Imagem Limpa Sistemas Biológicos intactas em um nível celular por 3DISCO
7 de julho de 2014
Para obter imagens de alta resolução de células marcadas com fluorescência dentro de grandes tecidos, idealmente, as amostras biológicas devem ser visualizadas sem seccionamento. 3DISCO é um procedimento simples de limpeza de tecidos baseado na incubação sequencial com solventes orgânicos. Após a limpeza, os órgãos tornam-se transparentes, permitindo uma varredura a laser de ponta a ponta da amostra.
O objetivo geral do experimento a seguir é obter imagens de amostras biológicas intactas marcadas com fluorescência sem o uso de seccionamento histológico. Isso é alcançado por meio da incubação sequencial de tecidos fixados em solventes orgânicos até que uma transparência completa seja obtida. Como segundo passo.
Os tecidos transparentes são imagiados em 3D usando um microscópio a laser de varredura. Em seguida, os resultados da imagem são analisados e as estruturas neuronais na medula espinhal e no cérebro não seccionados podem ser reconstruídas em 3D a partir das três imagens coletadas. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área de neurociência sobre como mapear conexões neuronais e GAL em todo o cérebro e medula espinhal.
As implicações dessa técnica estendem-se à terapia da neurodegeneração, pois agora podemos visualizar a integridade neural em todo o sistema nervoso. Embora este método possa fornecer informações sobre a organização do sistema nervoso, ele também pode ser aplicado a outros órgãos, como o pulmão ou tecido tumoral. Após dominada, essa técnica leva apenas algumas horas para órgãos pequenos, como a medula espinhal ou o pulmão, e cerca de um ou dois dias para o cérebro. Inicie o procedimento adicionando dois a três mililitros de THF 50% recém-preparado a um frasco de vidro para cada tecido coletado.
Em seguida, transfira os órgãos fixados para a solução de clareamento e feche firmemente os frascos. Coloque os frascos em um agitador rotativo e cubra-os com papel alumínio, agitando as amostras pelo tempo apropriado a uma velocidade constante de 30 RPM. Em seguida, remova a solução de clareamento e use um novo PE ou pipeta para suspender o tecido na próxima solução.
Conforme indicado na tabela durante a etapa final de clareamento, mantenha as amostras em solução até que fiquem completamente transparentes para microscopia multiphoton ou confocal. Assim que o clareamento completo for alcançado, monte a amostra em uma lâmina de imagem para esse fim. Utilize cimento dental para fazer uma borda ao redor do tecido.
Encha o poço com a solução de clareamento final pouco antes de o cimento dental ficar completamente rígido e, em seguida, coloque imediatamente a amostra clareada no centro do poço e cubra-a com um lamínula. Pressione o lamínula até que fique completamente selado pelo cimento dental e entre em contato com a superfície do órgão clareado para microscopia de folha de luz; assim que o clareamento completo for alcançado, monte e, então, gire manualmente o parafuso do suporte da amostra para fixar a amostra. Em seguida, mergulhe a amostra na câmara de imagem do microscópio de folha de luz preenchida com a solução de clareamento final apropriada para o tecido analisado.
Em seguida, realize varreduras Z cobrindo todos os tecidos clarificados na melhor resolução que o microscópio puder fornecer, aumentando o zoom nas regiões de interesse para obter imagens de maior resolução. Após a aquisição das imagens, carregue a série de imagens no software Amira com o módulo resolve RT. Quando a série tiver sido carregada, insira os tamanhos corretos de vóxeis na janela de parâmetros de leitura da imagem e clique em OK.
Em seguida, selecione o subaplicativo de visualização multiplanar. Depois, utilize os controles deslizantes primário e de espessura para escolher a espessura de projeção e o limiar ideais para os valores de cinza. Por fim, utilize o módulo de corte nos cantos para navegar pelas fatias em diferentes orientações 3D.
Para visualizar as amostras, mapear a organização estrutural dos neurônios é extremamente importante para compreender como eles funcionam na saúde e na doença. Embora o método three disco possa ser empregado em diversos órgãos, ele é particularmente útil para rastrear longas conexões neuronais na medula espinhal e no cérebro. Por exemplo, utilizando varreduras de ultramicroscopia de segmentos grandes da medula espinhal transparentizados, as conexões axonais podem ser seguidas ao longo de centímetros na medula espinhal de roedores, como ilustrado nestas imagens.
De maneira semelhante, todo o cérebro e o hipocampo de camundongos clarificados podem ser imagiados para acompanhar as conexões neuronais no cérebro. Quando se utiliza microscopia confocal ou de múltiplos fótons, a resolução de imagem pode ser significativamente melhorada, especialmente na dimensão Z. Por exemplo, a imagem de múltiplos fótons de medulas espinhais clarificadas de camundongos da linhagem GFPM produz uma imagem contínua em toda a profundidade de 1,5 a dois milímetros da medula espinhal.
A microscopia confocal na medula espinhal clareada fornece resolução melhorada de maneira semelhante. A imagem obtida por microscopia de múltiplos fótons de cérebros clareados fornece imagens de resolução muito alta para visualizar detalhes finos das estruturas neuronais, incluindo espinhos dendríticos. As amostras para o três disco podem ser marcadas de várias formas.
Por exemplo, é possível marcar toda a vasculatura do cérebro e da medula espinhal utilizando traçadores fluorescentes conjugados com lectina, os quais podem ser usados para estudar a barreira hematoencefálica em condições fisiológicas e patológicas. Utilizando três disco, células menores em tecidos grandes também podem ser visualizadas. Por exemplo, tanto a microglia quanto os astrócitos estão fortemente implicados na patologia da neurodegeneração, incluindo a doença de Alzheimer e lesões traumáticas.
Utilizando três disco, pode-se estudar sua densidade e distribuição na medula espinhal. Tecidos não neuronais também podem ser analisados por imagem. Por exemplo, células de Clara em todo o pulmão de roedores podem ser marcadas por imunomarcação com anticorpos e analisadas por imagem sem seccionamento, ao nível de célula única.
Da mesma forma, é possível tornar transparentes e imaginar células no tecido pancreático não tratado. Por exemplo, as células alfa marcadas com fluorescência são imagiadas após o processo de clareamento nestas imagens do pâncreas. A demonstração visual deste método é importante porque, embora as etapas de clareamento e aquisição de imagens sejam diretas, a análise dos dados pode ser complicada.
Embora aplicando este procedimento, é importante imaginar tecidos claros assim que a transparência completa for alcançada, pois o sinal fluorescente se degradará com o tempo na solução de clareamento. O desenvolvimento desta técnica abriu caminho para que pesquisadores explorassem detalhes e órgãos intactos, como o mapeamento de redes neuronais no cérebro. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como clarear e imaginar estruturas celulares e subcelulares em órgãos inteiros, e subsequentemente visualizá-las e analisá-las.
Visão Geral
Este estudo apresenta um método para a obtenção de imagens de amostras biológicas intactas marcadas com fluorescência sem o uso de seccionamento histológico, utilizando a técnica 3DISCO. O processo envolve a incubação sequencial de tecidos fixados em solventes orgânicos para alcançar transparência, seguida por imagem 3D com microscópio de varredura a laser.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Técnicas de Imagem
- Clareamento de Tecidos
Antecedentes
- A imagem de amostras biológicas intactas é fundamental para compreender as estruturas neuronais.
- Os métodos tradicionais frequentemente exigem o corte em seções, o que pode ocultar conexões.
- O 3DISCO permite a visualização de órgãos inteiros em 3D.
- Essa técnica pode ser aplicada a diversos tecidos, incluindo o cérebro e a medula espinhal.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para a imagem de conexões neuronais em tecidos intactos.
- Aprimorar a compreensão da neurodegeneração e da integridade neural.
- Visualizar estruturas celulares sem a necessidade de seccionamento.
Métodos Utilizados
- Incubação sequencial de tecidos em solventes orgânicos para clareamento.
- Imageamento 3D utilizando microscopia a laser.
- Análise de dados com o software Amira para visualização de estruturas neuronais.
- Aplicação de técnicas de marcação fluorescente para diversos tipos celulares.
Resultados Principais
- Obteve imagens de alta resolução de estruturas neuronais na medula espinhal e no cérebro.
- Demonstrou a capacidade de rastrear longas conexões neuronais ao longo de centímetros.
- Mostrou aplicações potenciais para o imageamento de outros órgãos, como pulmões e pâncreas.
- Forneceram insights sobre a organização do sistema nervoso e implicações para doenças neurodegenerativas.
Conclusões
- O método 3DISCO é eficaz para a obtenção de imagens de amostras biológicas intactas.
- Essa técnica abre novas possibilidades para a pesquisa em neurociência e além.
- Compreender as redes neuronais pode levar a avanços nas terapias para neurodegeneração.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O 3DISCO permite a aquisição de imagens tridimensionais de alta resolução de sistemas biológicos intactos sem necessidade de seccionamento, apoiando a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas em pesquisas e desenvolvimento em neurociência e oncologia. Ao preservar a arquitetura tecidual e permitir a visualização de órgãos inteiros, aumenta a confiança preditiva em modelos pré-clínicos e reduz a ambiguidade biológica em estudos de interação com alvos. Essa capacidade acelera a identificação de compostos líderes e a descoberta de biomarcadores translacionais ao fornecer dados quantitativos com resolução espacial em sistemas relevantes para doenças.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investigar hipóteses terapêuticas por meio do mapeamento de conexões neuronais e gliais em tecidos intactos da medula espinhal e do cérebro.
- Valor Operacional: Validar o engajamento de alvos e a modulação de vias em órgãos inteiros, sem artefatos histológicos.
- Valor Preditivo: Apoiar a triagem fenotípica e a identificação de compostos ativos por meio de imagens com resolução subcelular de tipos celulares marcados.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Preparar tecidos clareados como plataformas padronizadas e reproduzíveis para a obtenção de imagens de biomarcadores marcados com fluorescência.
- Valor Operacional: Permitir fluxos de trabalho de imagem escaláveis e multiplexados, compatíveis com microscopia confocal e multiphoton.
- Prontidão do Ensaio: Facilitar medidas quantitativas da variável dependente da densidade celular, distribuição e integridade estrutural em modelos de doenças.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Imagem de micróglias, astrócitos e vasculatura em modelos de neurodegeneração para alinhamento com biomarcadores translacionais.
- Valor Operacional: Ampliar aplicações para tecidos pulmonar e tumoral na validação cruzada de alvos em diferentes órgãos.
- Valor Preditivo: Permitir decisões de avanço ajustadas ao risco mediante a visualização da integridade neural e da organização estrutural em sistemas nervosos intactos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
3DISCO insere-se no continuum de descoberta, desde a validação de alvos até a imagem pré-clínica, apoiando a verificação de hipóteses e a redução de riscos mecanicistas em programas de neurociência e imuno-oncologia.
- Biologia da Descoberta: Permitir a investigação de hipóteses mediante a reconstrução de estruturas neuronais tridimensionais a partir de espécimes de medula espinhal e cérebro clareados.
- Triagem: Apoiar a padronização de ensaios por meio de protocolos de clareamento reprodutíveis e saídas de imagem quantitativas.
- Análises: Gerar pilhas Z de alta resolução e reconstruções 3D para análise comparativa dos efeitos de tratamentos.
- Pesquisa Translacional: Conectar a descoberta à validação pré-clínica por meio da imagem de fenótipos celulares relevantes para doenças em órgãos intactos.
- Reutilização Empresarial: Estabelecer uma plataforma reutilizável de clareamento e imagem aplicável a diversos tipos de tecidos e áreas terapêuticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduzir a ambiguidade mecanicista ao visualizar estruturas subcelulares e conexões de longo alcance em modelos de doenças.
- Valor Operacional: Alcançar padronização e reprodutibilidade por meio da clareza baseada em solventes e parâmetros de imagem definidos.
- Valor Estratégico: Melhorar decisões de prosseguimento ou interrupção ao fornecer dados de órgão inteiro que reduzem riscos biológicos em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Permitir a priorização ajustada ao risco por meio de imagens quantitativas e com resolução espacial da interação com o alvo e modulação de vias.
Considerações sobre a Implementação
- Exigem especialização em fixação de tecidos, manipulação de solventes e microscopia de fluorescência.
- Dependem de microscópios de varredura a laser ou de folha de luz e software de análise de imagens, como o Amira.
- Necessitam padronização entre equipes nos tempos de clareamento, procedimentos de montagem e calibração do tamanho do voxel.
- Exigem adaptação para diferentes densidades teciduais e teor de lipídios nos diversos sistemas orgânicos.
- Incluem limitações práticas, como a degradação do sinal fluorescente na solução de clareamento ao longo do tempo.
