Name: Coloração histoquímica de Arabidopsis thaliana Celular Secundária parede Elements (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-13T23:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Aprenda técnicas de coloração histoquímica para visualizar elementos da parede celular secundária em Arabidopsis thaliana. Este método permite analisar a composição de tecidos lignificados em caules de plantas.

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Somos gratos a Sabin Russell para a assistência edição. Este trabalho fez parte do Instituto Joint BioEnergy DOE (http://www.jbei.org), apoiado pelo Departamento de Energia dos EUA, Escritório de Ciência, Instituto de Pesquisa Ambiental e Biológica, por meio do contrato DE-AC02-05CH11231 entre Lawrence Berkeley Laboratório Nacional e do Departamento de Energia dos EUA.

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</ol>

Os autores não têm conflitos financeiros a divulgar.

Secções tronco de A. thaliana são amplamente usados ​​para o estudo da organização das células da parede celular secundária e para examinar qualitativamente as diferenças entre o tipo selvagem e plantas transgénicas. As técnicas comumente utilizadas para a secção dos espécimes são corte manual direta; ou quando as amostras são incorporados em agarose ou fixador, o seccionamento pode ser feito com um vibratome ou micrótomo. Em contraste com o lado de corte, os dois últimos permitem reduzir o risco de produzir di...

A parede celular da planta tem uma infinidade de informações dentro de seus vários componentes: lignina, celulose, hemicelulose (xilana, glucuronoxylan, xiloglucano, arabinoxilano, ligação mista glucana, ou glucomanana) e pectina. Técnicas histológicas fornecer dicas visuais importantes no estudo das diferenças dentro das paredes celulares secundárias a nível da organização e celulares. Várias técnicas histológicas foram desenvolvidos e podem ser encontrados na literatura, mas estas técnicas pode ser um desafio para principiantes e demorada porque os protocolos muito detalhado com instruções visuais simples são raramente, se alguma vez disponível. O objetivo deste estudo é fornecer orientações simples para técnicas de coloração histológicas para obter imagens de alta qualidade. Seccionamento do tecido do tronco é o primeiro passo para a visualização de células e paredes celulares de formas. Embora seções cortados à mão são baratos e levam menos tempo para se preparar, o uso de um vibratome oferece consistência eproduz imagens de alta qualidade. Usando um vibratome permite produzir melhor qualidade de dados, gerando até secções com a mesma espessura, o que ajuda a produzir imagens nítidas e reduz significativamente o risco de produzir diferenças entre amostras imprecisos que seria simplesmente causada por uma preparação de amostra mau. Usando resinas para fixar espécimes frescos pode ser um desafio para iniciantes e ainda pode ser demorado, mesmo para especialistas, quando uma análise precisa ser feito rapidamente. Além disso, torna-se impossível de medir qualquer actividade biológica com a amostra quando tiver sido incorporado numa resina. Uma técnica simples que emprega um molde de agarose e caseiro é útil para a incorporação de tecidos do caule, e que também pode ser utilizado em outras aplicações que requerem uma dissecção de tecidos moles. Em comparação com a incorporação de espécimes em resina, este método tem a vantagem de manter os tecidos vivos e reduzindo a manipulação da amostra. Seccionamento dos tecidos por meio de um vibratome é altamente preciso e gera homogeneaous secções, que, dependendo do objectivo do estudo, poderá, então, ser usados ​​com várias técnicas de coloração diferentes. Os métodos mais simples de visualizar lignina e outros compostos aromáticos empregar ultravioleta (UV). Excitação de moléculas aromáticas à base de luz UV é uma técnica antiga, mas ainda é uma das abordagens mais rápido para visualização de lignina. No entanto, a visualização UV na verdade não é ideal para a detecção de lignina porque a luz UV vão animar outros compostos aromáticos. A lignina é composta basicamente de três blocos de construção, as monolignóis (álcoois hidroxicinamil: álcool coniferil, álcool sinapyl e álcool p-cumaril) 1-3. Floroglucinol mancha pode proporcionar pistas para a extensão da cinnamaldehydes presentes no xilema, fibras e tecidos da traqueia 4. Floroglucinol é um bom indicador de cinnamaldehydes gerais e pode diferenciar entre cinnamaldehydes e outros aromáticos. Os monómeros de álcool sinapyl pode ser detectadae diferenciando-se pelo uso de Maule mancha. Azul de toluidina O é um corante policromático e, portanto, tem a capacidade de manchar os diferentes elementos da parede celular em diferentes cores 5,6. O principal uso do azul de toluidina O é detectar pectina e lignina 5,6. A vantagem do uso de azul de toluidina O é que muitos elementos da parede da célula pode ser visualizado num único passo. Ambos calcoflúor branco e vermelho congo são fáceis de trabalhar e pode ser usado para visualizar celulose. Calcofluor manchas brancas celulose, calose, e outros β-glucanas não-substituídos ou substituídos fracamente 6-9, ao passo que congo manchas vermelhas directamente para β-(1 → 4)-glucanos e em particular a celulose 10,11. O objetivo deste estudo é fornecer orientações simples para o uso das técnicas de coloração acima mencionados para obter imagens de alta qualidade a partir de A. thaliana hastes.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>EMD</td><td>MERC2125</td><td>Número CAS: 9012-36-6</td></tr><tr><td>Cloroglucinol</td><td>Sigma</td><td>P 3502</td><td>1,3,5-trihidroxibenzeno [Número CAS: 108-73-6]</td></tr> <tr><td>Ácido clorídrico</td><td>EMD</td><td>HX0603-75</td><td>Número CAS: 7647-01-0</td></tr><tr><td>Hidróxido de amônio</td><td>EMD</td><td>AX1303-6</td><td>Número CAS: 1336-21-6</td></tr><tr><td>Toulidine Blue O</td><td>Sigma</td><td>T3260</td><td>Cloreto de Blutene, Cloreto de Tolônio [Número CAS 92-31-9]&nbsp;</td></tr><tr><td>Permanganato de potássio</td><td>Sigma</td><td>223468</td><td>Número CAS 7722-64-7&nbsp;</td></tr><tr><td>Etanol 190 prova</td><td>KOPTEC</td><td>V1401</td><td>Número CAS: 64-17-5</td></tr><tr><td>Congo Red</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C6277</td><td>3,3'-[[1,1'-bifenil]-4,4'-diilbis(azo)]bis(4-aminonaftaleno 1-sulfonato) [Número CAS 573-58-0]</td></tr><tr><td>Branqueador Fluorescente 28/ Calcofluor White Stain</td><td></td><td>Sigma F3543&nbsp;</td><td>Ácido 4,4'-bis[[4-[bis(2-hidroxietil)amino]-6-anilino-1,3,5-triazina-2-il]amino]estilbeno-2,2'-dissulfônico [Número CAS 4404-43-7]&nbsp;</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>Leica Lâmina vibratória micrótomo VT1000S</td><td>http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/</td></tr> <tr><td>Navalha</td><td>American Safety razor company</td><td>Item # 60-0139-0000&nbsp;</td><td>Lâmina de borda dupla de aço inoxidável (Personna Super)</td></tr><tr><td>Tubos de Microcentrífuga com Tampa de Rosca (2 ml)</td><td>VWR</td><td>16466-044</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Microcentrífuga (0.6 ml)</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-060-C</td><td></td></tr><tr><td>Mitt</td><td>Bel-Art</td><td>380000000</td><td>SCIENCEWARE&nbsp; Protetor de Mão Quente Mitt</td></tr><tr><td>Adesivo de Tecido</td><td>Ted Pella Inc</td><td>10033</td><td>Loja em 4 &deg; C ou 20 & C para armazenamento de 3 meses ou mais</td></tr><tr><td>Microondas</td><td>Panasonic</td><td>NN-SD762S</td><td>PELCO Pro CA 44 Adesivo de tecido instantâneo&nbsp;</td></tr><tr><td>Câmera com chip CCD sem obturador mecânico</td>Câmera colorida de alta velocidade <td>Hamamatsu</td><td>C4742-95</td><td></td></tr><tr><td> &nbsp; &nbsp;</td>Software de câmera <td>RTV</td><td></td> <td>QImaging</td> MicroPublisher 5.0</tr><tr><td></td><td>&nbsp; Molecular Devices</td><td>MetaMorph versão 7.7.0.0</td><td></td></tr><tr><td>Imagining anaylsis&nbsp;</td><td>Adobe&nbsp;</td>Óculos de cobertura micro <td>Photoshop CS4</td><td></td></tr><tr><td>, quadrados, nº 1</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td>22 x 22 mm (7/8 x 7/8") - Os óculos de cobertura são resistentes à corrosão e uniformemente espessos e planos. A espessura nº 1 é de 0,13 a 0,17 mm.</td></tr><tr><td>Micro lâminas foscas, 1 mm</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>75 x 25 mm - 1 mm</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Embalagem Alcan</td><td>BRNDPM998</td><td></td></tr><tr><td>cubo de filtro TX2 Filtro</td><td>Leica</td><td>11513851/11513885</td><td>utilizado para análise de vermelho Congo com uma passagem de banda de 560/40.</td></tr></tbody></table>

coloração histoquímica de<em&gt; arabidopsis thaliana</em&gt; celular secundária parede elements

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana é um organismo modelo comumente usado para entender e manipular vários processos celulares em plantas, e tem sido amplamente utilizado no estudo da formação de paredes celulares secundárias. A deposição da parede celular secundária ocorre após a fixação da parede celular primária, um processo realizado exclusivamente por células especializadas, como as que formam vasos e tecidos fibrosos. A maioria das paredes celulares secundárias é composta de celulose (40-50%), hemicelulose (25-30%) e lignina (20-30%). Várias mutações que afetam a biossíntese da parede celular secundária foram isoladas, e os mutantes correspondentes podem ou não exibir mudanças óbvias na composição bioquímica ou fenótipos visuais, uma vez que essas mutações podem ser mascaradas por respostas compensatórias. Os procedimentos de coloração têm sido historicamente usados para mostrar diferenças em uma base celular. Esses métodos são meios exclusivamente visuais de análise; no entanto, seu papel na análise rápida e crítica é de grande importância. O vermelho Congo e o branco calcofluor são corantes usados para detectar polissacarídeos, enquanto o Mäule e o floroglucinol são comumente usados para determinar diferenças na lignina, e o azul de toluidina O é usado para corar diferencialmente polissacarídeos e lignina. As técnicas aparentemente simples de seccionamento, coloração e imagem podem ser um desafio para iniciantes. Começando com a preparação de amostras usando o modelo de A. thaliana, este estudo detalha os protocolos de uma variedade de metodologias de coloração que podem ser facilmente implementadas para observação da organização celular e tecidual nas paredes celulares secundárias das plantas.

Stem Embedding e Seccionamento: A utilização do molde de plástico caseiro para incorporar os caules em 7% de agarose revelou-se fácil e rapidamente (Figura 1). As duas partes (A e B; Figura 1) do sistema de frasco incorporado torná-lo simples para liberar facilmente a haste incorporado em agarose como a agarose não se ater às partes dos frascos que são inertes, mantendo o sistema limpo. Os frascos podem ser reutilizados várias vezes durante anos. A conveniência de armazenamento a...

A composição da parede celular vegetal varia entre os tipos de tecido e pode incluir lignina, celulose, hemiceluloses e pectina. Várias técnicas de coloração foram desenvolvidas para visualizar as diferenças no nível do tipo de célula. Este artigo é uma compilação de técnicas de coloração da parede celular comumente usadas.

Coloração histoquímica de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Celular Secundária parede Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a coloração histoquímica dos elementos da parede celular secundária ANA de Arabidopsis. Isso é realizado primeiramente embutindo o caule da planta em aros. Em seguida, o caule embutido em aros é desmoldado e transferido para discos de espécime, os quais são então seccionados em cortes transversais de STEM utilizando um vibrátomo.Em seguida, as seções são submetidas a diversos procedimentos de coloração histoquímica. Por fim, a microscopia é utilizada para demonstrar as alterações diferenciais nos elementos da parede celular secundária obtidos pela coloração histoquímica. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre a parede celular, como as alterações nos tecidos parenquimatosos em caules de plantas.Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades porque etapas simples, porém críticas, mencionadas nos protocolos aqui apresentados, não foram documentadas minuciosamente ou apresentadas de maneira simplificada anteriormente. Para começar, prepare um molde caseiro para embutir os caules utilizando frascos plásticos. Primeiro, use uma lâmina de barbear para cortar a parte cônica inferior de um tubo de c

histochemical-staining-arabidopsis-thaliana-secondary-cell-wall

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JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo, descrevemos a técnica de coloração de Wiesner para colorir a lignina presente em células vegetais especializadas. Esta técnica de coloração ajuda a visualizar as paredes celulares lignificadas nos caules de Arabidopsis thaliana e ajuda a quantificar a lignificação nas paredes celulares de diferentes tipos de células.

Coloração de Wiesner para visualização de lignina: uma técnica para corar depósitos de lignina presentes em caules de Arabidopsis thaliana

Neste vídeo, descrevemos a técnica de coloração Maule para coloração de lignina siringil presente nas células vegetais especializadas. Essa técnica de coloração ajuda a caracterizar a distribuição da lignina no xilema e nas fibras interfasciculares.

Coloração Maule para lignina: uma técnica para caracterizar a distribuição de lignina em seções de caule de Arabidopsis thaliana

Neste vídeo, demonstramos o método de coloração com vermelho Congo para visualizar depósitos de celulose em seções de caule de Arabidopsis thaliana.

Coloração com vermelho Congo: uma técnica para visualizar depósitos de celulose em seções de caules de plantas

Neste vídeo, descrevemos um procedimento de coloração para visualizar a deposição de celulose dentro das paredes celulares de Arabidopsis thaliana, uma planta dicotiledônea, usando branco de calcofluor, que se liga especificamente a glucanos ligados à β, exibindo fluorescência sob luz UV.

Coloração branca de calcofluor: um método simples para visualização de fluorescência induzida por UV de depósitos de celulose em paredes celulares de seções de caule de plantas dicotiledôneas

Este vídeo demonstra uma técnica de imunocoloração para localizar proteínas arabinogalactâcticas (AGPs) e pectinas em tecidos vegetais. Seções de tecido vegetal fixas e embebidas em resina são coradas com anticorpos primários e secundários fluorescentes específicos para AGP e pectina e um corante fluorescente de ligação à celulose para revelar sua colocalização específica do tecido na parede celular.

Imunolocalização de proteínas e pectinas de arabinogalactana em tecido vegetal

Nós fornecemos aqui um protocolo eficiente e confiável para a imunocoloração, hibridação in situ fluorescente, a coloração do DNA seguido de quantitativo, imagem de alta resolução em Arabidopsis thaliana óvulos inteiros de montagem. Este método foi utilizado com sucesso para analisar as modificações da cromatina e arquitectura nuclear.

Um método eficiente para Quantitativa, Análise de células Único de cromatina Modificação e Arquitetura Nuclear em Todo-mount óvulos em<em&gt; Arabidopsis</em

Neste protocolo, descrevemos técnicas para a adequada dissecção da Arabidopsis flores e siliques, algumas técnicas básicas de compensação e selecionados coloração procedimentos para observações de toda a montagem de estruturas reprodutivas.

Compensação de toda a montagem e coloração de Siliques e órgãos de flor de Arabidopsis

O objetivo deste protocolo é mostrar como carregar o CFDA em diferentes locais das partes inferiores de Arabidopsis. Apresentamos, então, o padrão de distribuição resultante da FC nas brotações.

Shootward movimento de CFDA Tracer carregado no fundo pia tecidos de Arabidopsis

Este protocolo descreve em detalhes como o material vegetal para imunolocalização de proteínas e pectinas arabinogalactanas é fixado, embutido em uma resina acrílica hidrofílica, seccionada e montada em lâminas de vidro. Mostramos que epítopos relacionados à parede celular serão detectados com anticorpos específicos.

Imunolocalização fluorescente de proteínas árabes e pectinas na parede celular de tecidos vegetais

O presente protocolo descreve um método otimizado para a observação histológica de galhas induzidas por Plasmodiophora brassicae. Seções vibratórias de hipocótilos são limpas antes da imagem de fluorescência para estudar o envolvimento de fatores de transcrição e fitohormônios durante a progressão da doença. Este protocolo supera as limitações de incorporação de resina, possibilitando na planta a visualização de proteínas fluorescentes.

Combinando Microscopia de Limpeza e Fluorescência para Visualização de Mudanças na Expressão Gênica e Respostas Fisiológicas a Plasmodiophora brassicae

Este protocolo descreve a preparação de amostras intactas da camada de células do endosperma em sementes de Arabidopsis thaliana . O método requer apenas equipamentos de laboratório comuns, como agulha de injeção e pinça de precisão, e permite imagens fluorescentes de células vivas de alta resolução de células do endosperma em sementes em desenvolvimento e maduras.

Preparação de tecido intacto para análise microscópica da camada de células do endosperma em sementes de Arabidopsis em desenvolvimento e maduras

Aprenda técnicas de coloração histoquímica para visualizar elementos da parede celular secundária em Arabidopsis thaliana. Este método permite analisar a composição de tecidos lignificados em caules de plantas.

Coloração histoquímica de

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