Usando um α-Bungarotoxina Binding Tag Site para Estudar GABA um receptor de membrana Localização e Tráfico

O objetivo geral deste procedimento é medir a localização na superfície e a endocitose do receptor gabaa em neurônios do hipocampo. Isso é realizado primeiramente transfectando neurônios do hipocampo com a subunidade do receptor gabaa marcada e permitindo que os neurônios cultivados se desenvolvam na incubadora. O segundo passo é rotular os receptores gabaa da superfície com alfa bungalow toin conjugado ao corante fluorescente Alexa die.

Em seguida, os neurônios são incubados por diversos intervalos de tempo para permitir a endocitose dos receptores marcados. O passo final consiste em fixar as amostras nos pontos temporais apropriados e realizar coloração imunológica utilizando anti-GFP para observar o conjunto total de receptores marcados. Por fim, a microscopia confocal é utilizada para demonstrar alterações na localização na superfície e na endocitose dos receptores gabaa marcados, empregando abordagens de imagem fixa ou em tempo real.

Este método pode nos ajudar a responder perguntas fundamentais no campo do tráfego de receptores, como qual o efeito da ligação do ligante sobre as taxas de endocitose e inserção do receptor, e se diferentes ligantes e moduladores podem afetar a reciclagem e degradação do receptor. Embora este método tenha sido usado para estudar canais iônicos ligados e receptores acoplados à proteína G principalmente no contexto do sistema nervoso, ele também pode ser aplicado para estudar a localização dinâmica e o tráfego de outras proteínas de membrana em culturas celulares e células primárias de diversos tecidos. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades por dois motivos.

Primeiro, para criar construtos funcionais, e em segundo lugar, para praticar e adquirir a experiência necessária para processar vários pontos temporais simultaneamente. Para começar, prepare quatro a cinco lamínulas circulares revestidas com policloreto de lisina dentro de cada placa de cultura de tecidos de 3,5 centímetros, conforme descrito no protocolo textual. Em seguida, transfete os neurônios recém-dissociados no dia do cultivo com um a quatro microgramas de DNA do construto preparado em formato maxi por placa.

Os neurônios transfectados sobre lâminas cobertas com politolisina em uma densidade final de aproximadamente 200.000 neurônios por placa de 3,5 centímetros. Substitua o meio de cultura entre quatro e 24 horas após o preparo das culturas neuronais. Em seguida, permita que os neurônios se desenvolvam no incubador até 14 a 17 dias in vitro ou até o estágio desejado para realizar o ensaio de endocitose.

Primeiro, ajuste um equipamento de aquecimento e refrigeração de bancada a 16 graus Celsius. Resfrie os agregados extracelulares, solução salina tamponada ou HBS a 16 graus Celsius em banho-maria. Transfira as placas de neurônios para a placa de alumínio a 16 graus Celsius e resfrie por cinco minutos.

Remova o meio e substitua por um mililitro de HBS a 16 graus Celsius com 150 micromolares de duas Bo Rine por dois minutos. Em seguida, remova o meio para um recipiente de resíduos rotulado e substitua por um mililitro de HBS a 16 graus Celsius com duas bo querina mais toxina alfa bungalow. Incubar Alexa 5 9 4 a 16 graus Celsius por 15 minutos.

Após a incubação, transfira o meio para um recipiente de resíduos identificado e lave as placas três vezes com dois mililitros de HBS a 16 graus Celsius para experimentos de séries temporais de imagem em tempo real seguindo a endocitose de receptores, utilizando uma placa de cultura de 3,5 centímetros com fundo de vidro. Transfira a placa para uma platina aquecida no microscópio e inicie a aquisição de imagens com um microscópio confocal ou turf. Prepare para lâminas cobertas fixadas.

Transfira as lamínulas do tempo zero para uma placa com paraformaldeído a 4% e sacarose a 4% à temperatura ambiente por 20 minutos para os demais pontos temporais. Substitua a HBS por meio condicionado e equilibrado a 37 graus Celsius e retorne à incubadora para endocitose a 37 graus Celsius nos pontos temporais necessários. Retire as placas da incubadora e lave rapidamente duas vezes com dois mililitros de solução salina tamponada com fosfato de delcos (DPBS) à temperatura ambiente.

Em seguida, fixe o espécime em paraformaldeído 4%, sacarose 4% por 20 minutos. Após a fixação de 20 minutos, remova o paraformaldeído 4%, sacarose 4% para o recipiente de resíduos e lave as lâminas duas vezes com dois mililitros de DPBS à temperatura ambiente. Em seguida, incube as lamínulas à temperatura ambiente por 10 minutos.

Uma solução bloqueadora de imunofluorescência contendo 0,2% de Triton X-100 para permeabilizar os neurônios e permitir a imunomarcação anti-GFP do pool intracelular de receptores e/ou a marcação de outras proteínas de interesse. Em seguida, remova a solução bloqueadora permeabilizante e incube as lamínulas em solução bloqueadora de imunofluorescência sem Triton X-100 por 20 a 30 minutos. Realize a incubação com o anticorpo primário das lamínulas no bloqueador por várias horas à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius após a incubação.

Lave as lamínulas mergulhando-as em DPBS durante cinco minutos, num total de três lavagens. Em seguida, incube as lamínulas com anticorpos secundários em solução bloqueadora por uma hora à temperatura ambiente após uma hora. Lave as lamínulas três vezes com DPBS como antes.

Em seguida, monte cada lamínula removendo o líquido em excesso do verso da lamínula com papel absorvente de laboratório e, então, invertendo a lamínula sobre quatro microlitros de meio de montagem em uma lâmina de vidro. Realize a aquisição de imagens por microscopia confocal sem conhecimento da condição experimental, utilizando um objetivo de imersão em óleo de 60 x e abertura numérica 1.49.

Usando as mesmas configurações de aquisição de imagem, adquira imagens de uma única seção Z com o corpo celular neuronal e vários processos dendríticos em foco para quantificar a toxina alfa-bungarotoxina, o sinal fluorescente Alexa e a imunomarcação de GFP ao longo de 20 mícrons de três a quatro dendritos proximais por neurônio, utilizando o mesmo limiar para análise de todos os dados de endocitose. Analise os dados de 10 a 12 neurônios para cada ponto temporal. Repita o experimento com várias culturas neuronais independentes.

Os axónios GABAérgicos estabelecem contactos inibitórios nos dendrites dos neurónios piramidais. Os terminais pré-sinápticos inibitórios são identificados pelo transportador vesicular de aminoácidos inibitórios que carrega GABA e glicina para dentro das vesículas sinápticas. Os recetores GABA a estão estreitamente opostos aos locais de libertação do neurotransmissor, ancorados pelo suporte pós-sináptico inibitório proteína gein. Aqui apresentam-se neurónios expressantes de alfa dois phg F-P-B-B-S com recetores GABAa na superfície marcados com toxina bungalow Alexa 5 9 4, seguido de imunomarcação para a população total de recetores com anticorpo anti GFP mostrado em verde, e com a proteína gein do suporte pós-sináptico inibitório ou com o transportador vesicular de aminoácidos inibitórios.

Aqui é mostrada a endocitose do receptor GABA A contendo alfa dois e neurônios do hipocampo aos 15 dias in vitro com toxina alfa bungaroto. As medições de fluorescência de processos dendríticos individuais, conforme mostrado nos painéis, são normalizadas ao nível de expressão do construto por meio dos anticorpos anti-GFP. A comparação final das colorações entre os pontos de tempo é feita pela normalização em relação à medição no tempo igual a zero.

A quantificação da internalização de receptores ao longo de um período de 60 minutos, a partir das alterações do sinal fluorescente ao longo do tempo, foi melhor descrita por uma exponencial simples. Uma abordagem alternativa é acompanhar a endocitose do receptor em um único neurônio por meio de microscopia confocal com imagens sequenciais em tempo real. A fluorescência pontuada e sobreposta do receptor GABA A marcado com P-H-G-F-P e dos receptores marcados com toxina alfa bungalow é visível no início do experimento; ao longo do tempo, o sinal dos receptores GABA A marcados com toxina alfa bungalow diminui à medida que os receptores são endocitados.

Embora o sinal P-H-G-F-P permaneça alto devido à inserção de novos receptores, a diminuição mínima do sinal P-H-G-F-P é causada por alterações na distribuição dos receptores na superfície celular e por fotobranqueamento após este procedimento. Outros métodos, como ensaios de inserção de toxina bungaló, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como as taxas de inserção de receptores com diferentes tratamentos. Esta técnica permite avaliar como a atividade celular, domínios proteicos específicos, agonistas e outros moduladores podem modificar a renovação de receptores em neurônios vivos, outras células e tecidos.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como usar toxina alfa-bungarotoxina conjugada a corantes Alexa em combinação com técnicas imunofluorescentes padrão para quantificar a localização de receptores na superfície de neurônios do hipocampo.