Nucleosídeos Trisfosfatos - Da síntese à Caracterização Bioquímica

O objetivo geral deste vídeo é demonstrar o procedimento desde a síntese dos fosfatos nucleosídeos modificados até sua caracterização bioquímica completa. Isso é feito primeiro convertendo o precursor de nucleosídeo adequadamente protegido no trifosfato correspondente pela aplicação de um procedimento de quatro etapas de um pote. O segundo passo consiste em purificar o trifosfato resultante primeiro por precipitação e depois por cromatografia líquida de alta resolução de fase inversa.

Em seguida, o análogo de trifosfato é caracterizado por ressonância magnética nuclear e tempo de ionização de dessorção a laser assistido por matriz ou RMN e maloff para garantir alta pureza. A etapa final são as reações de extensão do primer e as reações de polimerização da desoxinucleotídeo transferase terminal ou TDT. Em última análise, os produtos da reação e, portanto, a aceitação do substrato do trifosfato são analisados por eletroforese em gel.

A vantagem deste método em comparação com outras estratégias sintéticas, como a abordagem Borge, é que menos produtos secundários estão sendo formados e, portanto, a purificação é mais fácil. Geralmente, os indivíduos novos nessa técnica terão dificuldades, pois é um procedimento bastante demorado e intrincado que requer conhecimento em vários campos. Tivemos a ideia de que esse método fosse filmado pela primeira vez quando sintetizamos fosfatos modificados e achamos bastante desafiador encontrar um procedimento detalhado.

Outra vantagem desse método é que ele pode ser usado para abordar outras questões no campo dos ácidos nucléicos modificados. Na verdade, ele pode ser usado para selecionar enzimas de DNA que catalisam uma ampla gama de reações. Além disso, este método pode ser usado para a marcação funcional de ácidos nucléicos.

A demonstração visual deste método é crítica, pois as etapas de síntese e purificação são difíceis de aprender porque os trifosfatos são derivados polares e ativados que devem ser manuseados com cuidado. Para começar a coevaporar o nucleosídeo adequadamente protegido com hidroxila de três primers duas vezes com dois mililitros de purina anidra antes de secar sob vácuo durante a noite. Ao mesmo tempo, o pirofosfato de amônio seco sob vácuo durante a noite no dia seguinte dissolveu o nucleosídeo em um mínimo de 200 microlitros de piridina seca.

Em seguida, adicione 400 microlitros de dioxano seco como solvente COS. Por fim, adicione o fósforo cíclico três derivado e deixe-o reagir à temperatura ambiente por 45 minutos. Em seguida, prepare uma solução de pirofosfato de butilamônio seco em 170 microlitros de dimetilformamida seca e 58 microlitros de tributilalamina recém-destilada.

Adicionar a solução resultante à mistura de reacção e deixar reagir à temperatura ambiente durante 45 minutos. Em seguida, prepare uma solução de iodo 160 micromolar em 980 microlitros de purina e 20 microlitros de água. Adicione a solução à mistura de reação.

Para oxidar o centro de fósforo alfa. Deixe a solução escura resultante mexer em temperatura ambiente por 30 minutos. Use uma solução aquosa a 10% de tiossulfato de sódio para saciar o excesso de iodo.

Remova o solvente sob vácuo. Em seguida, adicione cinco mililitros de água e deixe a mistura repousar em temperatura ambiente por 30 minutos para hidrolisar o trifosfato cíclico. Nesta fase, os grupos protetores geralmente são removidos.

Consequentemente, adicione 30% de hidróxido de Imodium à amostra bruta. Mexa por 1,5 horas em temperatura ambiente antes de remover o solvente sob vácuo. Em seguida, adicione dois mililitros de água e divida a mistura em tubos tubulares.

Adicione 12 mililitros de uma solução a 2% de sódio por clorato em acetona e centrifugue por 30 minutos antes de repetir o procedimento. Mais uma vez. Os reagentes usados na síntese do trifosfato precipitarão formando um resíduo oleoso e permitindo a separação dos solventes, simplificando assim substancialmente a purificação por HPLC de fase reversa subsequente após a secagem ao ar do resíduo oleoso.

Registar um espectro de RMN P 31 da amostra bruta de acordo com procedimentos normalizados. Após a RMN, dissolveu o resíduo oleoso em quatro mililitros de água destilada. Inicie a purificação por HPLC com a preparação de bicarbonato de trietil amônio 50 milimolar em água ultrapura como EENT A e em 50% de acetil nitrilo como eent B, conforme detalhado no protocolo de texto, desgaseifique ambos os EENT sob vácuo e agitando por 20 minutos.

Preparar uma amostra analítica dissolvendo 10 microlitros do trifosfato bruto em 300 microlitros de água destilada. Em seguida, usando um gradiente que varia de 0%B a 100%B em 40 minutos. Injectar a amostra num sistema de HPLC equipado com uma coluna semi-preparativa inversa da fase C 18

Ajustar o programa de HPLC de acordo com o tempo de retenção do trifosfato e do difosfato. Purifique a mistura bruta usando essas condições e, removendo as frações iniciais que podem conter algum difosfato, combine todas as frações que contêm o produto e liofilize. Em seguida, co-evaporar várias vezes com água ultrapura.

Avaliar a pureza do trifosfato por RMN e maloff pela aplicação de protocolos padrão. Os rendimentos típicos obtidos pela aplicação deste protocolo estão na faixa de 30 a 70%, dependendo do substrato para cinco primos e rotulagem do primer. Misture o primer e os reagentes conforme detalhado no protocolo de texto e incube a reação de marcação a 37 graus Celsius por 30 minutos.

Durante a reação de rotulagem, prepare uma coluna de cidex G 10 conectando uma ponta de pipeta de um mililitro com lã de vidro siloizada e enchendo a ponta com solução G 10. Gire e lave três vezes com 500 microlitros de água bidestilada e uma lavagem final com 50 microlitros de água bidestilada Após a incubação da reação de marcação, o calor desativa a quinase por 10 minutos a 70 graus Celsius.

Em seguida, passe a mistura de reação pelo G 10. Para remover o gel de marcação radioativa livre, purifique o primer marcado com rádio e recupere pela aplicação do método de esmagamento e imersão, precipitado de etanol e G 10 dessaliniza o oligonucleotídeo iludido. Para a reação de extensão do primer, combine um mol PICA de primer radiomarcado, P um 10 moles PICA de primer, P um e 10 moles PICA de molde, T um em 10 x tampão de reação e ajoelhe-se em água quente.

Em seguida, esfrie gradualmente até a temperatura ambiente por mais de 45 minutos. Coloque o tubo no gelo e adicione o fosfato de nucleosídeo ou o coquetel DNTP e uma unidade de gelo da DNA polimerase. Complete a reação com água para um volume total de 20 microlitros, incube na temperatura ideal de trabalho da enzima.

Em seguida, adicione 20 microlitros de solução de parada e aqueça as amostras a 95 graus Celsius por cinco minutos. Esfrie, as amostras desçam a zero graus Celsius. Antes de resolver por eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante.

Visualize as bandas por termovisor de fosfato para polimerização de TDT, dilua o primer não marcado de fita simples P dois e o primer marcado com rádio em um microlitro de tampão TDT. Coloque o tubo no gelo e adicione o coquetel DNTP e a polimerase TDT e incube a 37 graus Celsius por uma hora. Após a incubação, adicione 10 microlitros da solução de parada antes de aquecer as amostras a 95 graus Celsius por cinco minutos e, em seguida, esfriar a zero graus Celsius.

Depois de resolver a amostra por eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante, visualize as bandas usando um gerador de imagens de fosfo. Aqui é mostrado um espectro típico de RMN P 31 bruto de um DNTP modificado, onde os sinais característicos dos centros de fósforo podem ser observados. Além disso, sinais provenientes do lado do difosfato e do monofosfato.

Produtos com fosfatos mais altos são sempre observados nesta fase. A análise por HPLC de fase reversa da mistura bruta é mostrada aqui. O pico principal corresponde aos cinco fosfatos primos, enquanto o principal subproduto, o difosfato cinco primos, apresenta um tempo de retenção ligeiramente menor.

Finalmente, após uma fase reversa completa, purificação por HPLC, o DNTP modificado é caracterizado por NMR e maldi para mostrado aqui é o espectro maloff do sulfado O aduto de sódio pode ser visto com sobrecarga de massa de 712,54, e nenhum traço de difosfato está presente. Tanto o P 31 NMR quanto os espectros de NMR de prótons são cruciais para avaliar a pureza do dps modificado.

Uma vez que a presença de corante indesejado e monofosfatos fornece sinais distintos ilustrados, aqui está o resultado das reações de extensão primária com DUTP modificado com trans prolina, DATP modificado com histamina e DCTP modificado com ácido valérico usado como modificações isoladas como combinações de dois DPS DN modificados ou juntos, junto com um DGTP natural solitário. Finalmente, reações de polimerização mediadas por TDT representativas com diferentes análogos de DUTP modificados foram analisadas com eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante. Nesse contexto, o DUTP modificado com cis prolina e o DUTP modificado com peptídeo são os melhores substratos para TDT.

Uma vez que as eficiências de rejeito são comparáveis ou excedem as do DTTP natural, o DUTP modificado com ureia é um substrato bastante pobre neste contexto. Uma vez que pouco polidisperso, oligonucleotídeos de tamanho mais longo podem ser observados Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cerca de uma semana se for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante ter em mente que os fosfatos cítricos nucleares são os blocos de construção ativados pela natureza e, portanto, deve-se ter cuidado ao manuseá-los depois de criados.

Pesquisadores na área de ácidos nucléicos usam esse método para explorar seleções combinatórias para gerar abers modificados e ácidos nucléicos catalíticos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como sintetizar e caracterizar fosfatos modificados usando o procedimento pop de quatro etapas, seguido de purificação por HPLC de fase reversa e reações de extensão primária. Alguns detalhes experimentais que normalmente não são encontrados em seções experimentais se tornarão aparentes.

Este método pode ser usado em combinação com outras técnicas, como PCR, para responder a perguntas adicionais. De fato, pode ser usado para avaliar a compatibilidade de trifosfatos modificados com métodos de seleção in VIO.