Usando um α-Bungarotoxina Binding Tag Site para Estudar GABA um receptor de membrana Localização e Tráfico

O objetivo geral deste procedimento é medir a localização da superfície do receptor gabaa e a endocitose nos neurônios do hipocampo. Isso é feito primeiro cruzando os neurônios do hipocampo com a subunidade do receptor gabaa marcada e permitindo que os neurônios cultivados se desenvolvam na incubadora. O segundo passo é rotular os receptores de gabaa de superfície com a matriz Alexa fluorescente acoplada a alfa bungalow.

Em seguida, os neurônios são incubados por vários pontos de tempo para permitir que os receptores marcados sejam endocitos. A etapa final é fixar as amostras nos pontos de tempo apropriados e realizar a imunocoloração usando anti-GFP para observar o pool total de receptores marcados. Em última análise, a microscopia confocal é usada para mostrar alterações na localização da superfície e endocitose dos receptores gabaa marcados usando abordagens de imagem fixas ou ao vivo.

Este método pode nos ajudar a responder a questões-chave no campo do tráfego de receptores, como o efeito que a ligação do ligante pode ter na endocitose do receptor e nas taxas de inserção, e se diferentes ligantes e moduladores podem afetar a reciclagem e degradação do receptor. Embora este método tenha sido usado para estudar canais iônicos ligados e receptores acoplados à proteína G principalmente no contexto do sistema nervoso, ele também pode ser aplicado para estudar a localização dinâmica e o tráfego de outras proteínas de membrana em cultura de células e células primárias de diversos tecidos. Geralmente, os indivíduos novos nesse método terão dificuldades por dois motivos.

Primeiro, para criar construtos funcionais e, segundo, prática e experiências necessárias para processar vários pontos de tempo simultaneamente. Para começar, prepare quatro a cinco lamínulas redondas de vidro revestidas com poli de lisina dentro de cada placa de cultura de tecidos de 3,5 centímetros, conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, transfecte neurônios recém-dissociados no dia da cultura com um a quatro microgramas de placa de DNA de construção maxi preparada.

Os neurônios transfectados na cobertura revestida com poli de licina têm uma densidade final de aproximadamente 200.000 neurônios por prato de 3,5 centímetros. Substitua o meio quatro a 24 horas após a preparação das culturas neuronais. Em seguida, permita que os neurônios se desenvolvam na incubadora até 14 a 17 dias in vitro ou o estágio desejado para realizar o ensaio de endocitose.

Primeiro, defina um dispositivo de aquecimento de resfriamento de bancada para 16 graus Celsius. Resfrie pilhas extracelulares, solução salina tamponada ou HBS a 16 graus Celsius em banho-maria. Transfira as placas de neurônios para a placa de alumínio a 16 graus Celsius e deixe esfriar por cinco minutos.

Remova o meio e substitua por um mililitro de 16 graus Celsius HBS mais 150 Micromolar dois Bo Rine por dois minutos. Em seguida, remova o meio para um recipiente de lixo rotulado e substitua-o por um mililitro de HBS a 16 graus Celsius mais dois bo kerine mais toxina alfa bangalô. Alexa 5 9 4 incubando a 16 graus Celsius por 15 minutos.

Após a incubação, transfira o meio para um recipiente de resíduos rotulado e lave a louça três vezes com dois mililitros de HBS a 16 graus Celsius para experimentos de séries temporais de imagens ao vivo após endocitose do receptor usando uma placa de cultura de 3,5 centímetros com fundo de vidro. Transfira o prato para um estágio aquecido no microscópio e comece a imagem com um microscópio confocal ou de grama. Configure para lamínulas fixas.

Transferência T é igual a zero ponto de tempo cobrir deslizes em um prato de temperatura ambiente 4% para formaldeído, 4% sacarose por 20 minutos para outros pontos de tempo. Substitua HBS por meio condicionado equilibrado de 37 graus Celsius e retorne à incubadora para endocitose a 37 graus Celsius nos pontos de tempo necessários. Retire a louça da incubadora e lave rapidamente duas vezes com dois mililitros de temperatura ambiente, fosfato delcos, solução salina tamponada ou DPBS.

Em seguida, fixe a amostra em aldeído paraforme a 4%, sacarose a 4% por 20 minutos. Após uma fixação de 20 minutos, remova o aldeído paraforme 4%, a sacarose 4% do recipiente de resíduos e lave a louça duas vezes com dois mililitros de DPBS em temperatura ambiente. Em seguida, incube as lamínulas em temperatura ambiente por 10 minutos.

Uma solução de bloqueio de imunofluorescência contendo 0,2% Triton X 100 para permear os neurônios e permitir a coloração imunológica anti-GFP do pool de receptores intracelulares e/ou a marcação de outras proteínas de interesse. Em seguida, remova a solução em bloco permeável e incube as lamínulas em solução de bloco de imunofluorescência sem Triton X 100 por 20 a 30 minutos. Realize incubações primárias de anticorpos de lamínulas em bloco por várias horas em temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius após a incubação.

Lave as lamínulas mergulhando-as em DPBS por cinco minutos para um total de três lavagens. Em seguida, incubar as lamínulas com anticorpos secundários em solução em bloco durante uma hora à temperatura ambiente após uma hora. Lave as lamínulas três vezes com DPBS como antes.

Em seguida, monte cada lamínula removendo o excesso de líquido da parte de trás da lamínula com tecido de laboratório e, em seguida, invertendo a lamínula em quatro microlitros de meio de montagem em uma lâmina de vidro. Realize a aquisição de imagens com microscopia confocal cega para a condição experimental usando uma abertura numérica de óleo de 60x. 1.49 objetivo de imersão.

Usando as mesmas configurações de aquisição de imagem, adquira imagens de seção Z única com o corpo celular neuronal e vários processos dendríticos em foco para quantificar a toxina alfa do bangalô, o sinal fluorescente Alexa e a imunocoloração GFP ao longo de 20 mícrons de três a quatro dendritos proximais por neurônio usando o mesmo limite para análise de todos os dados de endocitose. Analise dados de 10 a 12 neurônios para cada ponto de tempo. Repetindo o experimento com várias culturas neuronais independentes.

Os axônios GABAérgicos fazem contatos inibitórios nos dendritos dos neurônios piramidais. Os terminais inibitórios pré-sinápticos são identificados pelo transportador de aminoácidos inibitório vesicular que carrega GABA e glicina nas vesículas sinápticas. Os receptores GABA a são intimamente opostos aos locais de liberação de neurotransmissores amarrados pelo andaime inibitório pós-sináptico A proteína gein mostrada aqui são neurônios que expressam alfa dois phg F-P-B-B-S com receptores gabaa de superfície marcados com toxina Alexa 5 9 4 bungalow seguida de imunocoloração para população total de receptores com anticorpo anti GFP mostrado em verde, e a proteína de andaime inibitório pós-sináptico gein ou o transportador de aminoácidos inibitório vesicular.

Aqui a endocitose de alfa dois contendo receptor GABA A e neurônios do hipocampo em 15 dias in vitro é mostrada toxina alfa bangalô. Fluorescência As medições de processos dendríticos individuais, conforme mostrado nos painéis, são normalizadas para o nível de expressão da construção por meio dos anticorpos GFP. A comparação final da coloração dos pontos de tempo é feita pela normalização para a medição T igual a zero.

A quantificação da internalização de receptores ao longo de um período de 60 minutos a partir de mudanças de sinal fluorescente ao longo do tempo foi melhor descrita por um único exponencial. Uma abordagem alternativa é acompanhar a endocitose do receptor em um único neurônio por microscopia confocal de lapso de tempo de imagem ao vivo. A fluorescência pontilhada e sobreposta do receptor GABA A marcado com P-H-G-F-P e dos receptores marcados com toxina alfa bungalow de superfície é visível no início do experimento ao longo do tempo o sinal do receptor GABA A marcado com toxina alfa bungalow diminui à medida que os receptores endocitam.

Embora o sinal de P-H-G-F-P permaneça alto devido à inserção de novos receptores, a diminuição mínima no sinal de P-H-G-F-P é devido a alterações na distribuição do receptor da superfície celular e fotobranqueamento após este procedimento. Outros métodos, como ensaios de inserção de toxina de bangalô, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como taxas de inserção de receptores com diferentes tratamentos. Essa técnica permite avaliar como a atividade celular, domínios proteicos específicos, agonistas e outros moduladores podem modificar a renovação do receptor em neurônios vivos, outras células e tecidos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como usar corantes Alexa acoplados à toxina alfa em combinação com técnicas imunofluorescentes padrão para quantificar a localização do receptor de superfície nos neurônios do hipocampo.