Interferometria Bio-layer para Medição Cinética de interações proteína-proteína e alostéricas Ligante Effects
18 de fevereiro de 2014
Os protocolos aqui descrever os ensaios cinéticos de interações proteína-proteína com Bio-camada Interferometria. Tipo F ATP sintase, que está envolvida no metabolismo da energia celular, pode ser inibida pela sua subunidade ε em bactérias. Temos adaptado Bio-camada de interferometria para estudar as interacções do complexo catalítico com o domínio C-terminal do inibidor ε.
O objetivo geral do experimento a seguir é medir a cinética da proteína, as interações proteicas e os efeitos alostéricos de pequenos ligantes nessas interações usando interferometria de biocamada, BLI. Isso é conseguido preparando uma das proteínas com biotina específica e imobilizando-a na superfície do estreptococo. Biossensores revestidos Aden em paralelo.
Como segunda etapa, a proteína ligada ao sensor é exposta ao tampão contendo seu parceiro de ligação, e a ligação é medida em tempo real por seu efeito na interferência óptica na superfície do sensor. Em seguida, cada sensor é transferido para o tampão sem o parceiro de ligação, a fim de medir a dissociação em tempo real da proteína. Complexos proteicos.
Os resultados obtidos permitem determinar as constantes de taxa cinética de ligação e dissociação das proteínas que interagem e, portanto, sua afinidade de ligação. Outros resultados mostram que o BLI pode detectar os efeitos de pequenos ligantes na taxa de dissociação do complexo proteico-proteico. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a ressonância de plasma de superfície, é que o BLI não é excessivamente sensível a mudanças no índice de refração.
Portanto, as etapas de ligação e associação podem incluir mudanças em pequenos ligantes para testar seus efeitos nas interações proteína-proteína em tempo real, no entanto, esse método pode fornecer informações sobre a cinética da interação proteína-proteína. Também pode ser aplicado a diferentes combinações, como ligação de proteínas a DNA ou RNA imobilizado ou ligação de lipossomas a uma proteína imobilizada. Comece este experimento configurando o instrumento BLI conforme descrito no protocolo de texto.
Em seguida, configure o projeto experimental no software de aquisição de dados. Selecione novo experimento de cinética na guia do assistente de experimento. Isso apresenta um menu com guias com todas as etapas que devem ser definidas na guia um.
Defina as colunas a serem usadas. Na placa de amostra de 96 poços. Atribua colunas para conter o tampão, a proteína a ser imobilizada ou o parceiro de ligação.
Para cada associação, insira a concentração de parceiro vinculante a ser usado. Na guia dois, defina todas as etapas necessárias para o ensaio. Isso inclui associação de carga de linha de base e dissociação do parceiro de ligação.
As etapas individuais do ensaio são vinculadas a colunas de poços na placa de amostra, selecionando a etapa do ensaio e, em seguida, clicando duas vezes na respectiva coluna. Isso programa os sensores a serem movidos de uma coluna de poços para a próxima. Durante o ensaio, comece com uma breve etapa de linha de base ligada à primeira coluna de poços com tampão de ensaio para estabelecer sinais iniciais de BLI na placa de 96 poços.
Em seguida, vincule a etapa de carregamento aos poços que conterão a proteína biotinilada. Use a função de limite para obter um nível predeterminado de associação. Defina a opção de limite para que todos os sensores sejam movidos para a próxima coluna de poços.
Quando qualquer um dos sensores atingir o limite, inclua outra etapa de linha de base no buffer para lavar as proteínas biotiniladas não imobilizadas dos sensores e estabeleça novos sinais de linha de base estáveis para ensaios básicos para determinar as constantes globais de taxa de ligação e dissociação, incluindo uma etapa de linha de base extra com sensores em uma nova coluna de poços de buffer antes da associação. Passo a seguir, vincule a associação. Passo para a coluna de poços que contêm concentrações variadas do parceiro de ligação.
Ajuste o tempo do passo para que pelo menos uma concentração de saturação do parceiro de ligação atinja o sinal de ligação de equilíbrio. Para a etapa de dissociação, designe os sensores para retornar à coluna quatro, os mesmos poços de buffer usados para a linha de base extra antes da associação. Os tempos para as etapas de associação e dissociação podem ser ajustados durante o experimento se as taxas forem mais lentas ou mais rápidas do que o previsto.
Na guia três, indique os locais na bandeja do sensor que conterão sensores pré-umedecidos para o ensaio. A guia quatro permite a revisão gráfica do programa. Na guia cinco, insira os detalhes necessários, incluindo a localização dos arquivos de dados e a temperatura desejada.
Para o experimento. Umedeça previamente os sensores revestidos com estreptavidina por pelo menos 10 minutos. Para remover o revestimento protetor de sacarose, remova o sensor que contém o rack da bandeja do sensor e insira uma placa de 96 poços na parte inferior da bandeja, deslizando um canto da placa no entalhe de orientação na bandeja.
Para a coluna de sensores a ser usada, adicione 200 microlitros de tampão de ensaio por poço. Nessa coluna da placa de 96 poços, retorne o rack de sensores para a bandeja na orientação correta, conforme atribuído Durante a programação, encha os poços da placa de amostra com tampão de ensaio ou as diluições de proteína apropriadas. Evite introduzir bolhas, pois elas podem causar ruído no sinal óptico.
Inclua um ou mais alvéolos de referência que omitem a proteína biotinilada ou o parceiro de ligação. Abra a porta do instrumento e observe a saída de luz do braço do sensor. Insira a bandeja do sensor no palco com as guias das bandejas inseridas nos slots do palco.
Insira a placa de amostra no suporte da placa. Certifique-se de que a placa esteja assentada na horizontal e na orientação correta, conforme indicado no suporte da placa. Feche a porta e inicie o ensaio a partir do programa de aquisição de dados.
Se os sensores ainda precisarem de pré-umedecimento, selecione a opção para atrasar o início do experimento. Finalmente, quando toda a preparação da amostra estiver concluída e a placa de amostra e a bandeja do sensor estiverem carregadas no instrumento, clique no botão ir para executar o ensaio. Após a execução do ensaio, abra o software de análise de dados e carregue a pasta que contém os dados.
Clique na guia de processamento para ver um menu de processamento passo a passo e os dados cinéticos brutos com cada sensor atribuído a uma cor diferente na seleção de dados. Clique no botão de seleção do sensor no sample mapa da placa. Designe os poços para um ou dois sensores de controle como poços de referência no menu de processamento.
Marque a caixa de subtração e selecione os poços de referência para subtrair o sinal de referência de todos os outros sinais dos sensores. Alinhar todos os rastreamentos para Y é igual a zero usando a etapa do eixo Align Y. Em seguida, selecione a linha de base como a etapa de alinhamento para o intervalo de tempo.
Insira os últimos 10 segundos dessa linha de base. Clicar nessa etapa de linha de base mostrará o alinhamento. Em seguida, marque a caixa de correção entre etapas para minimizar as mudanças de sinal entre as etapas de associação e dissociação.
Selecione uma linha para linha de base ou dissociação. Selecione a função de filtragem KY gole na maioria dos casos e clique nos dados do processo para continuar inspecionando visualmente os dados finais do processo no painel inferior direito. Para analisar os dados, clique na guia de análise em análise de dados para a etapa de análise, escolha associação e dissociação.
Para modelo, selecione um para um para ajuste Escolha global. Para agrupar por cor selecionada, selecione r max desvinculado pelo sensor para permitir o ajuste independente da resposta máxima do sinal ao saturar a ligação do parceiro à proteína imobilizada. Por fim, clique em ajustar curvas para iniciar a análise de regressão não linear.
Examine os resultados do ajuste, que incluem sobreposição de curvas de regressão com traços de dados do sensor, gráficos de resíduos de ajuste e uma tabela com valores de parâmetros e estatísticas determinados. A cinética BLI de ligação e dissociação em tempo real é mostrada aqui. Este experimento foi iniciado com uma etapa de linha de base de 10 minutos, uma vez que os sensores foram pré-molhados, apenas brevemente, o épsilon biotinilado foi então carregado nos sensores.
Nenhuma dissociação detectável de épsilon ocorreu em todas as etapas restantes, conforme visto na curva de referência, que não teve nenhum parceiro de ligação adicionado. Um segundo sensor de referência era desprovido de uma proteína mobilizada e mostrou baixa ligação não específica do parceiro de ligação. Várias concentrações de F1 menos épsilon foram usadas na etapa de associação para os sensores de A a F, a fim de ajustar os resultados globalmente e obter os melhores valores para a constante de taxa de associação para a constante de taxa de associação e os resultados KD da constante de dissociação de equilíbrio foram processados, produzindo os traços de dados azuis.
Nesse caso, o traço do sensor de referência foi subtraído dos traços da amostra para corrigir a ligação não específica do parceiro de ligação e o desvio do sinal do sistema. Na etapa de análise de dados, todas as curvas foram ajustadas globalmente com um para um, um para um O ajuste global pressupõe a dissociação completa do parceiro de ligação.
Um experimento diferente é mostrado aqui no qual a enzima foi ligada ao épsilon imobilizado por sensor na presença de um milimolar, A-T-P-A-D-T-A. Isso predispõe a maioria dos complexos épsilon F1 a assumir a confirmação não inibitória, que se dissocia prontamente os sensores foram então movidos para poços de dissociação contendo tampão de ensaio com diferentes ligantes. Isso demonstra os efeitos de diferentes ligantes na confirmação do épsilon.
Por exemplo, a exposição ao magnésio A GP e fosfato diminuiu drasticamente a dissociação líquida, indicando que o épsilon mudou a confirmação para o estado inibitório fortemente ligado. Ao configurar os ensaios BLI pela primeira vez, é importante incluir controles para testar a ligação não específica da proteína aos sensores e se a ligação não específica varia significativamente com as concentrações de proteína a serem usadas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como projetar, programar e analisar ensaios BLI para medir a cinética das interações proteína-proteína e apreciar isso.
O BLI permite um teste direto para os efeitos de pequenos ligantes nas interações proteína-proteína.
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Visão Geral
Este artigo apresenta protocolos para medir interações proteína-proteína usando Interferometria de Camada de Bio (BLI). O foco está na interação entre a ATP sintase do tipo F e sua subunidade ε, que desempenha um papel no metabolismo energético em bactérias.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Bioquímica
- Interações de Proteínas
Fundamentos
- A ATP sintase do tipo F é crucial para a produção de energia celular.
- A subunidade ε pode inibir a atividade da ATP sintase.
- Entender essas interações é importante para obter insights sobre a regulação metabólica.
- A Interferometria de Camada de Bio permite a medição em tempo real dessas interações.
Propósito do Estudo
- Medir a cinética das interações proteína-proteína.
- Investigar os efeitos alostéricos de pequenos ligantes nessas interações.
- Adaptar o BLI para estudar o complexo catalítico da ATP sintase.
Métodos Utilizados
- Preparação de proteínas com biotina para imobilização.
- Uso de biossensores revestidos com estreptavidina para ensaios de ligação.
- Medição em tempo real de ligação e dissociação usando interferência óptica.
- Análise dos complexos proteicos formados durante a interação.
Principais Resultados
- Medição bem-sucedida da cinética de ligação entre a ATP sintase e sua subunidade ε.
- Dados em tempo real sobre a dissociação de complexos proteicos.
- Insights sobre a regulação alostérica da atividade da ATP sintase.
- Demonstração do BLI como uma ferramenta valiosa para estudar interações proteicas.
Conclusões
- O BLI é eficaz para estudar interações proteína-proteína.
- A interação entre a ATP sintase e sua subunidade ε é crítica para entender o controle metabólico.
- Estudos futuros podem se basear nesses métodos para explorar outras interações proteicas.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Bio-layer Interferometry (BLI) enables real-time kinetic analysis of protein-protein interactions and allosteric ligand effects, supporting target validation in antibacterial drug discovery. By measuring binding and dissociation rates of the ε subunit with ATP synthase catalytic complexes, BLI provides quantitative data to de-risk mechanistic hypotheses and prioritize lead compounds. This approach enhances predictive confidence in early discovery by linking ligand-induced conformational changes to functional inhibition of a clinically relevant target.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying how ligands shift ε subunit conformation between active and inhibitory states.
- Operational Value: Enables real-time monitoring of binding kinetics without label interference, reducing assay variability.
- Predictive Value: Supports target confidence by correlating ligand binding with functional outcomes in bacterial energy metabolism.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Measures association and dissociation rate constants to characterize binding affinity under physiologically relevant conditions.
- Operational Value: Tolerates varying buffer compositions, allowing screening of diverse ligand libraries without signal artifacts.
- Scalability: Compatible with 96-well formats for parallel evaluation of multiple ligand concentrations.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links in vitro binding data to bacterial-specific auto-inhibition mechanisms relevant to antibiotic development.
- Mechanistic De-risking: Clarifies allosteric regulation of ATP synthase, reducing ambiguity in target engagement strategies.
- Preclinical Alignment: Supports disease-relevant modeling by focusing on a validated antibacterial target (FDA-approved for tuberculosis).
Pipeline & Workflow Integration
BLI fits within the discovery continuum from target engagement assessment to lead optimization, particularly for antibacterial programs targeting energy metabolism.
- Discovery Biology: Tests target validity by measuring real-time kinetics of protein-protein interactions and ligand-induced conformational shifts.
- Screening: Delivers quantitative KD, kon, and koff values to support hit-to-lead progression and structure-activity relationship analysis.
- Analytics: Provides sensor-based optical interference readouts that enable global fitting and residual analysis for robust kinetic modeling.
- Translational Research: Connects biochemical mechanism to antibacterial phenotype through inhibition of a clinically validated target.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying protein-protein interactions across multiple targets and ligand classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target modulation by detecting allosteric effects of small ligands on protein complex stability.
- Operational Value: Ensures reproducibility through reference subtraction, baseline alignment, and inter-step correction during data processing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing kinetic thresholds for target engagement and ligand efficacy.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on binding kinetics and conformational selectivity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein biotinylation, streptavidin biosensor handling, and BLI instrument setup.
- Depends on access to multi-well plate readers with temperature control and real-time optical monitoring capabilities.
- Necessitates standardized workflows for sensor regeneration, reference well inclusion, and data subtraction to minimize noise.
- Involves optimization of association and dissociation timing based on ligand binding kinetics and complex stability.
- Limited by the need for immobilized binding partners, which may affect native protein conformation or accessibility.
