Interferometria Bio-layer para Medição Cinética de interações proteína-proteína e alostéricas Ligante Effects

O objetivo geral do seguinte experimento é medir a cinética de proteínas, interações entre proteínas e os efeitos alostéricos de ligantes pequenos sobre essas interações utilizando interferometria de camada biomolecular, BLI. Isso é alcançado preparando-se uma das proteínas com biotina específica e imobilizando-a na superfície de biossensores revestidos com estreptavidina em paralelo.

Como segundo passo, a proteína ligada ao sensor é exposta a um tampão contendo seu parceiro de ligação, e a ligação é medida em tempo real pelo seu efeito na interferência óptica na superfície do sensor. Em seguida, cada sensor é transferido para um tampão sem o parceiro de ligação, a fim de medir a dissociação em tempo real da proteína. Complexos proteicos.

Os resultados obtidos permitem a determinação das constantes cinéticas de ligação e dissociação das proteínas interagentes e, portanto, sua afinidade de ligação. Outros resultados mostram que a BLI pode detectar os efeitos de ligantes pequenos na taxa de dissociação do complexo proteína-proteína. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a ressonância de plasmones de superfície, é que a BLI não é excessivamente sensível a alterações no índice de refração.

Assim, as etapas de ligação e associação podem incluir alterações em ligantes pequenos para testar seus efeitos nas interações proteína-proteína em tempo real. No entanto, este método pode fornecer informações sobre a cinética da interação proteína-proteína. Também pode ser aplicado a diferentes combinações, como a ligação de proteínas ao DNA ou RNA imobilizados, ou a ligação de lipossomos a uma proteína imobilizada. Inicie este experimento configurando o instrumento de BLI conforme descrito no protocolo textual.

Em seguida, configure o delineamento experimental no software de aquisição de dados. Selecione um novo experimento de cinética na guia do assistente de experimento. Isso exibe um menu com abas contendo todos os passos que devem ser definidos na primeira aba.

Defina as colunas a serem utilizadas na placa de amostras de 96 poços. Atribua colunas para conter tampão, a proteína a ser imobilizada ou o parceiro de ligação.

Para cada associação, inseriremos a concentração do parceiro de ligação a ser utilizada. Na guia dois, defina todos os passos necessários para o ensaio. Estes incluem o carregamento do valor inicial, associação e dissociação do parceiro de ligação.

Os passos individuais do ensaio são vinculados às colunas de poços na placa de amostra mediante a seleção do passo do ensaio e, em seguida, o clique duplo na coluna respectiva. Isso programa os sensores para serem movidos de uma coluna de poços para a próxima. Durante o ensaio, inicie com um breve passo de linha de base vinculado à primeira coluna de poços com tampão de ensaio, a fim de estabelecer os sinais iniciais de BLI na placa de 96 poços.

Em seguida, vincule a etapa de carregamento aos poços que conterão a proteína biotinilada. Utilize a função de limite para atingir um nível predeterminado de ligação. Configure a opção de limite para que todos os sensores sejam movidos para a próxima coluna de poços.

Quando qualquer um dos sensores atingir o limite, inclua um passo adicional de linha de base no tampão para remover as proteínas biotiniladas não imobilizadas dos sensores e estabelecer novos sinais estáveis de linha de base. Para ensaios básicos destinados a determinar as constantes globais de ligação e dissociação, inclua um passo adicional de linha de base com os sensores em uma nova coluna de poços contendo tampão antes da fase de associação. Em seguida, prossiga para a etapa de associação, movendo os sensores para a coluna de poços que contêm concentrações variáveis do parceiro de ligação.

Ajuste o tempo do passo para que pelo menos uma concentração saturante do parceiro de ligação alcance o sinal de equilíbrio de ligação. Para a etapa de dissociação, designe os sensores para retornar à coluna quatro, os mesmos poços de tampão utilizados para a linha de base adicional antes da associação. Os tempos das etapas de associação e dissociação podem ser ajustados durante o experimento se as taxas forem mais lentas ou mais rápidas do que o previsto.

No terceiro separador, indique as posições na bandeja do sensor que conterão sensores pré-umedecidos para o ensaio. O quarto separador permite a revisão gráfica do programa. No quinto separador, insira os detalhes necessários, incluindo a localização dos arquivos de dados e a temperatura desejada.

Para o experimento. Umedeça previamente os sensores revestidos com estreptavidina por pelo menos 10 minutos. Para remover o revestimento protetor de sacarose, retire da bandeja de sensores a grade contendo os sensores e insira uma placa de 96 poços na parte inferior da bandeja, deslizando um canto da placa para dentro do entalhe de orientação na bandeja.

Para a coluna de sensores a ser utilizada, adicione 200 microlitros de tampão de ensaio por poço. Nessa coluna da placa de 96 poços, devolva o suporte de sensores à bandeja na orientação correta conforme atribuída durante a programação. Preencha os poços da placa de amostras com tampão de ensaio ou com as diluições apropriadas de proteína. Evite introduzir bolhas, pois elas podem causar ruído no sinal óptico.

Inclua um ou mais poços de referência que omitam a proteína biotinilada ou o parceiro de ligação. Abra a porta do instrumento e observe a saída de luz do braço do sensor. Insira a bandeja do sensor sobre a plataforma, com as abas da bandeja encaixadas nas ranhuras da plataforma.

Insira a placa de amostra no suporte para placas. Certifique-se de que a placa esteja assentada plana e na orientação correta, conforme indicado no suporte. Feche a porta e inicie o ensaio pelo programa de aquisição de dados.

Se os sensores ainda exigirem pré-umedecimento, selecione a opção para atrasar o início do experimento. Por fim, quando toda a preparação da amostra estiver concluída e tanto a placa de amostra quanto a bandeja de sensores estiverem carregadas no instrumento, clique no botão iniciar para executar o ensaio. Após a execução do ensaio, abra o software de análise de dados e carregue a pasta que contém os dados.

Clique na guia de processamento para visualizar um menu de processamento passo a passo e os dados cinéticos brutos, com cada sensor atribuído a uma cor diferente em seleção de dados. Clique no botão de seleção de sensor no mapa da placa de amostras. Designe os poços para um ou dois sensores de controle como poços de referência no menu de processamento.

Marque a caixa de subtração e selecione os poços de referência para subtrair o sinal de referência do sinal de todos os outros sensores. Alinhe todos os traços a Y igual a zero utilizando o passo de alinhamento do eixo Y. Em seguida, selecione linha de base como o passo de alinhamento para o intervalo de tempo.

Digite os últimos 10 segundos daquela linha de base. Clicar dentro desse passo da linha de base mostrará o alinhamento. Em seguida, marque a caixa de correção interpasso para minimizar as variações de sinal entre os passos de associação e dissociação.

Selecione uma linha para linha de base ou dissociação. Na maioria dos casos, selecione a função de filtragem KY gole e clique em processar dados para prosseguir com a inspeção visual dos dados processados finais no painel inferior direito. Para analisar os dados, clique na guia análise em análise de dados para a etapa a ser analisada, escolha associação e dissociação.

Para o modelo, selecione um a um para o ajuste. Escolha global. Para agrupar, selecione cor e escolha r máx desvinculado por sensor para permitir o ajuste independente da resposta máxima de sinal na ligação saturante do parceiro à proteína imobilizada. Por fim, clique em ajustar curvas para iniciar a análise de regressão não linear.

Examine os resultados do ajuste, que incluem a sobreposição de curvas de regressão com os traços dos dados do sensor, gráficos dos resíduos do ajuste e uma tabela com os valores dos parâmetros determinados e as estatísticas. Aqui são mostradas as cinéticas BLI de ligação e dissociação em tempo real. Este experimento foi iniciado com um passo de linha de base de 10 minutos, já que os sensores tinham sido previamente umedecidos brevemente; em seguida, o épsilon biotinilado foi carregado nos sensores.

Nenhuma dissociação detectável de épsilon ocorreu durante todas as etapas restantes, conforme observado na curva de referência, à qual não foi adicionado nenhum parceiro de ligação. Um segundo sensor de referência não continha proteína mobilizada e mostrou baixa ligação não específica do parceiro de ligação. Várias concentrações de F1 menos épsilon foram utilizadas na etapa de associação para os sensores de A a F, a fim de ajustar os resultados globalmente e obter os melhores valores para a constante de taxa de associação e a constante de dissociação no equilíbrio KD; os resultados foram processados, gerando os traços de dados em azul.

Neste caso, o traço do sensor de referência foi subtraído dos traços da amostra para corrigir a ligação não específica do parceiro de ligação e a deriva do sinal do sistema. Na etapa de análise dos dados, todas as curvas foram ajustadas globalmente com um modelo de um para um. O ajuste global assume a dissociação completa do parceiro de ligação.

Um experimento diferente é mostrado aqui, no qual a enzima foi ligada ao épsilon imobilizado no sensor na presença de um milimolar de A-T-P-A-D-T-A. Isso predispõe a maioria dos complexos F1-épsilon a assumir a conformação não inibitória, que se dissocia prontamente. Os sensores foram então movidos para poços de dissociação contendo tampão do ensaio com diferentes ligantes. Isso demonstra os efeitos de diferentes ligantes sobre a conformação do épsilon.

Por exemplo, a exposição ao magnésio A GP e ao fosfato reduziu drasticamente a dissociação líquida, indicando que a épsilon mudou para a conformação do estado inibitório fortemente ligado. Ao configurar os ensaios de BLI pela primeira vez, é importante incluir controles para testar a ligação não específica da proteína aos sensores e verificar se essa lig游戏副本

BLI permite um teste direto dos efeitos de ligantes pequenos sobre as interações entre proteínas.