Name: Uma In vivo A reticulação Abordagem para isolar Complexos de proteínas a partir de Drosophila Os embriões (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-23T21:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Aprenda a isolar complexos proteicos de embriões de Drosophila usando reticulação in vivo com formaldeído. Este método captura interações proteicas transitórias essenciais para funções celulares.

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Agradecemos Jordan Davis, Yanyan Lin, Eric Schadler e Jimiao Zheng por sua ajuda técnica com este estudo. Este trabalho foi financiado pela NSF CARREIRA conceder MCB-1054962 para ALA

1. Preparando grandes da Apple Juice Placas-ágar <ol><li> Para fazer quatro placas, adicionar 375 ml de H 2 O, 11,25 g de agar mosca e uma barra de agitação para um balão de 1000 ml. Este é Mix A. Autoclave Mix Um frasco com a tampa solta tampado em um ciclo de 30 min-esterilização para produtos líquidos. </li><li> Adicione 125 ml de suco de maçã, 12,5 g de açúcar de mesa e uma barra de agitação para um copo de 500 ml. Esta mistura é B. Calor mistura B numa plataforma aquecida enquanto se agita e mantém a temperatura a cerca de 70 ° C até que a autoclave de mistura A é terminado. </li><li> Após a conclusão da Mix A autoclavagem, transferir Mix B para A. Misture Continue mexendo a mistura combinada com cuidado e deixe esfriar por 15 min. Evitar a sobre-arrefecimento e a solidificação de agar resultou antes da adição de conservante. </li><li> Adicione 10% (peso / volume) de solução de metil 4-hidroxibenzoato de metilo em etanol. Isto irá actuar como um conservante. Adicionar 3,75 mL da solução para a mistura de sumo de maçã-agar acima. Continue mexendo por another 5 min. </li><li> Despeje 125 ml mistura de suco de maçã-agar com conservante em cada 300 cm 2 de plástico ou placa de isopor. Deixe esfriar para RT e solidificar. Evite a formação de bolhas de ar ao derramar. Nota: As placas-ágar suco de maçã está pronto para usar imediatamente. Cobrir as placas não utilizadas com envoltórios claras e armazenar a 4 ° C durante até uma semana. </li></ol> 2. Colheita de embriões Drosophila e Tratamento de pré-reticulação <ol><li> Coloque uma gaiola população com cerca de 40.000 a 50.000 moscas a partir do qual os embriões serão coletados. </li><li> Faça duas placas, cada uma contendo 125 ml de farinha de milho-padrão médio melaço 12 e polvilhe aproximadamente 4 g de fermento de padeiro seco em cada placa. Coloque estas placas na gaiola população em uma incubadora a 25 ° C por 48 horas para engordar as moscas. </li><li> Aqueça 2 maçã placas suco-ágar a 25 ° C. Polvilhar aproximadamente 1 g de levedura de padeiro seca em cadaprato. Coloque as duas placas na gaiola população para começar a coletar 0-1 embriões hr de idade. </li><li> Retire das placas no final da recolha de 1 hora. Substitua com 2 placas novas, se for necessário mais uma rodada de coleta. </li><li> Adicionar água suficiente para cobrir as placas e ressuspender os embriões suavemente com um pincel fino. Despeje os embriões ressuspensão através de uma peneira de duas camadas feitas de malha de arame de aço inoxidável. Nota: A camada superior é feita de tamanho de poros médio (850 mm) de malha que reúne grande parte da mosca, deixando através de embriões. A camada inferior é feita de malha fina (75 mm) que recolhe embriões, deixando através de levedura e água. </li><li> Use o pincel fino tinta para transferir os embriões coletados em uma cesta coleção feita com um tubo de 50 ml e de malha fina de nylon. Lavar os embriões brevemente com água, em seguida, seque a malha em papel toalha para secar. </li><li> Mergulhe os embriões em 50% água sanitária com agitação suave por 3 min. Enxágüe completaly com água para remover qualquer remanescente de branqueamento. Blot a malha em papel toalha para secar. </li><li> Mergulhe os embriões dechorionated em isopropanol com agitação suave durante 15 segundos ou até que a quebra de aglomerados multi-embrião (isso não deve demorar mais do que 30 segundos). Blot a malha em papel toalha para secar completamente. </li><li> Mergulhe os embriões em heptano por 5 minutos enquanto estiver usando uma pipeta para transmitir heptano sobre os embriões para mantê-los ressuspenso. Blot a malha em papel toalha para secar. </li><li> Lavar os embriões com fluxos de fosfato salino tamponado, pH 7,4 (PBS) contendo 0,1% de Triton X-100 (PBST) durante 3 min. </li><li> Desmontar o cesto de recolha e transferência de embriões, juntamente com a malha para um tubo de 15 ml contendo 10 ml de PBST. Inverter o tubo suavemente para lavar os embriões fora da malha. </li><li> Retirar a malha do tubo. Colocar o tubo na posição vertical, e deixar os embriões afundar para o fundo do tubo por gravidade. Nota: Cerca de 100-300mL de embriões é esperado para uma coleção de 1 hora a partir de uma gaiola. </li><li> Remover o PBST e continuar a realizar a reticulação imediatamente. </li></ol> 3. In vivo A reticulação dos embriões colhidos <ol><li> Prepare a 0,2% de formaldeído em PBST imediatamente antes da utilização. Adicionar 10 ml de formaldeído para o fixador os embriões e incubar a 25 ° C com agitação suave num agitador rotativo durante 10 min. Descarte fixador não utilizados até o final do dia. </li><li> Extingue-se a reacção de reticulação <ol><li> No final da reticulação, deixar os embriões afundar para o fundo do tubo. </li><li> Remover a solução de formaldeído. Imediatamente adicionar 10 ml de 0,25 M de glicina em PBST para extinguir a reacção de reticulação. Incubar a 25 ° C com agitação suave num agitador rotativo, durante 5 min. </li><li> Deixe os embriões afundar para o fundo do tubo. Remover a solução de resfriamento. Lavar os embriões com 10 mL de PBST três vezes. </li><li> Remover completamente o PSolução de lavagem BST com uma pipeta. Armazenar embriões a -80 ° C até à sua utilização. </li></ol></li></ol> 4. Proteína Preparação de Amostras e Immunoprecipitation <ol><li> Homogeneizar 500 ul embriões reticulados utilizando um homogeneizador Dounce, em 2 ml de tampão de lise (0,5 M de ureia, 0,01% de SDS, 2% de Triton-X 100, fluoreto de fenilmetanossulfonilo 2 mM [FPMS], e cocktail inibidor de protease em PBS). Nota: Execute este e os seguintes passos na RT, a menos que especificado em contrário. </li><li> Transferir o lisado para tubos de 1,5 ml de centrífuga e agitar suavemente sobre uma plataforma rotativa durante 15 minutos para assegurar a lise completa. Centrifuga-se o lisado a 16.000 x g durante 5 min para sedimentar os detritos celulares. Salve o sobrenadante em um tubo de 15 ml limpo. </li><li> Adicionar 40 ul de contas de agarose anti-HA lama para o sobrenadante e incubar numa plataforma rotativa durante 2,5 horas. </li><li> Sedimentar as pérolas por centrifugação a 2500 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante, mas deixar adeximately 250 mL no tubo. Ressuspender as esferas no sobrenadante remanescente e transferidos para uma coluna de centrifugação de 1,5 ml com 10 mM de filtro poroso. </li><li> Centrifugar a coluna girar a 12.000 xg por 10 segundos e descartar o fluxo através. </li><li> Lave os grânulos por adição de 200 ul de tampão de lavagem (0,1 M de glicina, 1 M de NaCl, 1% IGEPAL CA-630, 0,1% de Tween-20, em PBS). Centrifugar a coluna a 12.000 xg por 10 segundos e descartar a lavagem. Repita a lavagem mais duas vezes. </li><li> Adicionar 40 ul de tampão de eluição (2 mg / ml de HA-péptido em PBS) às pérolas e incubar a 37 ° C durante 15 min com agitação suave a cada 5 min. Centrifugar a 12000 xg durante 10 seg e recolher o eluato. </li><li> Confirmar eluição do complexo por análise de Western-blot, utilizando um anticorpo anti-HA 13. </li></ol>

<ol><li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome research. 22, 1813-1831 (2012).</li>
<li>Murigneux, V., Sauliere, J., Roest Crollius, H., Le Hir, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+identification+of+RNA+binding+sites+by+CLIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide identification of RNA binding sites by CLIP-seq.</a> Methods. , (2013).</li>
<li>Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+formaldehyde+cross-linking+and+mass+spectrometry+in+the+study+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+mass+spectrometry+%3A+JMS%22%5BJournal%5D)">Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions.</a> Journal of mass spectrometry : JMS. 43, 699-715 (2008).</li>
<li>Creed, T. M., Loganathan, S. N., Varonin, D., Jackson, C. A., Arkov, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+role+of+specific+Tudor+domains+in+Tudor-Aubergine+protein+complex+assembly+and+distribution+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Novel role of specific Tudor domains in Tudor-Aubergine protein complex assembly and distribution during Drosophila oogenesis.</a> Biochemical and biophysical research communications. 402, 384-389 (2010).</li>
<li>Arkov, A. L., Wang, J. Y., Ramos, A., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Tudor+domains+in+germline+development+and+polar+granule+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The role of Tudor domains in germline development and polar granule architecture.</a> Development. 133, 4053-4062 (2006).</li>
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<li>Thomson, T., Liu, N., Arkov, A., Lehmann, R., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+new+polar+granule+components+in+Drosophila+reveals+P+body+and+ER+associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+development%22%5BJournal%5D)">Isolation of new polar granule components in Drosophila reveals P body and ER associated proteins.</a> Mechanisms of development. 125, 865-873 (2008).</li>
<li>Vasilescu, J., Guo, X., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protein-protein+interactions+using+in+vivo+cross-linking+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of protein-protein interactions using in vivo cross-linking and mass spectrometry.</a> Proteomics. 4, 3845-3854 (2004).</li>
<li>Klockenbusch, C., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+formaldehyde+cross-linking+for+protein+interaction+analysis+of+non-tagged+integrin+beta1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1.</a> J Biomed Biotechnol. 2010, 9275-9285 (2010).</li>
<li>Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+cross-linking+method+for+identification+of+NF-kappaB+gene+network+by+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 39, 715-725 (2005).</li>
<li>Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dual+cross-linking+for+identification+of+indirect+DNA-associated+proteins+by+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 41, 694(2006).</li>
<li>Liu, N., Dansereau, D. A., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+facets+interacts+with+vasa+in+the+Drosophila+pole+plasm+and+protects+it+from+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Fat facets interacts with vasa in the Drosophila pole plasm and protects it from degradation.</a> Current biology : CB. 13, 1905-1909 (2003).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O formaldeído foi utilizada como um reagente de ligação cruzada para a identificação da proteína-proteína e interacções proteína-ácido nucleico. A sua boa solubilidade e permeabilidade da membrana da célula, juntamente com a compatibilidade com os procedimentos de espectrometria de massa a jusante, fazer formaldeído um agente candidato ideal para aplicações de reticulação intracelulares 3,15-17. Em particular, foi utilizado com sucesso para identificar mRNAs associados com vasa, uma helicase de ARN de células...

Isolamento de conjuntos de proteínas de subunidades múltiplas e complexos de ADN ou ARN-proteína é realizada para identificar complexos proteicos, locus genómico reconhecidos pelas proteínas reguladoras de ligação de ADN ou de ARN alvos de proteínas de ligação a ARN. Diferentes métodos permitem a identificação do genoma de sites de DNA reconhecidos por fatores de transcrição ou proteínas da cromatina (Chip-seq) 1 e metas de RNA associadas a uma determinada proteína de ligação de RNA (CLIP-seq) 2. As bibliotecas do ADNc derivado de ARN-ou alvos de DNA são então profundamente sequenciado. Estes métodos utilizam química ou reticulação para estabilizar os complexos seguido por imunoprecipitação (IP), com um anticorpo contra um componente proteico do complexo estudado induzida por UV. Durante o desenvolvimento de um organismo, muitos complexos de proteínas formam transitoriamente. Portanto, é essencial analisar a composição e função dos complexos in vivo para compreender os mecanismos moleculares que controlam devolvimento. Tal análise in vivo seria superior à abordagem in vitro, uma vez que é virtualmente impossível reproduzir concentrações nativas dos componentes que interagem e ambiente bioquímico celular in vitro. Aqui demonstramos uma abordagem in vivo que utilizam com sucesso para isolar grandes complexos de proteínas a partir de embriões de Drosophila. Neste método, os complexos de proteína em embriões vivos são reticulados com um baixo teor de formaldeído e, subsequentemente, os complexos de proteína de interesse é isolado por IP com um anticorpo contra um componente conhecido dos complexos, seguida de purificação em gel dos complexos e análise de espectrometria de massa para identificar componentes complexos desconhecidos. Uma vez que o formaldeído é capaz de permear a membrana celular e possui um intervalo de reticulação de 2,3-2,7 Å 3, complexos de proteína, pode ser reticulado in vivo, e os componentes do complexo são susceptíveis de estar perto um do outro. Neste artigo,descrever este método usando o isolamento de Tudor (Tud) complexo de proteína como um exemplo. Tud é uma proteína da linha germinativa, que é essencial para o desenvolvimento da linha germinativa 4-7. Esta proteína contém 11 domínios TuD conhecidas por interagirem com argininas metiladas ou lisinas de outros polipeptídeos 8-10. Anteriormente, têm gerado uma linha de Drosophila transgênica que expressa HA-marcado funcional Tud 5 e, portanto, o anticorpo anti-HA específico é utilizado para puxar para baixo complexo Tud após reticulação. Em adição a ligações cruzadas de proteína-proteína, o formaldeído pode gerar ácido nucleico ligações cruzadas em proteína e é usado em experiências de ChIP-seq. Além disso, em Drosophila, in vivo, de ligação cruzada com formaldeído, permitiu a identificação de um alvo de ARN da proteína helicase vasa ARN 11. Enquanto neste artigo descrevemos um método para a reticulação vivo e purificação de complexos de proteínas a partir de embriões de Drosophila, este método pode ser adaptado para outros organismos e os tecidos.

<table><tbody><tr><td>Drosophila</td><td>ágar Lab Scientific (http://www.labscientific.com/)</td><td>FLY-8020-1</td><td>Não autoclave a mistura de água e ágar por um período prolongado de tempo, pois isso fará com que as placas de suco de maçã se tornem frágeis</td></tr><tr><td>Metil 4-hidroxibenzoato</td><td>Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td><td>H5501</td><td>Outro nome: TEGOSEPT</td></tr><tr><td>Gaiola populacional</td><td>Flystuff ( http://www.flystuff.com/)</td><td>59-104</td><td></td></tr><tr><td>Malha de nylon fina</td><td>Flystuff (http://www.flystuff.com/)</td><td>57-102</td><td>Ao fazer a cesta de coleta, corte a malha um pouco maior do que a abertura da tampa do tubo de falcão para garantir uma vedação firme</td></tr><tr><td>Homogeneizador Dounce</td><td>Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td><td>D8938-1SET</td><td>Resfrie o homogeneizador no gelo e pré-enxágue com tampão de lise fria antes de usar para prevenir a degradação da proteína</td></tr><tr><td>Coquetel inibidor de protease&nbsp;</td><td>Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa)</td><td>4693132001</td><td>PBS pode ser usado para preparar solução estoque concentrada de inibidor de protease</td></tr><tr><td>Contas de agarose anti-HA</td><td>MBL international (http://www.mblintl.com/)</td><td>561-8</td><td>O kit também inclui colunas de peptídeo HA e colunas</td></tr><tr><td>de spin Peptídeo HA</td><td>MBL international (http://www.mblintl.com/)</td><td>561-8</td><td>Prepare para 2 mg/ml com PBS&nbsp;</td></tr><tr><td>Coluna de fiação</td><td>MBL international (http://www.mblintl.com/)</td><td>561-8</td><td>As colunas de fiação estão incluídas como parte do kit</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td></td><td></td>BP26324</tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Heptano</td><td>Fisher Científico (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>H350-4</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html)</td> <td>AM9625</td><td>Diluir de 10X a 1X com água nanopura antes do uso</td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>BioRad (www.bio-rad.com/&lrm;)</td><td>161-0724</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>BioRad (www.bio-rad.com/&lrm;)</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>Uréia</td><td>BioRad (www.bio-rad.com/&lrm;)</td><td>161-0730</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreto de fenilmetanossulfonilo</td><td>Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td><td>P7626-1G</td><td>Prepare a solução-mãe de 200 mM em isopropanol e dilua até a concentração de trabalho de 2 mM em tampão de lise</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td><td>I8896-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 15 ml</td><td>USA Scientific (http://www.usascientific.com/)</td><td>1475-0511</td><td></td></tr><tr><td>Alvejante</td><td>Marca</td><td></td> Clorox <td>Diluir com igual volume de água nanopura para fazer 50% de alvejante</td></tr><tr><td>Tubos de 50 ml</td><td>BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp)</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Peneira de camada superior</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>04-884-1AK</td><td></td></tr><tr><td>Peneira inferior</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>04-884-1BA</td><td></td></tr></tbody></table>

uma in vivo a reticulação abordagem para isolar complexos de proteínas a partir de drosophila os embriões

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Muitos processos celulares são controlados por complexos de proteína de múltiplas subunidades. Freqüentemente, esses complexos formam transitoriamente e exigem ambiente nativo de montar. Portanto, para identificar estes complexos proteicos funcionais, é importante para estabilizar in vivo antes da lise das células e purificação subsequente. Aqui nós descrevemos um método utilizado para isolar grandes complexos de proteínas de boa-fé a partir de embriões de Drosophila. Este método baseia-se na permeabilização embrião e estabilização dos complexos no interior dos embriões por reticulação in vivo, utilizando uma baixa concentração de formaldeído, o que pode facilmente atravessar a membrana celular. Subsequentemente, o complexo de proteína de interesse é imunopurificada seguido de purificação em gel e analisados ​​por espectrometria de massa. Ilustraremos este método utilizando a purificação de uma proteína complexa Tudor, que é essencial para o desenvolvimento da linha germinativa. Tudor é uma grande proteína, que contém vários domínios Tudor - pequenomódulos que interagem com argininas metiladas ou lisinas de proteínas alvo. Este método pode ser adaptado para o isolamento de complexos de proteína nativa a partir de diferentes organismos e tecidos.

A eficácia da reticulação e a purificação com sucesso do complexo proteico reticulado Tud foram analisadas por SDS-PAGE em um 3% - gel de 7% etapa (ilustrada na Figura 1), seguido por transferência de Western (Figura 2). O objectivo de utilizar a 3% - 7% de gel passo é baseado na separação eficaz de complexo de proteína reticulada Tud da proteína Tud reticulada remanescente e a concentração do complexo. Sob as nossas condições in vivo de reticulação...

Complexos de proteínas multi-componentes desempenham um papel crucial durante a função celular e desenvolvimento. Aqui, descrevemos um método usado para isolar complexos proteína nativa a partir de embriões de Drosophila após reticulação in vivo seguido de purificação dos complexos de ligações cruzadas para a subsequente análise da estrutura-função.

Uma In vivo A reticulação Abordagem para isolar Complexos de proteínas a partir de Drosophila Os embriões

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

O objetivo geral do experimento a seguir é obter complexos proteicos de embriões vivos de drosófila utilizando uma abordagem de reticulação in vivo. Isso é conseguido primeiro carregando milhares de moscas em uma gaiola de população e coletando embriões iniciais. Em seguida, as proteínas são reticuladas in vivo com formaldeído, o que estabiliza seus complexos proteicos internos.Em seguida, extratos proteicos são preparados a partir dos embriões reticulados para que os complexos proteicos possam ser imunoprecipitados. Os resultados identificam os complexos proteicos isolados por meio de análise por Western blot. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o isolamento tradicional de complexos proteicos com abordagens in vitro, é que esta abordagem in vivo nos permite capturar interações proteína-proteína transitórias, mas funcionalmente significativas, que poderiam não ser detectadas com métodos tradicionais in vitro.Quem demonstrará a técnica será o Dr. Min Gao, pós-doutorando do meu laboratório. Primeiro, misture água e ágar para moscas com um bastão de agitação. Autoclave esta mistura durante o ciclo de autoclave.Misture a sacarose no suco de maçã e

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Nós descrevemos um método para separar organelas pela densidade na...

In vivo Centrifugação de Embriões Drosophila

O cinetocoro é onde o SAC inicia seu sinal de monitoramento da segregação mitótica das cromátides irmãs. Um método é descrito para visualizar o recrutamento e de rotação de uma das proteínas cinetocoro e pela sua coordenação com o movimento cromossoma...

Estudar checkpoint mitótico por Ilustrando comportamento dinâmico cinetocoro Proteína e Movimento de cromossomos em Viver<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões Sincicial

Este protocolo demonstra como Ensaio de Proximidade A ligadura pode ser utilizada para detectar em interacções proteína-proteína in situ na junção neuromuscular, de larvas de Drosophila. Com esta técnica, os discos grande e Hu-li Shao tai são apresentados para formar um complexo na região pós-sináptica, uma associação previamente identificado por meio de co-imunoprecipitação.

Detecção de In Situ Complexos proteína-proteína no Drosophila Larval Junção Neuromuscular Usando Proximity Ligation Assay

O objetivo deste protocolo é fornecer uma abordagem direta e econômica para a coleta de embriões de Drosophila em escala média (0,5-1 g) e a preparação de extratos de proteínas que podem ser utilizados em aplicações proteômicas a jusante, como a purificação por afinidade - espectrometria de massa (AP-MS ).

Preparação em média<em&gt; Drosophila</em&gt; Extractos de embrião para experiências proteômicas

Aqui ilustramos como microscopia de foto-ativado localização única molécula pode ser realizada no terminal nervoso motor de um vivo Drosophila melanogaster terceiro estádio de larva.

Na Vivo Único-molécula de rastreamento no Terminal do nervo Motor pré-sináptica da drosófila

Este protocolo demonstra o uso do ensaio de ligadura de proximidade para sondar interações proteína-proteína in situ na germinação C. elegans.

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline usando Ensaio de Ligação de Proximidade

Apresentado aqui é um protocolo para microinjetar e simultaneamente imaginar múltiplos embriões de Drosophila durante o desenvolvimento embrionário usando um imager de alto teor baseado em placas.

Preparação e microinjeção de embriões Drosophila para Microscopia de Células Vivas Realizadas usando um Analisador automatizado de alto teor

No embrião drosophila primitivo, muitas organelas são motile. Em princípio, eles podem ser imagens ao vivo através de sondas fluorescentes específicas, mas a casca de ovo impede a aplicação direta ao embrião. Este protocolo descreve como introduzir tais sondas através de microinjeção e, em seguida, analisar o movimento da organela em massa através da velocimetria de imagem de partículas.

Visualizando o tráfico dependente de citoesqueleto de organelas contendo lipídios em embriões Drosophila

Aprenda a isolar complexos proteicos de embriões de Drosophila usando reticulação in vivo com formaldeído. Este método captura interações proteicas transitórias essenciais para funções celulares.

Uma In vivo A reticulação Abordagem para isolar Complexos de proteínas a partir de Drosophila Os embriões

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