e besugo 1-4.

Vinte e quatro horas após a sementeira, as células precursoras miogénicos (PPM) deve ser visível ligado ao substrato de laminina (ver as figuras 1a e 1d). Após a sementeira, as células (PPM) adoptar uma forma fusiforme, indicativo desse tipo de células (Figura 1) e são MyoD1 + (Figura 2). Na espécie Danio, PPM parecem ser mais compacto, com processos bipolares menores do que os PPM de espécie Oncorhynchus e Salmo. No entanto, ...

A cultura in vitro sistemas provaram indispensável para a nossa compreensão de myogenesis vertebrados. No entanto, ainda há muito a ser aprendido sobre o desenvolvimento do músculo esquelético não Mamífero e crescimento, particularmente na taxa basal. De uma forma eficiente e robusta para isolar as células estaminais de adultos deste tecido, as células precursoras miogénicos (PPM), e manter a sua auto-renovação, a proliferação e diferenciação de uma configuração de cultura primária permite a identificação de mecanismos reguladores conservadas e divergentes ao longo as linhagens de vertebrados.

Preparação de Primário Miogênica de Células Precursoras / Culturas de mioblastos de Vertebrados basais Linhagens

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

O objetivo geral deste procedimento é cultivar células precursoras miogênicas de teleósteos para que realizem miogênese in vitro. Isso é realizado primeiramente pela dissecação do músculo epaxial do organismo. O segundo passo consiste na dissociação mecânica do tecido isolado.Em seguida, o tecido é dissociado enzimaticamente para dispersar as células desejadas. O passo final é semear as células precursoras miogênicas isoladas em um substrato de Laminina. Em última instância, in vitro.A miogênese é utilizada para demonstrar os efeitos de diversos tratamentos sobre alterações na regulação e expressão gênica, expressão proteica e mudanças no fenótipo celular. Este vídeo demonstrará como estabelecer um sistema de cultura primária a partir de células precursoras miogênicas de teleósteos. A demonstração visual desta técnica é essencial, pois algumas das etapas de dissociação podem ser difíceis de aprender.A dissociação adequada e correta é essencial para isolar um pellet celular adequado para cultivo posterior. Para começar, prepare todos os meios e soluções necessários para o procedimento. Em seguida, reúna os itens adicionais necessários para o isolamento do tecido.Esterilização em autoclave previamente, quando necessário. Certifique-se de preparar materiais adicionais para cada pessoa que auxiliar no processo de dissecação. Outros itens que devem estar à mão incluem etanol a 70%, uma balança estéril, tubos cónicos de 50 mililitros e gelo para cada cinco gramas de tecido a ser dissecado.Aliquotar 25 mililitros de meio de isolamento em um tubo cônico estéril de 50 mililitros. Após pesar e registrar o número da massa, coloque os tubos em gelo. Quando pronto, retire um peixe para ser usado na dissecação do tecido e mergulhe em etanol 70% por 30 segundos antes de colocá-lo sobre papel de autoclave repelente à água diretamente atrás do erla, utilize uma lâmina de bisturi para fazer uma incisão superficial e rasa, segure a pele na incisão e puxe em direção à cauda para remover as escamas e a pele.Em seguida, excise o músculo branco glicolítico rápido do peixe de ambos os lados, evitando o músculo vermelho oxidativo lento localizado próximo à linha lateral. Coloque o músculo no meio de isolamento e descarte o restante do peixe.Continue a coletar tecido até obter uma quantidade suficiente de músculo durante a dissecação; certifique-se de manter o tecido muscular coletado em gelo para preservar a viabilidade celular. Para iniciar, despeje um tubo de tecido muscular em uma placa de Petri de vidro. Utilize dois bisturis em movimento de vaivém para picar o tecido até que a suspensão tecidual possa ser facilmente removida.Com uma pipeta de 25 mililitros, coloque novamente a suspensão tecidual no tubo original. Repita esses passos até que todo o tecido tenha sido dissociado mecanicamente. Quando todo o tecido for processado, centrifugue por cinco minutos, descarte o sobrenadante e lave o tecido com meio fresco antes de uma nova rodada de centrifugação.Após lavagem completa, ressuspenda o tecido e incube com a solução de colagenase por 60 minutos a 18 graus Celsius com agitação suave. Ao final da incubação, centrifugue os tubos para obter o pellet celular. Após duas lavagens, ressuspenda o tecido no meio de lavagem.Em seguida, triture o homogenato tecidual até que ele passe com relativa facilidade para dentro e para fora de uma pipeta de 10 mililitros. Repita este processo com uma pipeta de cinco mililitros e, em seguida, com uma cânula metálica de calibre 16 acoplada a uma seringa. Após homogeneização completa, centrifugue o tecido para formar um pellet e remova o sobrenadante.Re-suspenda o tecido em triplicata no meio de dissociação e incube por 20 minutos a 18 graus Celsius. Em seguida, coloque os tubos na centrífuga para uma breve centrifugação. Decante o sobrenadante em quatro volumes iguais de isolamento.O meio deve ser armazenado a quatro graus Celsius no pellet restante. Repita as etapas de centrifugação e dissociação recém-demonstradas e combine o sobrenadante resultante com o anteriormente coletado.Distribua a mistura final em tubos cónicos de 50 mililitros e centrifugue. Após a centrifugação, remova o sobrenadante tendo o cuidado de não perturbar a célula. Com uma pipeta, adicione dois mililitros de meio completo a cada tubo.Para dissolver, combine as células ressuspendidas em um único tubo cônico de 50 mililitros. Enxágue cada tubo com um mililitro de meio completo. Adicione o enxágue ao pool de células ressuspendidas.Triture o tecido com uma cânula metálica e seringa de cinco a dez vezes. Após filtrar a suspensão celular, adicione uma quantidade suficiente de meio completo para completar 50 mililitros e centrifugue. Recupere as células, remova o sobrenadante e adicione cinco mililitros de meio completo.Uma vez ressuspensos, retire uma pequena amostra para determinar o número de células viáveis, utilizando um hemocitômetro. Remova a solução de laminina de placas tratadas com poli-L-lisina.Após diluir as células até a concentração necessária, plaque-as nas placas preparadas e feche-as. Coloque as placas fechadas em uma incubadora refrigerada ajustada na temperatura apropriada. Vinte e quatro horas após a semeadura, as células precursoras miogênicas ou MPCs devem estar visivelmente aderidas ao substrato de laminina, enquanto inicialmente parecem mais compactas.MPCs de peixe-zebra adotam morfologias semelhantes às de truta-arco-íris. Ao longo de quatro dias de cultivo, deve ocorrer a formação de tubos miotubulares entre seis e nove dias de cultura. Em cultura, demonstra-se que MPCs e mioblastos expressam myo D um.À medida que os mioblastos se diferenciam em tubos miofibrilares, eles passam a expressar miogenina. Esses dados mostram a proliferação celular durante o cultivo, utilizando a incorporação de BRDU. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar e cultivar.Células precursoras miogênicas de diversas espécies de peixes após seu desenvolvimento inicial em células Monets. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores da biologia muscular explorarem novas frentes na biologia muscular e em outros organismos teliósteos como os danios, bem como em outros anfíbios como os Axel.Lots.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

O micro-dissecados técnica de explantes é um método robusto e confiável para isolar proliferativa das células do músculo esquelético juvenil, adulto ou músculos embrionárias como fonte de células-tronco do músculo esquelético. Excepcionalmente, estas células têm sido clonal para produzir derivados do músculo esquelético linhas de células-tronco usado para in vivo o transplante.

Adultas e embrionárias Cultura Microexplant Músculo Esquelético e isolamento de células-tronco musculares

Tecido muscular de engenharia tem um grande potencial na medicina regenerativa, como modelo de doença e também como uma fonte alternativa para a carne. Aqui descreve-se a engenharia de uma construção de músculo, neste caso, a partir de células progenitoras, mioblastos de rato e a estimulação por pulsos eléctricos.

Os tecidos músculo esquelético de engenharia a partir de células progenitoras mioblastos murinos e Aplicação da estimulação elétrica

O isolamento e cultura de uma população pura de células satélites quiescentes, uma população de células estaminais musculares, é essencial para a compreensão da haste músculo biologia celular e regeneração, bem como o transplante de células estaminais para terapias em distrofia muscular e outras doenças degenerativas.

Isolamento, cultura e transplante de células musculares satélite

Este protocolo descreve técnicas para isolamento de células vivas e cultura primária de linhagens celulares miogênicas e de fibroblastos do tecido muscular ou cutâneo.  Uma técnica para a imortalização dessas linhagens celulares também é descrita.  Juntos, esses protocolos fornecem uma ferramenta confiável para gerar e preservar células derivadas de pacientes para aplicações a jusante.

Isolamento e Imortalidade de linhas celulares derivadas do paciente a partir de biópsia muscular para a doença Modeling

Aqui, descrevemos as configurações para monitorar em paralelo a bioluminescência circadiana e a atividade secretora das células das ilhotas humanas e miotubos primários. Para isso, empregamos a entrega do gene lentiviral de um repórter de relógio central de luciferase, seguido de sincronização in vitro e coleta de meio de saída por perifusão celular contínua.

Medição paralela da expressão do gene relógio circadiano e hormonal secreção em culturas de células primárias humanas

Este protocolo descreve um método robusto, simples e reprodutível de isolamento e cultivo de células progenitoras a partir de mioblastos de músculo esquelético de adultos e idosos. Os músculos usados ​​aqui incluem músculos do pé e da perna. Esta abordagem permite o isolamento de uma população enriquecida de mioblastos primários para estudos funcionais.

Preparação e cultivo de células precursoras Miogênica / mioblastos primárias de músculo esquelético de Adulto e Idoso Humanos

Aqui, descrevemos uma metodologia para obter uma população pura de mioblastos humanos a partir do tecido muscular adulto. Essas células são usadas para estudar a diferenciação do músculo esquelético in vitro e, em particular, para estudar proteínas envolvidas na sinalização de Ca 2+ .

Isolamento de mioblastos humanos, avaliação da diferenciação miogênica e medição de entrada de cálcio armazenada

Diferenciação de músculo esquelético é um processo altamente dinâmico, que particularmente se baseia no posicionamento nuclear. Aqui, descrevemos um método para controlar movimentos de núcleos por imagens de células vivas durante a formação de diferenciação e myotube myoblast e executar uma caracterização quantitativa da dinâmica de núcleos extraindo informações de rastreamento automático.

Explorando a imagem ao vivo aos núcleos de pista durante a diferenciação de Myoblast e fusão

Os mioblastos estão proliferando células precursoras que se diferenciam para formar miotubos polinucleados e, eventualmente, miofibras musculares esqueléticas. Aqui, nós apresentamos um protocolo para a isolação e a cultura eficientes de mioblastos preliminares dos músculos esqueletais do rato adulto novo. O método permite estudos moleculares, genéticos e metabólicos de células musculares na cultura.

Isolamento e diferenciação de Mioblasts primários de explantes do músculo esquelético do rato

O músculo esquelético compreende vários tipos celulares, incluindo células-tronco residentes, cada uma com uma contribuição especial para a homeostase e regeneração muscular. Aqui, a cultura 2D de células-tronco musculares e o nicho de células musculares em um ambiente ex vivo que preserva muitas das características fisiológicas, in vivo e ambientais são descritas.

Cultura não fracionada em massa de músculo esquelético de camundongo para recapitular nicho e quiescência de células-tronco

Esse protocolo fornece um método padronizado para isolar e enriquecer mioblastos primários do músculo esquelético de camundongos adultos e neonatos por meio de dissociação tecidual, filtração sequencial, pré-placagem e condições definidas de cultura, possibilitando o estabelecimento e manutenção de culturas de mioblastas derivadas de células satélite para aplicações experimentais posteriores.

Isolamento de Células Satélites do Músculo Esquelético para Estudos de Miogênese In Vitro

Aprenda a preparar culturas primárias de células precursoras miogênicas de teleósteos para estudar miogênese in vitro. Este método envolve dissecação, dissociação mecânica e enzimática do tecido muscular epaxial com plaqueamento em substrato de Laminina.

Preparação de Primário Miogênica de Células Precursoras / Culturas de mioblastos de Vertebrados basais Linhagens

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