Uma In vivo A reticulação Abordagem para isolar Complexos de proteínas a partir de Drosophila Os embriões
23 de abril de 2014
Complexos de proteínas multi-componentes desempenham um papel crucial durante a função celular e desenvolvimento. Aqui, descrevemos um método usado para isolar complexos proteína nativa a partir de embriões de Drosophila após reticulação in vivo seguido de purificação dos complexos de ligações cruzadas para a subsequente análise da estrutura-função.
O objetivo geral do experimento a seguir é obter complexos proteicos de embriões vivos de drosófila utilizando uma abordagem de reticulação in vivo. Isso é conseguido primeiro carregando milhares de moscas em uma gaiola de população e coletando embriões iniciais. Em seguida, as proteínas são reticuladas in vivo com formaldeído, o que estabiliza seus complexos proteicos internos.
Em seguida, extratos proteicos são preparados a partir dos embriões reticulados para que os complexos proteicos possam ser imunoprecipitados. Os resultados identificam os complexos proteicos isolados por meio de análise por Western blot. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o isolamento tradicional de complexos proteicos com abordagens in vitro, é que esta abordagem in vivo nos permite capturar interações proteína-proteína transitórias, mas funcionalmente significativas, que poderiam não ser detectadas com métodos tradicionais in vitro.
Quem demonstrará a técnica será o Dr. Min Gao, pós-doutorando do meu laboratório. Primeiro, misture água e ágar para moscas com um bastão de agitação. Autoclave esta mistura durante o ciclo de autoclave.
Misture a sacarose no suco de maçã e aqueça a 70 graus Celsius em uma placa. Posteriormente, combine as misturas e deixe esfriar por 15 minutos antes de o ágar solidificar. Prepare metil-4-hidroxibenzoato fresco em etanol.
Este é o conservante. Adicione-o à mistura em solidificação e mexa por cinco minutos. Em seguida, despeje a mistura em placas de plástico ou isopor de 300 centímetros quadrados sem formar bolhas.
Armazene as placas a quatro graus Celsius e utilize-as dentro de uma semana. Tenha preparada uma gaiola de população com 40 a 50.000 moscas para coletar embriões. Fixe duas placas recém-preparadas com meio de milho e melaço, contendo cerca de quatro gramas de levedura de padaria espalhadas sobre a superfície, na gaiola de população.
Deixe as moscas viverem nessas placas por 48 horas a 25 graus Celsius. Após dois dias, polvilhe cerca de um grama de levedura em duas placas de ágar suco de maçã e substitua as placas na gaiola de população por essas placas. Após uma hora, substitua as placas na gaiola por mais duas do mesmo tipo de placa.
As duas placas de coleta utilizadas pelas moscas durante uma hora serão carregadas com embriões. Suspenda os embriões e a água na placa e use uma escova para ajudar a desprendê-los. Em seguida, despeje a suspensão por uma peneira de duas camadas.
A camada superior é uma malha de aço de 850 mícrons, e a camada inferior é uma malha de aço de 75 mícrons. Os embriões se acumularão na malha mais fina, separados dos detritos grossos com o uso de um pincel. Transfira os embriões para um cesto de malha de náilon fino feito a partir da tampa de um tubo cônico de 50 mililitros.
Lave os embriões em água e seque-os na tela contra uma toalha de papel. Em seguida, mergulhe os embriões em uma solução de hipoclorito a 50% por três minutos. Agite-os na solução de hipoclorito, depois enxágue-os completamente com água e seque-os com papel absorvente.
Os embriões são então imersos em isopropanol por cerca de 15 segundos. Com movimentos de agitação, isso desfaz os agregados de embriões, e não deve levar mais de 30 segundos. Seque os embriões com papel absorvente e, em seguida, transfira-os para uma solução de heptano por cinco minutos.
Pipete frequentemente o heptano sobre os embriões para evitar que eles se aglomerem, seque os embriões com papel absorvente e enxágue-os em PBST. Após enxaguar os embriões por três minutos, transfira-os para uma malha em um tubo de 15 mililitros contendo 10 mililitros de PBST. Remova a malha, deixando os embriões em solução, e reserve entre 100 e 300 microlitros de embriões.
Deixe decantar no fundo, aspire o PBST e prossiga imediatamente com a reticulação para cruzar os embriões. Primeiro, adicione 10 mililitros de formaldeído 0,2% recém-preparado em PBST aos embriões. Incube-os sob agitação suave a 25 graus Celsius por 10 minutos.
Após 10 minutos de reação, deixe os embriões sedimentarem e remova a solução. Em seguida, substitua rapidamente a solução por 10 mililitros de glicina 0,25 molar em PBST para interromper a reação. Coloque o tubo em agitação por mais cinco minutos. Após a interrupção, remova a solução e lave os embriões três vezes, utilizando 10 mililitros de PBST em cada lavagem.
Remova o restante de PBST por aspiração com pipeta e armazene os embriões a menos 80 graus Celsius até que sejam necessários. Usando um homogeneizador de imersão e dois mililitros de tampão de lise, homogeneíze 500 microlitros de embriões reticulados. Isso leva cerca de 15 golpes com um pistilo ajustado.
Transfira o lisado para um tubo de microcentrífuga e coloque-o para agitar suavemente durante 15 minutos. Em seguida, centrifugue o lisado a 16.000 ×g por cinco minutos. Transfira o sobrenadante para um tubo de 15 mililitros.
O pellet pode ser descartado. Agora, ao sobrenadante, adicione 40 microlitros da suspensão de anti ha agros beet. Incube em agitação suave por cerca de 2,5 horas após a conclusão da conjugação com as microesferas.
Centrifugue as esferas a 2.500 Gs durante cinco minutos. Deixe cerca de 250 microlitros de sobrenadante no tubo e re-suspenda as esferas nesse volume. Transfira as esferas suspensas para um filtro de 10 mícrons em uma coluna de centrifugação.
Remova a solução com uma centrifugação de dez segundos a 12.000 Gs. Lave as esferas na coluna com 200 microlitros de tampão de lavagem e faça outra centrifugação. Repita esse procedimento um total de três vezes. Em seguida, adicione 40 microlitros de tampão de eluição às esferas e incube-as a 37 graus Celsius por 15 minutos.
Agite suavemente o tubo a cada cinco minutos durante este período para coletar o sobrenadante. Centrifugue a coluna mais uma vez a 12.000 ×g por 10 segundos. A eficácia da reticulação e da purificação de complexos proteicos reticulados foi analisada por eletroforese em gel SDS-PAGE de gradiente 3 a 7%, seguida de western blot. Embriões que expressavam a proteína GFP com marcação HA foram utilizados para monitorar a extensão da reticulação e testar diferentes concentrações de formaldeído para o protocolo.
A maioria da GFP nos embriões tratados não sofreu reticulação, portanto isso não ocorre. Um complexo de duas proteínas reticulado aleatoriamente foi comparado ao controle não reticulado. Duas proteínas que não sofreram reticulação são observadas numa faixa de 285 kilodaltons que migra livremente.
A proteína dois ligada covalentemente é mais pesada e migra menos no lisado proteico bruto. Cerca da metade da proteína dois foi ligada covalentemente ao seu parceiro de interação in vivo. Os parceiros que interagem eluídos com o peptídeo HA apresentaram tanto o complexo quanto a proteína tubo livre na fração eluída, após a lavagem das esferas.
Com o SDS removido, obtém-se o tubo livre na maior parte e com complexo de tubo mínimo. Após este procedimento, outros métodos, como espectrometria de massas, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre métodos, tais como a identificação de componentes proteicos nos complexos isolados.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um método para o isolamento de complexos proteicos nativos de embriões de Drosophila utilizando uma abordagem de reticulação in vivo. A técnica permite a captura de interações proteicas transitórias que são cruciais para funções celulares.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Celular
- Bioquímica de Proteínas
- Biologia do Desenvolvimento
Contexto
- Complexos proteicos multicomponentes são essenciais para diversas funções celulares.
- Métodos tradicionais podem não detectar interações proteicas transitórias.
- A reticulação in vivo oferece uma maneira de estabilizar essas interações.
- Embriões de Drosophila servem como modelo para o estudo de complexos proteicos.
Objetivo do Estudo
- Isolar complexos proteicos de embriões vivos de Drosophila.
- Utilizar reticulação in vivo para capturar interações transitórias.
- Analisar a estrutura e função desses complexos proteicos.
Métodos Utilizados
- Carregar moscas em uma gaiola de população para coletar embriões precoces.
- Realizar a reticulação cruzada de proteínas in vivo com formaldeído.
- Preparar extratos proteicos a partir de embriões reticulados.
- Imunoprecipitar complexos proteicos para análise.
Resultados Principais
- Identificação de complexos proteicos isolados por meio de análise por Western blot.
- Demonstração da eficácia da reticulação in vivo.
- Captura de interações proteína-proteína transitórias.
- Comparação com métodos tradicionais in vitro destaca vantagens.
Conclusões
- A abordagem in vivo é superior para estudar interações proteicas dinâmicas.
- Este método pode aprimorar a compreensão das funções de complexos proteicos.
- Estudos futuros podem expandir esta técnica para outros organismos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Capturar interações transitórias entre proteínas em ambientes celulares nativos continua sendo um desafio crítico na validação de alvos e na redução de riscos mecanicistas. Essa abordagem de reticulação in vivo permite a estabilização de complexos lábeis diretamente em embriões de Drosophila, preservando interações fisiologicamente relevantes que poderiam ser perdidas durante a lise convencional. O método apóia esforços iniciais de descoberta ao fornecer uma representação mais precisa da composição endógena dos complexos, aumentando assim a confiança preditiva na avaliação de alvos posteriores.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao estabilizar complexos proteicos transitórios para análise funcional.
- Valor Operacional: Reduz falsos negativos na validação de alvos ao capturar interações perdidas in vitro.
- Valor Científico: Apoia a desmistificação biológica por meio da preservação da arquitetura nativa do complexo em um sistema modelo relevante para a doença.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados adequados para padronização de ensaios e testes de reprodutibilidade.
- Valor Operacional: Gera resultados quantitativos por meio de imunoprecipitação e espectrometria de massas para avaliação confiável de compostos.
- Valor Científico: Melhora a prontidão para triagem ao fornecer leituras de interação com alvos semelhantes às condições nativas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Oferece insights relevantes sobre sistemas de doenças ao isolar complexos de embriões em desenvolvimento, um modelo para processos celulares conservados.
- Valor Operacional: Garante continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica ao manter a integridade dos complexos.
- Valor Científico: Facilita a redução de riscos mecanicistas ao associar o engajamento do alvo a desfechos funcionais no desenvolvimento da linhagem germinativa.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se no continuum de descoberta que vai do teste de hipóteses sobre alvos até a identificação de compostos iniciais, especialmente nos casos em que interações transitórias influenciam a adequação do alvo. Ele complementa a triagem fenotípica ao fornecer um contexto mecanicista para os fenótipos observados.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao isolar complexos nativos em condições próximas às fisiológicas.
- Triagem: Permite a preparação de ensaios por meio do isolamento reprodutível de complexos estabilizados por reticulação.
- Análises: Fornece medidas quantitativas por meio de Western blot e espectrometria de massas para comparar a composição dos complexos em diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao revelar redes de interação conservadas em um modelo geneticamente manipulável.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma plataforma reutilizável para o isolamento de complexos em diversos tecidos e organismos, quando adaptada.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade mecanicista em estudos de engajamento de alvo.
- Valor Operacional: Promove padronização e reprodutibilidade por meio de etapas definidas de reticulação e inativação.
- Valor Estratégico: Melhora decisões de prosseguimento ou interrupção ao revelar interações transitórias que podem indicar relevância funcional.
- Impacto no Portfólio: Permite priorização ajustada ao risco com base na estabilidade do complexo nativo e na intensidade da interação.
Considerações de Implementação
- Exige experiência no manuseio de embriões, química de reticulação e técnicas de imunoprecipitação.
- Depende do acesso a equipamentos de homogeneização, centrifugação e filtração para a preparação do lisado.
- Necessita padronização entre equipes quanto à concentração de formaldeído, tempo de bloqueio da reticulação e rigor dos lavagens.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o método a tecidos não embrionários ou a sistemas modelo alternativos.
- Inclui limitações práticas, como a possível super-reticulação em altas concentrações de formaldeído, o que pode mascarar epítopos ou dificultar a eluição.
