Preparação da amostra para microscopia da força atômica de virion único e imagem de fluorescência de super-resolução
January 2nd, 2014
A fixação de virions a uma superfície é um requisito para imagens de virion única por imagens de fluorescência de super resolução ou microscopia de força atômica (AFM). Aqui demonstramos um método de preparação de amostras para adesão controlada de virions a superfícies de vidro adequadas para uso em AFM e imagens de fluorescência de super resolução.
Este procedimento prepara lamínulas de vidro com vírus para uso em microscopia de força atômica e microscopia de super-resolução, como microscopia de localização fotoativada fluorescente. Primeiro, limpe o substrato de vidro e cubra o vidro com uma fina película de polietilenoglicol parcialmente biotinilada enxertada em poli L lisina. Em seguida, trate a superfície com avadon para aumentar a afinidade de ligação do filme biotinilado.
Agora trate a superfície com anticorpos biotinilados específicos para o vírus de interesse. Em seguida, trate a superfície preparada com o anticorpo com o vírus de interesse. Ao contrário do revestimento giratório, essa técnica tem a vantagem de distribuir as variantes ao longo da superfície de forma homogênea.
Para otimizar a microscopia, coloque as lamínulas verticalmente em um rack de lamínulas de Teflon de tamanho apropriado e mergulhe-as em um béquer cheio de sonicato de álcool etílico filtrado por 30 minutos. Em seguida, enxágue extensivamente as lamínulas com água ultrapura. Em seguida, coloque as lamínulas em uma prateleira de Teflon limpa separada e um béquer cheio de um sonicado molar de hidróxido de sódio por 30 minutos e enxágue extensivamente com água ultrapura.
Agora seque as lamínulas enxaguadas sob uma corrente de nitrogênio e transfira-as para uma prateleira de Teflon limpa e seca. Verifique se cada lamínula está limpa de qualquer filme ou partículas visíveis. Imediatamente após a secagem horizontal no fluxo de nitrogênio, coloque uma lamínula em uma placa de Petri estéril no centro da lamínula e pipete a quantidade apropriada de polilisina glicol enxertada biotinilada em PBS.
Coloque outra lamínula limpa sobre o fluido em um método de sanduíche. Certifique-se de que o volume entre as faces ativas das duas lamínulas esteja completamente preenchido com fluido. Cubra a placa de Petri e incube em temperatura ambiente por 45 a 60 minutos.
Em seguida, pegue o sanduíche com uma pinça sem beliscar o excesso de líquido. Agora, usando o polegar e o indicador, aperte o sanduíche leve e horizontalmente. Deslize as lamínulas em direções opostas e separe-as sem tocar nas faces ativas.
Enxágue os dois rostos ativos com 25 mililitros de água ultrapura. Agora seque as lamínulas com um jato de nitrogênio e observe quais faces da lamínula estão ativas em uma placa de Petri estéril. Coloque uma lamínula tratada com a pipeta ativa com a face ativa para cima e uma quantidade adequada de solução de evidência descongelada no meio da face ativa.
Coloque outra lamínula com a face ativa voltada para baixo para colocar o fluido e incube em temperatura ambiente por 25 a 30 minutos. Em seguida, separe as duas lamínulas conforme mostrado anteriormente. Certificando-se de não tocar nos rostos ativos.
Agora enxágue as duas faces ativas com 25 mililitros de água ultrapura e seque as lamínulas com um jato de nitrogênio. É importante lembrar quais faces da lamínula estão ativas. Para referência futura, coloque imediatamente uma lamínula de cobertura ativa ávida e tratada voltada para cima em uma placa de Petri estéril, pipete uma quantidade apropriada de anticorpo biotinilado descongelado no meio da face ativa.
Coloque outra lamínula com a face ativa voltada para baixo sobre o fluido em um método sanduíche. Em seguida, incube em temperatura ambiente por 45 a 60 minutos Depois de separar as duas lamínulas, enxágue as duas faces ativas com 25 mililitros de PBS. Em seguida, coloque uma lamínula tratada com anticorpos com a face ativa para cima em uma placa de Petri estéril e pipete uma quantidade apropriada de vírus no meio da face ativa.
Agora faça um sanduíche com uma segunda tampa ativa, deslize, cubra e incuba. Agora separe as duas lamínulas. Enxágue os dois rostos ativos com 25 mililitros de PBS e transfira-os para uma grade de Teflon e um copo cheio de PBS.
Use imediatamente as amostras preparadas imediatamente ou armazene a quatro graus Celsius por até três dias. Aqui. Variedades selvagens do vírus da estomatite vesicular foram ancoradas na superfície do vidro e analisadas por microscopia de força atômica. A largura e o comprimento do vírion são de 80 nanômetros por 180 nanômetros, mostrando distorções mínimas do tamanho original do vírion.
Neste experimento, o único vírion foi fotografado por microscopia de localização de fotoativação fluorescente. Usando anticorpos VSVG marcados com Alexis 6 47. A isossuperfície azul demonstra a superfície recuperada do vírion usando microscopia FOM.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar lamínulas de vidro com vírus para uso com microscopia de força atômica ou microscopia de super-resolução. É importante lembrar sempre qual face da lamínula tem a química ativa.
Visão Geral
Este artigo apresenta um método para preparar lâminas de vidro com vírus para uso em microscopia de força atômica (AFM) e imagem de fluorescência de super-resolução. A técnica garante a adesão controlada de viriões, facilitando a obtenção de imagens de alta resolução de estruturas virais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biofísica
- Técnicas de Microscopia
Fundamentos
- A adesão do virião é essencial para técnicas de imagem como AFM e microscopia de super-resolução.
- A adesão controlada melhora a qualidade dos resultados de imagem.
- Métodos anteriores podem não fornecer distribuição uniforme de viriões.
- Este estudo introduz um novo método de preparação de amostra.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para a adesão de viriões a superfícies de vidro.
- Melhorar a qualidade de imagem em AFM e microscopia de super-resolução.
- Demonstrar a eficácia do método usando vírus da estomatite vesicular.
Métodos Utilizados
- Limpeza e revestimento de lâminas de vidro com polietileno glicol biotinilado.
- Tratamento de superfícies com avidina e anticorpos biotinilados específicos para o vírus.
- Sanduíche de lâminas para facilitar a distribuição uniforme do fluido.
- Uso de técnicas de sonicação e enxágue para garantir limpeza.
Principais Resultados
- Viriões foram bem ancorados em superfícies de vidro para obtenção de imagens.
- Viriões isolados foram obtidos com mínima distorção usando microscopia de fluorescência.
- O método demonstrou distribuição eficaz de viriões pela superfície.
- Os resultados confirmaram a viabilidade do método de preparação para obtenção de imagens de alta resolução.
Conclusões
- O método desenvolvido fornece uma abordagem confiável para adesão de viriões.
- Esta técnica melhora a qualidade da imagem em aplicações de microscopia.
- Estudos futuros podem se basear neste método para várias aplicações de imagem viral.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This method enables controlled, homogeneous virion adhesion to glass surfaces, supporting high-resolution imaging for mechanistic studies of viral structure and host interactions. By ensuring reproducible sample preparation, it reduces variability in downstream biophysical assays, improving data reliability for target validation and lead optimization efforts. The technique is applicable to enveloped viruses relevant to antiviral discovery programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct visualization of virion morphology and surface protein distribution to inform target accessibility and epitope exposure.
- Operational Value: Provides a standardized platform for comparing wild-type and mutant virions under identical imaging conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates quantitative assessment of antibody or ligand binding to immobilized virions via fluorescence readouts.
- Operational Value: Supports assay uniformity by minimizing virion clustering and orientation bias across the imaging surface.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Allows correlation of structural changes in virions with functional phenotypes such as infectivity or neutralization resistance.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of viral variants in preclinical models using consistent sample preparation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where structural and biophysical characterization informs target selection and lead compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding viral entry mechanisms and antibody-mediated neutralization through direct imaging.
- Screening: Enables reproducible preparation of virion samples for high-content imaging-based screening campaigns.
- Analytics: Generates quantitative morphometric data (e.g., virion dimensions) and fluorescence intensity measurements for comparative analysis.
- Translational Research: Connects in vitro virion behavior to preclinical efficacy by preserving native structural features during imaging.
- Enterprise Reuse: Represents a adaptable surface chemistry platform applicable to multiple viral targets across discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in structural biology assays by minimizing preparation-induced artifacts.
- Operational Value: Enhances reproducibility across laboratories and imaging modalities through standardized surface functionalization.
- Strategic Value: Reduces failed imaging runs due to poor virion adhesion, conserving instrument time and sample resources.
- Portfolio Impact: Enables faster go/no-go decisions in antiviral projects by providing early structural liability assessment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface chemistry and fluorescence microscopy techniques.
- Depends on access to AFM and super-resolution imaging infrastructure.
- Necessitates strict adherence to active face orientation during multi-step assembly.
- Adaptation to non-enveloped viruses may require modification of anchoring chemistry.
- Storage limitations (up to 3 days at 4°C) necessitate same-week experimental planning.
