Name: Imagem Limpa Sistemas Biológicos intactas em um nível celular por 3DISCO (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Aprenda a técnica 3DISCO para imagem de amostras biológicas intactas em 3D sem corte histológico. Este método permite visualizar conexões neuronais em cérebro e medula espinhal com alta resolução.

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Agradecemos C. Hojer para a leitura crítica do manuscrito, B. Bingol (Genentech) para a participação em narrações roteiro, N. Bien-Ly para compartilhar a experiência de uma melhor imagem vasculatura com injeção veia da cauda de corante Lectin e M Solloway (Genentech ) para os ratinhos utilizados em imagiologia pâncreas. Linha GFP-M foi criado por J. Sanes (Universidade de Washington em St. Louis) e camundongos CX3CR1-GFP por R. Littman (NYU). O trabalho é apoiado pela Genentech, Inc.

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com IACUC (Comitê Animal Care Institucional e utilização) regulamentos em ratos ~ 3-5 meses de idade. O autor declara não interesses financeiros concorrentes. 1. Perfusão Animal e preparação do tecido Timing: 30-60 min por mouse + pós-fixação (de algumas horas a noite). <ol><li> Pesa-se o animal e anestesiar usando cetamina (80-200 mg / kg) e xilazina (7-20 mg / kg) ou 2,5% de avertina (0,5 ml/25 g de peso corporal de IP). </li><li> Aguarde alguns minutos para anestesia fazer efeito completo. </li><li> Aperte o dedo do pé e cauda do animal para se certificar de que o animal está totalmente anestesiado. </li><li> Perfundir o primeiro animal à RT, com 0,1 M de tampão fosfato (PB) ou 0,1 M de tampão fosfato salino (PBS) durante 5-10 min, até que o sangue é completamente removido do tecido. </li><li> Alterne a perfusão de solução fixadora: PFA 4% em 0,1 M PB (ou 0,1 M PBS) e continuar a perfusãocom PFA a 4% durante 30-40 minutos a uma velocidade de 3 ml / min. </li><li> Dissecar a órgãos / s de interesse cuidadosamente sem danificar, por exemplo, evitar a perfuração e apertando o tecido que está a ser dissecado. </li><li> Remover o tecido extra em torno dos órgãos (tecido conjuntivo, meninges ou dura-máter) numa placa de Petri com PBS. </li><li> Pós-corrigir os órgãos em PFA 4% por algumas horas ou durante a noite a 4 º C. Evite longa pós-fixação porque PFA pode saciar o sinal ou aumentar as horas extras autofluorecense 10 especialmente para o canal GFP (que é um problema menor nos canais vermelho e vermelho agora). </li><li> Lave os órgãos 2-3x com PBS a RT imediatamente antes de iniciar o procedimento de limpeza. </li></ol> 2. Clearing Tissue Timing: 2-3 hr para pequenos órgãos e 1-4 dias para os grandes órgãos. Notas: A rotulagem fluorescente dos tecidos pela expressão do transgene, transfecção viral, traçando corante ou antirotulagem corpo deve ser concluída antes de limpar. Todos os passos de compensação do tecido são realizados à temperatura ambiente. As soluções de compensação de THF, DBE, Babb (1 parte de álcool benzílico e 2 parte benzoato de benzila) e diclorometano são tóxicos e inalação (conduzir experimentos em coifa bem ventilado) e contato direto com a pele deve ser evitado (luvas de borracha nitrílica uso). <ol><li> Prepare a 50% (vol / vol), 70%, 80% e diluições em THF em água destilada em frascos de vidro separados como se segue: Para 50% de THF, por exemplo, misturar 25 mL de THF e 25 ml de água destilada em um frasco de vidro com volume de de maior de 50 ml. </li><li> Misture soluções agitando a garrafa para um 1-2 min. </li><li> Identifique claramente a garrafa de vidro. </li><li> Feche bem as garrafas e manter as soluções de trabalho em um armário escuro. Para obter os melhores resultados, não use as mesmas soluções de trabalho com mais de 1-2 semanas. Portanto, pedir as soluções de compensação como o menor volume disponível para poder utilizar os novos reagentes de ações. </li><li>Encher os frascos de vidro (por exemplo, 2-3 ml) com a primeira solução de compensação, 50% de THF, e transferir os órgãos de PBS em frascos de vidro para iniciar a limpeza. </li><li> Feche bem os frascos de vidro com suas tampas e usar um rotador (por exemplo, um agitador roda) para agitar. </li><li> Use a folha de alumínio para cobrir e manter os frascos de vidro em escuro. Inicie o rotador para agitar as amostras em frascos de vidro durante o tempo indicado (Tabela 1), a uma velocidade constante (aproximadamente 30 rpm). </li><li> Remover a solução de limpeza e de adicionar o próximo no protocolo, quando o tempo na Tabela 1 é concluída. </li><li> Recolher o lixo clareira em contentores de lixo de vidro que são mantidos em uma capa. Repita o passo anterior para cada solução de limpeza no protocolo até o fim. Use uma nova pipeta pasteur quando uma nova solução de limpeza é adicionado (por exemplo, mudar de THF para DBE). </li><li> Na etapa final clareira com BABB ou DBE, os tempos de incubação pode ser prorrogado ou shortened até que as amostras se tornar totalmente transparente à luz visível (ou amarelada / transparente, se é um grande tecido como o cérebro). </li><li> Manter os órgãos compensados ​​na solução final de compensação em todos os momentos, incluindo as etapas de imagem. </li></ol> 3. Preparando Órgãos Cancelado for Imaging Timing: 5-15 min. Nota: A imagem dos órgãos apuradas assim que uma compensação completa seja alcançada. Para isso, siga os seguintes passos para preparar as amostras para microscopia de luz folhas (por exemplo, ultramicroscopia) ou confocal / multi-fotão microscopia de imagem. Nota: órgãos Cancelado vai perder sua força de fluorescência ao longo do tempo (particularmente proteínas fluorescentes, por exemplo, GFP; rotulagem anticorpo é mais resistente e pode até dar melhores resultados com incubações mais longas). Para imagiologia, várias técnicas de microscopia de fluorescência pode ser utilizado, desde que a manipulação adequada dos órgãos na cleasolução anel é conseguida. <ol><li> Para a microscopia de luz folhas <ol><li> Coloque ou montar a amostra de forma adequada. </li><li> Corrigir o órgão cancelou girando manualmente o parafuso do suporte da amostra 4. </li><li> Mergulhar a amostra para a câmara de imagem (de preferência feito de vidro) de microscópio thelight-folha que é cheio com o BABB ou DBE, o que foi utilizado no passo final de limpeza. </li></ol></li><li> Para a microscopia de multi fotões / confocal <ol><li> Montagem da amostra sobre uma corrediça de imagem (ou uma câmara de imagem) com a solução final de imagem para ser capaz de imagem com um multi fotões ou microscopia confocal, que tipicamente utilizam óleo ou água objectivos imerso. </li><li> Use cimento dental para fazer uma borda ao redor do tecido. </li><li> Encher a piscina com BABB ou DBE pouco antes de cimento dental fica totalmente rígida. Nota: O cimento dental solidifica rapidamente; praticar algumas vezes para se familiarizar com ele antes de tentar as amostras reais. </li><li> Colocar imediatamentea amostra apuradas no meio da piscina e cubra com uma tampa de vidro. </li><li> Pressionar a tampa de vidro até que seja completamente selada com cimento dentário e toca na superfície do órgão limpa, o que permitirá atingir a profundidade máxima de imagiologia por microscopia confocal / multi-fotão. Notas: Isso garante que nenhuma solução compensação será derramado durante a imagem. Evitar mergulhando a lente de imagem directamente na solução de compensação, o que pode prejudicar a lente menos que seja resistente à BABB / DBE, ou tem uma capa protectora. </li></ol></li></ol> Órgãos 4. Imagem Cancelado Timing: 15-45 min. <ol><li> Coletar uma varredura z cobrindo todo o tecido limpo (se a lente utilizada permite) com o melhor resolução que o microscópio pode entregar. </li><li> Amplie as regiões de interesse para coletar imagens de alta resolução. </li></ol> 5. Exame dos dados com o software Amira <ol><li> Carregue a série imagems de software Amira com módulo ResolveRT. </li><li> Digite os tamanhos de voxel corretos na janela &quot;Imagem Read Parameter&quot; e pressione ok. </li><li> Selecione o &quot;Multi Planer View&quot; sub-aplicação. Em seguida, use o controle deslizante &quot;espessura&quot; para escolher o limite ideal para os valores de cinza, ajustando os valores 2D e 3D. </li><li> Visualize a amostra, navegando as fatias em diferentes orientações 2D e usando o módulo de integração lavoura-canto em vista 3D. Nota: Um guia de resolução detalhada do protocolo pode ser encontrada em Ertürk et al 4. </li></ol>

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Não há nada a divulgar.

Métodos de compensação Tissue visam reduzir a dispersão da luz de imagem, combinando os índices de refração de diferentes camadas de tecido nos órgãos desmatadas. Como um resultado, a luz de imagem podem penetrar profundamente nos tecidos e estimular as células marcadas / moléculas. Este velho conceito de tecido limpando 17 ganhou crescente atenção após a primeira aplicação sofisticada da técnica em cérebros intactos rato por Dodt e colegas 2. Desde então, há uma lista crescente de novos métodos de compensação, incluindo 3DISCO, Sca / e, ClearT2, CLAREZA e SeeDB 3,4,7,18-20. Em essência, todos eles visam tornar os órgãos transparentes para imagens de tecidos profundos, preservando a etiqueta fluorescente. Entre eles, 3DISCO destaca-se como um dos métodos mais simples e reprodutível. É relativamente rápido em comparação com outros métodos de compensação mencionados acima (1-5 dias vs 2-3 semanas para cérebros adultos, respectivamente) 21. Ele já foi sucessototalmente aplicado a diferentes órgãos, como o cérebro, medula espinhal, gânglios linfáticos, baço, pulmão, tumores sólidos, pâncreas e glândulas mamárias 3,4,9. Além disso, várias publicações de grupos de pesquisa independentes já usou esse método para obter imagens resulta 22,23. No entanto, diferentes procedimentos de limpeza de tecido pode ser vantajoso para as diferentes condições. Por exemplo, enquanto Sca / e e SeeDB são mais aplicáveis ​​em tecidos embrionários 6,7, são métodos de compensação à base de água, que poderia ser mais fácil de manusear durante o exame. Em contraste, a clareza é um método de compensação complicada e dispendiosa. Mas, pode ser vantajoso no contexto da marcação com anticorpos, especialmente em grandes tecidos, tais como tumores do cérebro 8. O passo mais importante para obter os melhores resultados de imagem de 3DISCO é a rotulagem dos tecidos, que é realizado antes da compensação de tecidos. É essencial para começar com o sinal de fluorescência mais forte possível. Isto pode bE conseguida de várias maneiras, incluindo a expressão transgénica de proteínas fluorescentes, detecção por corantes sintéticos, transfecção viral ou marcação de anticorpos. Deve ser mantido em mente que qualquer procedimento de compensação irá reduzir o sinal fluorescente dos tecidos. Assim, se o sinal fluorescente não é forte o suficiente no início - ou seja, não é facilmente detectável antes da compensação por imagem dos tecidos desmatadas vai entregar resultados pobres. Existem algumas limitações de limpar os métodos que estão à espera de melhorias. Uma limitação fundamental é que uma vez que os reagentes de compensação alteram a estrutura dos órgãos compensados, eles não podem ser utilizados em tecido vivo. Assim, experiências como com mEos2 fotoactivável 24 deve ser realizada antes da fixação e de compensação. Após a limpeza, de super-resolução de imagem do sinal de fluorescência a partir de proteínas brilhantes e fotoestáveis ​​torna-se possível. Além disso, porque o protocolo de compensação diminui ointensidade das proteínas fluorescentes, os órgãos não apuradas pode ser armazenado por períodos prolongados. É importante notar que alguns órgãos são mais difíceis de ser apagadas. Especialmente, se os órgãos dissecados reter grandes quantidades de células de sangue (por exemplo, o baço, o fígado), que são relativamente difíceis de limpar e de imagem. Também é relativamente difícil de conseguir uma eliminação completa de grandes tecidos, tais como cérebro adulto roedor. Tais tecidos podem precisar de tempos de incubação mais longos, o que poderia, por outro lado, reduzir o sinal fluorescente. Além disso, o desenvolvimento de métodos de microscopia que pode imagem de grandes órgãos transparentes de uma só vez em uma alta resolução de uma necessidade aguardando para ser abordado. Outra importante limitação da técnica é a rotulagem tecido. Enquanto um forte sinal de fluorescência através de expressão genética ou vírus é ideal, nem todas as células ou a molécula pode ser etiquetado de forma viral ou geneticamente. Por outro lado, a marcação de anticorpos de tecidos espessos não é um procedimento simples, ou mesmo não possible na maioria dos casos. Ele pode precisar de protocolos especiais permeabilização e longos tempos de incubação (vários dias a algumas semanas) 3. Também é importante ter em mente que os tecidos encolher cerca de 20% em cada dimensão (medida de tecido da medula espinhal) depois de limpar, principalmente devido à desidratação e delipidação. Este encolhimento ocorre ratiometrically e deve ser corrigida em passos de quantificação. Como pode ser observado nos resultados apresentados, estruturas marcadas com fluorescência permanece intacta, o que é a indicação de integridade de proteínas nos tecidos compensados. Devido à natureza hidrofóbica do final de tecido limpa, ela não pode mais ser coradas com os anticorpos ou incorporados em soluções aquosas contendo, por exemplo, Focusclear-que é usado em clareza e 80% de glicerol. Finalmente, é um desafio para analisar tamanhos enormes de dados de imagem. Por exemplo, quando todo um cérebro murino é digitalizado com uma resolução de celular, que seria muito difícil de rastrear e quantificar str desejadouctures (por exemplo, redes neuronais ou glia) e comparar em diferentes amostras de forma automatizada. Em resumo, enquanto pesquisadores pretendem descobrir novos métodos de compensação, os vários desafios acima (dificuldade de limpar diversos tecidos, imagens em alta resolução de áreas maiores, e análise de dados complicado) deve ser melhorado em paralelo. Em conclusão, técnicas de limpeza de tecidos recentemente desenvolvidos, incluindo 3DISCO, elegantemente demonstram que imagens de alta resolução 3D de órgãos intactos agora é possível. Usando esses métodos, os cientistas podem obter informações anatômicas das células e moléculas no órgão intacto. Estes estudos de imagem 3D pioneiras em órgãos transparentes inspirar um número crescente de pesquisadores de decifrar anatômica complexa e organizações moleculares de tecidos / órgãos de saúde e doença.

O exame histológico dos tecidos biológicos é uma abordagem fundamental para a compreensão da natureza das moléculas / células em seu contexto natural. Idealmente, imagens de alta resolução de todo o órgão é mais informativo e desejado. Dado que a luz tem uma profundidade de penetração limitada, devido ao espalhamento 1, órgãos fixos têm de ser seccionados de forma a realizar de alta resolução de imagem microscópica. Assim, a maioria dos estudos histológicos são realizadas em algumas secções de tecido que representam apenas uma pequena porção do órgão. Em alguns estudos, por exemplo, aqueles com o objetivo de traçar conexões neuronais no cérebro ou na medula espinhal, todos os cortes de tecidos dos órgãos-alvo são coletados e fotografada para uma reconstrução 3D. No entanto, o corte de tecido e de imagem posterior de seções individuais tem várias limitações. Estes incluem a ser demorada e que conduz a uma reconstrução 3D incompleta do tecido, devido às distorções mecânicas e difícils no alinhamento das imagens resultantes. Recentemente, a compensação de imagem e transparentes órgãos intactos tem sido desenvolvido como uma solução para este inconveniente significativo 2,3. Após a limpeza, todo o órgão é processado transparente permitindo que a luz de imagens de viajar end-to-end (Figura 1) para produzir imagens de alta resolução do órgão unsectioned usando um microscópio de varredura a laser, como um multi fótons de luz ou folhas microscópio ( Figura 2). Vários grupos de pesquisa têm desenvolvido novos protocolos de limpeza do tecido a ser capaz de imagem seu tecido de interesse para fins diferentes. Estes incluem solvente orgânico 2-5, 6,7 água e eletroforese baseado 8 protocolos de compensação. Entre eles, a imagiologia 3-dimensional do solvente afastada órgãos ou 3DISCO é um protocolo facilmente aplicável numa variedade de amostras biológicas, incluindo o sistema nervoso central (SNC) de órgãos, órgãos imunes e tumores sólidos. Em additião, pode ser combinada com diferentes técnicas de microscopia, tais como a microscopia de luz de fluorescência folha (LSFM), multi fotão e por microscopia confocal de varrimento laser. 3DISCO baseia-se na compensação de reagentes prontamente disponíveis e baratos, tais como tetrahidrofurano (THF) e o éter dibenzílico (DBE) 4. O protocolo inteiro pode levar tão curto quanto 3-4 horas. Assim, 3DISCO é uma técnica robusta e rápida em comparação com os métodos histológicos tradicionais que pode levar semanas ou meses a completar 9.

<table><tbody><tr><td>Thy-1 GFP (GFP-M) mouse</td><td></td><td></td><td>Pode ser obtido de Jackson.</td></tr><tr>Camundongo <td></td><td></td><td>CX3CR1 GFP</td><td>Pode ser obtido no laboratório Littman da NYU.</td></tr><tr>Camundongo <td></td><td></td><td>TgN (hGFAP-ECFP)</td><td>Pode ser obtido de Jackson.</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Mallinckrodt</td><td>7917-16</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Mallinckrodt</td><td>7892-04</td><td></td></tr><tr><td>2-2-2 Tribromoetanol</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>2-Metil-2-butanol</td><td>Sigma</td><td>152463</td><td>Usado para preparar a solução de Avertin.</td></tr><tr><td>Sigma Sigma</td><td>270997-12X100ML Diclorometano Sigma 270997-12X100ML</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma do éter Dibenzyl</td><td></td> do Tetrahydrofuran da solução salina de Braun<td></td>, Sigma Benzyl do álcool 108014-1KG <td></td></tr><tr><td>Benzyl</td><td>Sigma</td><td>305197-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Sigma</td><td></td><td>B6630-250ML</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lectin FITC</td><td>Sigma</td><td>L0401-1MG</td><td></td></tr><tr><td>anti-CC10</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9772</td><td>0,388888889</td></tr><tr><td>Heparina</td><td>APP produtos farmacêuticos</td><td>504001</td><td>Usado na perfusão.</td></tr><tr><td>Frascos de vidro</td><td>VWR</td><td>548-0554</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>FST</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Mini Rotator</td><td>VWR</td><td>100498-878</td><td></td></tr><tr><td>Folha de alumínio</td><td>Fisherbrand</td><td>01-213-104</td><td></td></tr><tr><td>Garrafas de armazenamento de mídia de 100 ml</td><td>Garrafas de mídia Kimax</td><td>EW-34523-00</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de perfusão Minipuls evolution com cabeça de bomba de fluxo médio MF4*</td><td>Gilson, Inc</td><td>F110701 e F117606</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de microscopia</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>FastWell</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>FW20</td><td></td></tr><tr><td>Lamínula</td><td>Corning</td><td>2940-245</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de vidro</td><td>Corning Pyrex</td><td>3160-101</td><td></td></tr><tr><td>Cimento dentário</td><td>Lang Dental</td><td>1223PNK</td><td></td></tr><tr><td>Teste de peróxido Quantofix Tiras</td><td>Sigma</td><td>37206</td><td></td></tr><tr><td>Amira com RT resolver módulo de microscopia</td><td>Visage Imaging</td> software <td></td><td>de análise de imagem</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>software</td><td></td>de análise de imagem</tr><tr><td>de imagem ImageJ</td><td>NIH</td><td>freeware</td><td></td></tr></tbody></table>

imagem limpa sistemas biológicos intactas em um nível celular por 3disco

Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO

A limpeza de tecidos e a subsequente imagem de órgãos transparentes são um método poderoso para analisar células e moléculas marcadas com fluorescência em 3D, em órgãos intactos. Ao contrário dos métodos histológicos tradicionais, em que o tecido de interesse é seccionado para imagens fluorescentes, a imagem 3D do tecido limpo permite o exame de células e moléculas marcadas em toda a amostra. Para este fim, os tecidos opticamente opacos devem ser tornados transparentes, combinando os índices refratários em todo o tecido. Posteriormente, o tecido pode ser visualizado de uma só vez usando microscópios de varredura a laser para obter uma imagem 3D completa de alta resolução da amostra. Uma lista crescente de protocolos de limpeza de tecidos, incluindo 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2 e SeeDB, fornece novas maneiras para os pesquisadores obterem imagens de seus tecidos de interesse como um todo. Entre eles, o 3DISCO é um método altamente reprodutível e direto, que pode limpar diferentes tipos de tecidos e pode ser utilizado com várias técnicas de microscopia. Este protocolo descreve este procedimento simples e apresenta suas várias aplicações. Também discute as limitações e possíveis dificuldades e como superá-las.

Os neurônios são células altamente polarizado com extremamente longa morfologia. Sua função depende das ligações que se formam entre si e com outros tecidos. Assim, o mapeamento da organização estrutural dos neurônios é extremamente importante para entender como eles funcionam na saúde e na doença. No entanto, seguindo essas enormes conexões neuronais em todo o nervoso conectonomia sistema recentemente nomeados 11 - continua a ser um dos desafios mais difíceis na neurociência. Para este fim, tanto da UE 12 e EUA 13 iniciaram grandes projetos para mapear o cérebro humano. Enquanto 3DISCO podem ser empregues em vários órgãos, tem sido particularmente útil para rastrear ligações neuronais longo da medula espinal e do cérebro. Por exemplo, por meio de varreduras ultramicroscopia segmentos de medula espinal compensados ​​grandes, as ligações axonais pode ser seguida ao longo centímetros na espinal-medula do roedor (Figura 2). De um modo semelhante, a totalidade do cérebro do rato afastada (Figura 3a) e hipocampo (Figura 3b) pode ser trabalhada para seguir as ligações neuronais no cérebro. Quando microscopia confocal fóton ou múltipla é utilizada em órgãos desmatadas, a resolução de imagem pode ser significativamente melhorada, especialmente na dimensão z. Por exemplo, várias imagens de fotões de medulas espinhais apuradas a partir de ratos da linha de GFP-M (Figura 4a) atinge uma imagem uniforme, ao longo de toda a profundidade (~ 1,5-2 mm) da medula espinal. Microscopia confocal sobre a medula espinal afastada proporciona melhor resolução de uma forma semelhante (Figuras 4b e c). Multi imagens de microscopia de fótons de cérebros desmatadas proporciona imagens muito de alta resolução para visualizar detalhes de estruturas neuronais incluindo espinhas dendríticas (Figura 5). As amostras para 3DISCO pode ser marcado de várias maneiras, incluindo a expressão do transgene, viral transfecção, traçado corante e rotulagem de anticorpos. Por exemplo, é possível marcar toda a vasculatura do cérebro (Figuras 6a e b), e na medula espinhal (Figuras 6c e d) utilizando lectina conjugada marcadores fluorescentes 4, o qual pode ser utilizado para estudar a-barreira hematoencefálica (BHE ) na saúde e na doença. Ambas as microglia e astrócitos são altamente implicados na patologia da neurodegeneração, incluindo doenças de Alzheimer e lesões traumáticas 14,15. Usando 3DISCO, a sua densidade e distribuição na medula espinal (Figura 7) ou do cérebro pode ser estudada. Tecidos não-neuronais, também pode ser trabalhada. Por exemplo, células Clara em todo os pulmões de roedores pode ser immunolabeled com anticorpos e representado sem o corte em um único nível celular (Figura 8). Da mesma forma, é possível limpar e células de imagem, por exemplo,células alfa no tecido do pâncreas unsectioned (Figura 9). <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Compensação tecido 3DISCO torna tecidos unsectioned transparentes para imagens de tecidos profundos. Uncleared (a) e compensados ​​(b) os tecidos da medula espinhal como pode ser visto pela luz visível. Após a compensação, microscopia de varredura a laser-tecido profundo se torna possível. (C) os tecidos da medula espinhal Uncleared e desmatadas foram fotografadas por microscopia de dois fótons. As barras de escala em a, b = 0,5 mm e em c = 100 pm. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. 3DISCO imagiologia de medula espinal a seguir extensões axonais. A medula dissecada de Thy-1 de linha de ratinhos transgénicos GFP (GFP-M) é dividida em pedaços mais pequenos (~4 mm). Depois de seguir o protocolo de compensação para pequenos tecidos (Tabela 1) as medulas espinhais transparentes foram visualizados utilizando ultramicroscopia. Reconstruções em 3D de um ~ 4 milímetros segmento da medula espinhal em horizontal (a), coronal (b) e sagital (c). (D) Representante rastreada axônios (vermelho) são mostrados na visão transparente em tons de cinza. (E) Alto ampliação da região indicada em (d). As barras de escala em a, b, c, d = 0,5 mm, e em e = 20 um. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig3highres.jpg" width="500" /> 3DISCO imagem do cérebro apagado e hipocampo Figura 3.. Exemplos de cérebros e hipocampo de camundongos GFP-M desmatadas foram fotografadas com um ultramicroscópio. Visualizações 3D de todo o cérebro (a) e hipocampo (b) demonstrar o netwo neuronalrks nos tecidos transparentes com imagens. As barras de escala em um = 2 mm, e em b = 20 ^ m. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Compensação de tecido aumenta a resolução obtida por vários fotões e microscopia confocal. Segmentos da medula espinhal de ratos transparentes GFP-M fotografada por vários fotões (a) ou microscopia confocal (b, c). Note-se que a limpeza substancialmente melhora a resolução e profundidade de imagem revelando a estrutura fina de axônios e dendritos. Barras de escala = 100 um em um e em b, c = 20 um. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. 3DISCO imagem das espinhas dendríticas. Tecido cerebral de camundongos Transparente GFP-M fotografada pelo multi fótons. Visualizações 3D da região do córtex digitalizada apresentados em versãoperspectivas Tical (a) e horizontais (b). (C) ~ 50 um de projecção a partir dos níveis indicados em (a, b). (D) alta ampliação da região indicada em (c) demonstrar os detalhes das estruturas neuronais incluindo espinhas dendríticas (setas). As barras de escala em um = 50 mm, em b, c = 25 um, no d = 5 mm. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6. 3DISCO da vasculatura. Para identificar os vasos sanguíneos em todo os órgãos, corante de lectina-FITC foi utilizada durante a perfusão (antes da compensação) como descrito 16. É importante mencionar que achamos que a injeção na veia da cauda do traçador dá melhor sinal sobre perfusão cardíaca do marcador. Após a coleta dos cérebros fixos e medula espinhal, eles foram apuradas e imaged por ultramicroscopia. Visualização 3D de toda a vasculatura cerebral do rato em heatmap (a) e em escala de cinza (a). (B) a visualização 3D da vasculatura de um rato segmento da medula espinhal em heatmap (c) e em escala de cinza (d). Os heatmaps foram gerados com base na intensidade de coloração da lectina; azul: baixa intensidade (background) e vermelho: alta intensidade (vascularização). As barras de escala em um = 2 mm, b = 1 mm, e em c, d = 250 um. <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig7highres.jpg" width="500" /> Figura 7. 3DISCO de células da glia no tecido CNS apagada. Medula espinhal de camundongos transgênicos expressando GFP em microglia Tgh (CX3CR1-EGFP) ou astrócitos TgN (hGFAP-ECFP) foram apuradas e fotografada por microscopia de multi fótons. Rendição 3D de microglia é mostrado como a visualização do volume de superfície (a) e vista transparente ( <strong&gt; b). (C) Uma projecção óptica (~ 50 mM) é apresentado para mostrar os detalhes da microglia na medula espinal. Rendição 3D de astrócitos é mostrado como a visualização do volume de superfície (a) e vista transparente (b). (F) Uma projecção óptica (~ 50 mM) é apresentado para mostrar os detalhes dos astrócitos na medula espinhal. As barras de escala em a, b, d, e = 100 mm e em c, f = 50 mm. <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig8highres.jpg" width="500" /> Figura 8. 3DISCO de um lobo pulmonar inteiro de montagem com coloração de anticorpos de células Clara. Para o anticorpo coloração dos lobos pulmonares todo-mount, 10 semanas de idade camundongos BALB / C fêmeas foram perfundidos através do ventrículo direito com PBS, a fim de remover o sangue dos pulmões. Os pulmões foram subsequentemente inflado com PFA a 4% e fixa S / N a RT em fixador, pelo menos, três vezes o volume de poe tecidos. No dia seguinte, os pulmões foram rapidamente lavadas em PBS e o lóbulo direito foi colocado em 5 ml de 1% de Triton X-100 em PBS, durante a permeabilização durante 48 horas ou até o tecido se afundou. Todas as colorações foram realizadas em 0,2% de Triton X-100 em PBS contendo 5% de FBS e 2% de BSA e lavagens foram em 0,2% de Triton X-100 em PBS. Coloração com anticorpos anti-CC10 foi de 72 horas a 4 ° C, seguido por extensa lavagem de cerca de 6 horas. A microscopia por fluorescência de o anticorpo primário foi realizada com o anticorpo secundário anti-cabra-Alexa Fluor-594 durante a noite a 4 ° C, seguido por lavagens extensas em 6 horas durante a noite. No dia seguinte, os lóbulos coradas foram apuradas através de 50%, 70%, e 80% de THF, durante 30 min cada, seguido por três lavagens de 30 min em 100% de THF, seguidos por 20 min em DCM, seguido de 30 min em DBE. As barras de escala em a e b = 1 mm e em c = 100 pm. <img alt="Figura 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig9highres.jpg" width="500" /> Figura<html> 9. 3DISCO de pâncreas. Após a perfusão de ratos, como descrito acima no protocolo, o pâncreas foi dissecado e liberado com o protocolo curto. A fluorescência é derivado Rosa26 LSL tdTomato recombinação induzida por tratamento com tamoxifeno de ratos portadores de um transgene de BAC de 200 kb abrangendo o rato glucagon locus endógeno com CreERT2 inseridos no ATG do glucagon. As setas marcam algumas das células alfa fluorescentes marcado na ilhota. As barras de escala em a, b e c = 1 mm e em d = 500 mm. <img alt="Tabela 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg" width="600" /> Tabela 1. Protocolos de limpeza de tecidos para vários tecidos. Exemplos de protocolos de limpeza de tecidos para tecidos diferentes. Note-se que o tempo de compensação para cada etapa pode ser encurtado ou estendido conforme a necessidade de melhorar o desempenho de compensação. O peso aproximado de pequenos tecidos é de aproximadamente 20-100 mg e do cérebro é de aproximadamente 300-500 mg.TTP :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.

Para obter imagens de alta resolução de células marcadas com fluorescência dentro de grandes tecidos, idealmente, as amostras biológicas devem ser visualizadas sem seccionamento. 3DISCO é um procedimento simples de limpeza de tecidos baseado na incubação sequencial com solventes orgânicos. Após a limpeza, os órgãos tornam-se transparentes, permitindo uma varredura a laser de ponta a ponta da amostra.

Imagem Limpa Sistemas Biológicos intactas em um nível celular por 3DISCO

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact ...

O objetivo geral do experimento a seguir é obter imagens de amostras biológicas intactas marcadas com fluorescência sem o uso de seccionamento histológico. Isso é alcançado por meio da incubação sequencial de tecidos fixados em solventes orgânicos até que uma transparência completa seja obtida. Como segundo passo.Os tecidos transparentes são imagiados em 3D usando um microscópio a laser de varredura. Em seguida, os resultados da imagem são analisados e as estruturas neuronais na medula espinhal e no cérebro não seccionados podem ser reconstruídas em 3D a partir das três imagens coletadas. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área de neurociência sobre como mapear conexões neuronais e GAL em todo o cérebro e medula espinhal.As implicações dessa técnica estendem-se à terapia da neurodegeneração, pois agora podemos visualizar a integridade neural em todo o sistema nervoso. Embora este método possa fornecer informações sobre a organização do sistema nervoso, ele também pode ser aplicado a outros órgãos, como o pulmão ou tecido tumoral. Após dominada, essa técnica leva apenas algumas horas para órgãos pequenos, como a medula espinhal ou o pulmão, e cerca de um ou dois dias para o cérebro. Inicie o procedimento adicionando dois a três mililitros de THF 50% recém-preparado a um frasco de vidro para cada tecido coletado.Em seguida, transfira os órgãos fixados para a solução de clareamento e feche firmemente os frascos. Coloque os frascos em um agitador rotativo e cubra-os com papel alumínio, agitando as amostras pelo tempo apropriado a uma velocidade constante de 30 RPM. Em seguida, remova a solução de clareamento e use um novo PE ou pipeta para suspender o tecido na próxima solução.Conforme indicado na tabela durante a etapa final de clareamento, mantenha as amostras em solução até que fiquem completamente transparentes para microscopia multiphoton ou confocal. Assim que o clareamento completo for alcançado, monte a amostra em uma lâmina de imagem para esse fim. Utilize cimento dental para fazer uma borda ao redor do tecido.Encha o poço com a solução de clareamento final pouco antes de o cimento dental ficar completamente rígido e, em seguida, coloque imediatamente a amostra clareada no centro do poço e cubra-a com um lamínula. Pressione o lamínula até que fique completamente selado pelo cimento dental e entre em contato com a superfície do órgão clareado para microscopia de folha de luz; assim que o clareamento completo for alcançado, monte e, então, gire manualmente o parafuso do suporte da amostra para fixar a amostra. Em seguida, mergulhe a amostra na câmara de imagem do microscópio de folha de luz preenchida com a solução de clareamento final apropriada para o tecido analisado.Em seguida, realize varreduras Z cobrindo todos os tecidos clarificados na melhor resolução que o microscópio puder fornecer, aumentando o zoom nas regiões de interesse para obter imagens de maior resolução. Após a aquisição das imagens, carregue a série de imagens no software Amira com o módulo resolve RT. Quando a série tiver sido carregada, insira os tamanhos corretos de vóxeis na janela de parâmetros de leitura da imagem e clique em OK.Em seguida, selecione o subaplicativo de visualização multiplanar. Depois, utilize os controles deslizantes primário e de espessura para escolher a espessura de projeção e o limiar ideais para os valores de cinza. Por fim, utilize o módulo de corte nos cantos para navegar pelas fatias em diferentes orientações 3D.Para visualizar as amostras, mapear a organização estrutural dos neurônios é extremamente importante para compreender como eles funcionam na saúde e na doença. Embora o método three disco possa ser empregado em diversos órgãos, ele é particularmente útil para rastrear longas conexões neuronais na medula espinhal e no cérebro. Por exemplo, utilizando varreduras de ultramicroscopia de segmentos grandes da medula espinhal transparentizados, as conexões axonais podem ser seguidas ao longo de centímetros na medula espinhal de roedores, como ilustrado nestas imagens.De maneira semelhante, todo o cérebro e o hipocampo de camundongos clarificados podem ser imagiados para acompanhar as conexões neuronais no cérebro. Quando se utiliza microscopia confocal ou de múltiplos fótons, a resolução de imagem pode ser significativamente melhorada, especialmente na dimensão Z. Por exemplo, a imagem de múltiplos fótons de medulas espinhais clarificadas de camundongos da linhagem GFPM produz uma imagem contínua em toda a profundidade de 1,5 a dois milímetros da medula espinhal.A microscopia confocal na medula espinhal clareada fornece resolução melhorada de maneira semelhante. A imagem obtida por microscopia de múltiplos fótons de cérebros clareados fornece imagens de resolução muito alta para visualizar detalhes finos das estruturas neuronais, incluindo espinhos dendríticos. As amostras para o três disco podem ser marcadas de várias formas.Por exemplo, é possível marcar toda a vasculatura do cérebro e da medula espinhal utilizando traçadores fluorescentes conjugados com lectina, os quais podem ser usados para estudar a barreira hematoencefálica em condições fisiológicas e patológicas. Utilizando três disco, células menores em tecidos grandes também podem ser visualizadas. Por exemplo, tanto a microglia quanto os astrócitos estão fortemente implicados na patologia da neurodegeneração, incluindo a doença de Alzheimer e lesões traumáticas.Utilizando três disco, pode-se estudar sua densidade e distribuição na medula espinhal. Tecidos não neuronais também podem ser analisados por imagem. Por exemplo, células de Clara em todo o pulmão de roedores podem ser marcadas por imunomarcação com anticorpos e analisadas por imagem sem seccionamento, ao nível de célula única.Da mesma forma, é possível tornar transparentes e imaginar células no tecido pancreático não tratado. Por exemplo, as células alfa marcadas com fluorescência são imagiadas após o processo de clareamento nestas imagens do pâncreas. A demonstração visual deste método é importante porque, embora as etapas de clareamento e aquisição de imagens sejam diretas, a análise dos dados pode ser complicada.Embora aplicando este procedimento, é importante imaginar tecidos claros assim que a transparência completa for alcançada, pois o sinal fluorescente se degradará com o tempo na solução de clareamento. O desenvolvimento desta técnica abriu caminho para que pesquisadores explorassem detalhes e órgãos intactos, como o mapeamento de redes neuronais no cérebro. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como clarear e imaginar estruturas celulares e subcelulares em órgãos inteiros, e subsequentemente visualizá-las e analisá-las.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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