Imagem Limpa Sistemas Biológicos intactas em um nível celular por 3DISCO

O objetivo geral do experimento a seguir é obter imagens de amostras biológicas intactas marcadas com fluorescência sem seccionamento histológico. Isso é obtido por incubação sequencial de tecidos fixos em solventes orgânicos até que uma transparência total seja alcançada. Como um segundo passo.

Os tecidos transparentes são fotografados em 3D usando um microscópio de varredura a laser. Em seguida, os resultados de imagem são analisados e as estruturas neuronais na medula espinhal e no cérebro não seccionados podem ser reconstruídas em 3D a partir das três imagens de discoteca coletadas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência sobre como mapear as conexões neuronais e GAL em todo o cérebro e medula espinhal.

As implicações dessa técnica se estendem à terapia da neurodegeneração, pois agora podemos visualizar a integridade neural em todo o sistema nervoso. Embora esse método possa fornecer informações sobre a organização do sistema nervoso, ele também pode ser aplicado a outros órgãos, como o pulmão ou o tecido tumoral. Uma vez dominada, essa técnica leva apenas algumas horas para pequenos órgãos, como a medula espinhal ou o pulmão, e cerca de um ou dois dias para o cérebro Comece o procedimento adicionando dois a três mililitros de 50% de THF recém-preparado a um frasco de vidro por tecido colhido.

Em seguida, transfira os órgãos fixos para a solução de limpeza e feche bem os frascos. Coloque os frascos em um rotador e cubra-os com papel alumínio, mexendo as amostras pelo tempo apropriado a uma velocidade constante de 30 RPM. Em seguida, remova a solução de limpeza e use um novo PE ou pipeta para suspender o tecido na próxima solução.

Conforme indicado na tabela durante a etapa final de limpeza, mantenha as amostras em solução até que se tornem completamente transparentes para microscopia multifóton ou confocal. Assim que uma limpeza completa for alcançada, monte a amostra em uma lâmina de imagem para esse fim. Use cimento dental para fazer uma borda ao redor do tecido.

Encha a piscina com a solução de limpeza final antes que o cimento dental fique totalmente rígido e, em seguida, coloque imediatamente a amostra limpa no meio da piscina e cubra-a com uma lamínula. Pressione a lamínula até que esteja completamente selada pelo cimento dental e toque na superfície do órgão limpo para microscopia de folha de luz assim que uma limpeza completa for alcançada e, em seguida, gire manualmente o parafuso do porta-amostra para fixar a amostra. Em seguida, mergulhe a amostra na câmara de imagem do microscópio de folha de luz preenchida com a solução de limpeza final apropriada para o tecido imageado.

Em seguida, colete varreduras Z cobrindo todos os tecidos limpos na melhor resolução que o microscópio pode fornecer, ampliando as regiões de interesse para coletar imagens de alta resolução. Após coletar as imagens, carregue a série de imagens no software Amira com o módulo resolve RT. Quando a série tiver sido carregada, insira os tamanhos de voxel corretos na janela de parâmetro de leitura de imagem e clique em OK.

Em seguida, selecione o subaplicativo de visualização multiplanar. Em seguida, use os controles deslizantes primário e de espessura para escolher a espessura e o limite de projeção ideais para os valores de cinza. Por fim, use o módulo de canto de corte para navegar pelas fatias em diferentes orientações 3D.

Para visualizar as amostras, mapear a organização estrutural dos neurônios é extremamente importante para entender como eles funcionam na saúde e na doença. Embora três discotecas possam ser empregadas em vários órgãos, é particularmente útil para rastrear longas conexões neuronais na medula espinhal e no cérebro. Por exemplo, usando varreduras de ultramicroscopia de grandes segmentos da medula espinhal limpos, as conexões axonais podem ser seguidas por centímetros na medula espinhal de roedores, conforme ilustrado nessas imagens.

De maneira semelhante, todo o cérebro e hipocampo do camundongo podem ser visualizados para seguir as conexões neuronais no cérebro. Quando a microscopia confocal ou multifóton é usada, a resolução da imagem pode ser significativamente melhorada, especialmente na dimensão Z. Por exemplo, a imagem multifóton de medula espinhal limpa de camundongos da linha GFPM obtém uma imagem perfeita em toda a profundidade de 1,5 a dois milímetros da medula espinhal.

A microscopia confocal na medula espinhal limpa oferece resolução aprimorada de maneira semelhante. A imagem de microscopia multifóton de cérebros limpos fornece imagens de alta resolução para visualizar detalhes finos de estruturas neuronais, incluindo espinhas dendríticas. As amostras para três discotecas podem ser rotuladas de várias maneiras.

Por exemplo, é possível rotular toda a vasculatura do cérebro e da medula espinhal usando marcadores fluorescentes conjugados com lectina, que podem ser usados para estudar a barreira hematoencefálica na saúde e na doença. Usando três células menores em grandes tecidos também podem ser visualizadas. Por exemplo, tanto a micróglia quanto os astrócitos estão altamente implicados na patologia da neurodegeneração, incluindo a doença de Alzheimer e lesões traumáticas.

Usando três discos, sua densidade e distribuição na medula espinhal podem ser estudadas. Tecidos não neuronais também podem ser visualizados. Por exemplo, as células Clara em todos os pulmões de roedores podem ser imunomarcadas com anticorpos e visualizadas sem seccionamento em nível de célula única.

Da mesma forma, é possível limpar e obter imagens de células no tecido do pâncreas não sancionado. Por exemplo, as células alfa marcadas com fluorescência são visualizadas após a limpeza nessas imagens do pâncreas. A demonstração visual desse método é importante porque, embora as etapas de limpeza e imagem sejam diretas, a análise de dados pode ser complicada.

Ao aplicar este procedimento, é importante obter imagens de tecidos transparentes assim que a transparência completa for alcançada, pois o sinal fluorescente se degradará com o tempo na solução de limpeza. O desenvolvimento dessa técnica abriu caminho para os pesquisadores explorarem detalhes e órgãos intactos, como o mapeamento de redes neuronais no cérebro. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como limpar e visualizar estruturas celulares e subcelulares em todos os órgãos e, posteriormente, visualizá-las e analisá-las.