Name: Preparação de Neuronal co-culturas com precisão única célula (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Aprenda a preparar co-culturas neuronais interconectadas com precisão de célula única usando dispositivos microfluídicos e padrões de biomateriais por plasma. Este método permite estudos de neurociência com entradas celulares mínimas.

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Os autores são gratos a Ulrich Marggraf (ISAS) para SU-8 de fabricação e Maria Becker (ISAS) para SEM imagem. A pesquisa foi financiada pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG WE3737/3-1), um Bundesministerium für Bildung und Forschung concessão (BMBF 0101-31P6541) e pelo Ministerium für Inovação, Wissenschaft und Forschung des Landes Nordrhein-Westfalen. Heike Hardelauf graças a Escola Internacional de Leibniz &quot;Biologia de Sistemas Lab-on-a-Chip&quot; de apoio financeiro.

Os protocolos são destinados para os neurocientistas, e estão resumidos na Figura 2. Como tal, é recomendável que microfabricação dos SU-8 mestres usados ​​para replicação PDMS é terceirizada para instalações comerciais ou institucionais. Os dois projetos de máscara de camada estão disponíveis gratuitamente como informação suplementar (CEP) na Royal Society of Chemistry website 12. Importante, a primeira camada de SU-8 deve ser fabricado, a uma profundidade de 2,5-3,0 um, e a segunda a uma profundidade de 25-30 m. Estas são dimensões fundamentais necessários para arraying neurônio eficaz. O limite de altura de 3 mícron é também necessário para evitar que os neurónios a ser transportado ou migração entre os dois compartimentos 12. 1. Microfluidic replicação de dispositivos no PDMS <ol><li> Misture o pré-polímero de PDMS completamente com o agente de cura (184), a uma proporção de 10:1 e desgaseificar a mistura em um secador de vácuo para tipicamente 20 min. Alternativamente, coloque o mixtura em um tubo Falcon 50 ml e usar baixa g centrifugação para a desgaseificação. </li><li> Coloque a 2-camada microestruturada SU-8 bolacha numa placa de aquecimento de 80 ° C e alinhar quadros de polímero para cada dispositivo da bolacha. Despeje PDMS nos quadros a uma profundidade de 5 mm e ≥ permitir&gt; 1 hora para garantir a completa cura térmica. </li><li> Uma vez curado, remover a pastilha da placa de aquecimento e deixa-se arrefecer sobre uma superfície plana. </li><li> Usar óculos de protecção e de trabalho de um canto (longe dos SU-8 microestruturas) com um bisturi rígida para gentilmente prêmio do quadro e PDMS do wafer. </li><li> Retirar o molde PDMS da armação e usar um par de tesouras para cortar o dispositivo de PDMS em excesso. Este assim chamado intermitente é geralmente produzido quando uma película fina de PDMS espalha entre a armação de polímero e a superfície da bolacha. </li><li> PDMS restantes pode ser aplicada a toda a bolacha e curado para proteger a pastilha durante o armazenamento. Remover esta antes da moldagem dispositivo subseqüente, e ao fazê-lo remover qualquer particular os contaminantes da superfície. </li></ol> 2. Assembléia dispositivo e Interligação <ol><li> Prepare as seis portas de interface usando de 3 mm de diâmetro biópsia soco. Trabalhar em uma superfície escura, em boas condições de luz e com as características microstructured viradas para cima para ajudar o alinhamento das portas com os canais microfluídicos. </li><li> Inspecione o dispositivo para partículas. Remova os com fita adesiva reversível. </li><li> O circuito de microfluidos é encapsulado usando uma camada de PDMS fina montados numa lamela de vidro: Estes são preparados por vazamento de um pequeno volume (~ 0,5 ml) da mistura de agente de cura de PDMS-(10:1, 601) sobre a base de um sistema flexível, grau bacteriológica placa de Petri. Pressione suavemente uma lamela sobre a camada de PDMS, coloque sobre a placa de aquecimento e cura térmica por alguns minutos. Rapidamente após o resfriamento, usar um bisturi para cortar e prêmio da bicamada lamela-PDMS da placa de Petri. Aparar com uma tesoura, se necessário. </li><li> Vínculo Plasma o dispositivo PDMSe camada de suporte para produzir uma boa vedação: As condições ótimas são instrumento específico. Por exemplo, um forno de plasma a funcionar a 70 W e 40 kHz, numa atmosfera de oxigénio de 0,2 mbar durante 40 segundos produz uma excelente ligação PDMS-PDMS. Uma vez tratada plasma, pressionar ambas as partes juntas e deixe por um minuto para totalmente vínculo. </li><li> Use tubo de silicone (1,6 mm DI, 3.2 mm de diâmetro externo) para fazer a interface com as bombas e seringas. </li></ol> 3. Biomaterial Padronização e Operações microfluídicos Os protocolos para a modelação em biomaterial in situ, cultura neurónio e tratamentos fluídicos estão ilustrados na Figura 2. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51389/51389fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Protocolos microfluídicos Illustrated. A) PL e PLL-g-PEG padronização; Além da camada de adesão de células (por exemplo,PL, verde), com a produção a máscara de água alinhada B) tratamento de plasma de ar atmosférica do PL exposto evaporação.; dois pinos de antena são usados, com a antena introdução plasma ilustrado com uma estrela rosa. C) PBS (azul) lavagem por aspiração é usado para evitar contaminar a região tratada com plasma com PL. D) Entrega de PLL-g-PEG (vermelho ) por aspiração para revestir as regiões tratadas com plasma E) carregamento celular.; arraying microfluídicos simultânea de neurônios para ambos os compartimentos de acompanhamento por aspiração, F) mídia () perfusão rosa usando um fluxo hidrostática orientado G) tratamentos fluídicos isolados.; tratamento periférico de um agente de teste (preto) entregues a partir da entrada inferior de flanco por aspiração e H) central de tratamento livrou da entrada central inferior por aspiração. Figura e lenda reproduzido com permissão da Sociedade Real de Química(RSC) 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51389/51389fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> Imediatamente após plasma colagem dos canais microfluídicos PDMS são altamente hidrofílico (ângulo de contato ≤ 5 °). Tais superfícies são adequadas para a adesão e a cultura de linhas de células, tais como células neuronais, como SH-SY5Y humanas diferenciadas. Para a cultura ex vivo de neurónios primários e a cultura de linhas de células precursoras neuronais tais como a linha de células do mesencéfalo Lund humano (LUHMES) um revestimento de poliaminas, ou polilisina (PL) ou poliornitina (PO), é necessário, como uma âncora electrostático. Além de proteínas de adesão tais como laminina ou a fibronectina são muitas vezes necessário que o revestimento de interface de integrina. No entanto, os revestimentos PL e PO prontamente ligam os neurônios, dificultando a entrega de microfluídica para os sites da matriz e também a imposição de tensões de cisalhamento indesejados. Para resolver este problema biomaterial em-chippadronização é necessária para localizar materiais de adesão nos sites armadilha e os microcanais conseqüência. Isso também promove o desenvolvimento de conexões inter-compartimento e reduz emaranhamento local. O protocolo envolve também a adição de materiais de PEG para áreas vizinhas para garantir as proteínas e os neurónios são restritas para os locais desejados durante a cultura prolongada. O protocolo seguinte é documentado na Figura 3: <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51389/51389fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Água mascaramento para modelação prependicular biomaterial por plasma. A) Ilustração do processo de mascaramento água com os micropillars PDMS fixando os menisco de água no local para stencil plasma. A curvatura do menisco no plano vertical, tem sido negligenciado. B) uma máscara de água visualizadas com um corante vermelho e posicionada por menisco pinning. C) O estampados revestimento PL-FITC fotografada após stencil plasma. D) A adição de proteína rejeitar e repelente célula PLL-g-PEG-TRITC a um revestimento com estampas de plasma PL-FITC. Isto foi usado para o registro de células SH-SY5Y e também para padronizar uma camada de fibronectina adicional para células LUHMES. Figura e lenda reproduzido com permissão da Royal Society of Chemistry (RSC) 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51389/51389fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <ol><li> Masking Água para in situ Biomaterial Patterning por Plasma Stenciling <ol><li> Pouco tempo depois da ligação de plasma pipeta de um volume de 0,5 ul de PL ou PO (100 ug / ml em PBS 1x) no centro da parte inferior da porta. Em questão de segundos, todo o circuito microfluídica é preenchido por ação capilar. Deixar durante alguns minutos para revestir completamente a superfície de PDMS hidrofílicos com a poliaminas. </li><li> Remover moléculas de poliamina não ligados por lavagem controlado por aspiração com 1x PBS (ver figura 2C) durante 1 min. </li><li> Remova toda a PBS dos portos e aquecer o dispositivo de iluminação com um microscópio. Isso aumenta a evaporação das portas para a formação da água máscara rápida. A máscara de água (ilustrado na Figura 3A e documentado na Figura 3B) é estabelecida dentro de ~ 5 min. </li><li> Inspecione o dispositivo por meio de microscopia para garantir mascaramento água está completa. Por favor note estruturas reservatório a montante do local de matriz estão incluídas no projecto de máscara para prolongar a estabilidade da máscara de água (~ 15 min). </li><li> Inserir pinos de aço inoxidável nas portas (Figura 2B). Estes são usados ​​para acoplar o plasma gerado por uma descarga de coroa à pressão atmosférica de mão ou gerador Tesla (por exemplo, operando a 2 MHz, de 30 de sinal kV) 19,20 para os canais de microfluidos vagos. Aponte a ponta da tele plasma fonte próxima à ponta de um alfinete e plasma tratar a microcanais para ≤ 1 seg. Use condições de pouca luz para observar padrões plasma. </li><li> Retire a máscara de água com uma etapa de lavagem. Use aspiração paralelo das 3 portas superiores. Use 4 comprimentos iguais de tubo de silicone conectado por um adaptador de 4 direções para uma bomba de aspiração de alcançar a aspiração paralelo. Comece aspiração e dispensar PBS nas 3 portas de fundo para desenhar PBS através do circuito de microfluídica. Desta maneira um material de contraste de PDMS-poliamina é produzido (veja a Figura 3C). PBS evacuar do circuito de microfluidos e deixar durante várias horas para restaurar o estado nativo, hidrofóbico. Isso torna os PDMS totalmente não-permissiva para adesão celular. </li><li> Deve materiais de adesão adicionais, tais como laminina ou fibronectina, ser necessário realizar as seguintes etapas são necessárias e deve ser feito imediatamente após a remoção da máscara de água: Pipetar um volume de 10 ul do enxerto de co-polímero de poli-L- Lisina-poli (etileno-glicol) (PLL-g-PEG, 100 ug / ml, em PBS), em ambos os canais de fundo de flanqueamento, seguindo-se a aspiração dos canais flanqueando superiores durante 2 min. </li><li> Sem interromper o fluxo, remover o excesso de PLL-g-PEG por troca com um tampão PBS. A selectivamente revestimentos das regiões não-revestido de poliamina com a unidade de PEG agir para evitar a adsorção de proteínas e adesão celular 17,21. </li><li> Proteínas de adesão, tais como laminina ou fibronectina, em seguida, pode ser co-localizada com o revestimento de poli-amina: Pipetar 10 ul de volume destas proteínas de ECM (tipicamente de 10 ug / ml) em todos os três portas inferiores. Aspirar a partir dos três portas superiores até que o dispositivo está cheio com a solução de proteína e incubar durante 1 hora para produzir um revestimento de boa qualidade. </li><li> Remover o excesso de proteínas, aspirando PBS a partir dos três portas inferiores. </li></ol></li><li> Microfluidic único neurônio arraying <ol><li> Prime os dispositivos com aprocomeu mídia. Adicionar 20 volumes ul às 3 portas inferiores e por aspiração paralelo de três portas superiores rapidamente encher o circuito microfluídicos com a mídia. Use um conector de tubulação de 4 vias para acoplar as 3 portas superiores através de tubos de silicone de tamanho igual a uma bomba de aspiração. </li><li> Adicionar 20 ul de uma suspensão de células desagregadas (1 x 10 6 células / ml) a cada uma das portas de entrada de flanqueamento (0, na Figura 1). </li><li> Equipar uma bomba de aspiração com um regulador de fluxo ou usar uma seringa para aspiração delicada das 3 portas superiores. Completa arraying neurônio tipicamente requer 1 min. </li><li> Colha os neurônios em excesso permanecem nos 4 portas de acompanhamento com uma pipeta para arraying em dispositivos microfluídicos subseqüentes. </li><li> Remova o tubo. Preencha todas as portas com a mídia e coloque o dispositivo na incubadora. Dentro de algumas horas, as células tornam-se totalmente aderente no padrão biomaterial. </li></ol></li><li> Cultura Neuron, Selective Fluidic Tratamento e Immunostaining <ol><li> Troque a mídia por perfusão periódica utilizando alimentação hidrostática (a 2 milímetros diferença de altura da coluna é adequadamente lento). </li><li> Alternativamente, mergulhe o dispositivo micro na mídia, trocando a mídia periodicamente (2-3 dias), como com culturas de células normais. </li><li> Tratamentos fluídicos selectivos para qualquer compartimento de cultura de neurónios ou o compartimento de crescimento de neurites central são atingidos como se segue: Pipetar 20 ul da substância de teste na porta de fundo do canal de interesse, e aspirado a partir da porta directamente acima. Para tratamentos longos reduzir a taxa de fluxo através de um regulador de fluxo e reabastecer a substância de teste, conforme necessário. </li><li> Protocolos de imunocoloração variam para cada alvo molecular e reagentes associados. Para contrariar o risco potencial de dano induzido pelo cisalhamento para os neurônios de uma taxa de fluxo lento foi usado. Isso resulta em aumento épocas de aplicação para aspergir completamente o sistema, estendendo tempos normais de protocolo. Hyperfusão drostatic usando portas com diferentes alturas de coluna (por exemplo, 2 mm) foi utilizada para fornecer os reagentes. Adição de reagente mais rápida e remoção utilizando uma bomba pode ser usada para reduzir os prazos experimentais. Ligue uma bomba de aspiração para as 3 portas superiores a desenhar a partir dos reagentes 3 portas inferiores. </li></ol></li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A técnica arraying microfluídica é o primeiro de seu tipo, que permite a manipulação de precisão único neurônio para o estabelecimento de culturas minimalistas. Juntamente com o método in situ padronização biomaterial, uma abordagem poderosa para alinhar os padrões celulares com estruturas microfluídicos, estas culturas minimalistas têm níveis de conectividade de alta intercompartimental com reduzida emaranhamento local. Estas características podem ser utilizadas para o estudo de eficiência de transmissão entre...

<html> Tecido neuronal é altamente complexa; uma mistura heterogênea de celular que é espacialmente ordenados dentro camadas e compartimentos definidos e com conectividade de plástico através de contatos celulares e especialmente via axônio e dendrito excrescências. Novas técnicas são necessárias para conferir maior liberdade experimental para obter insights mais profundos e mecanismos centrais desvendar a doença, o desenvolvimento ea função saudável. A câmara Campenot 1,2 e, mais recentemente, microfabricados concretizações 3,4 pode ser usado para a preparação ex vivo de rede neuronal co-culturas com a capacidade de perturbar selectivamente as diferentes populações somáticas e também as suas excrescências de neurites. Estes dispositivos microfluídicos têm, por exemplo, foram usados ​​para estudar a degeneração de axônios e regeneração seguinte químico 5,6 ou laser axotomia 6-8, tauopathy 9, a disseminação viral 10,11, e localização de mRNA em axônios 4. ent &quot;&gt; Para ampliar o alcance dos neurobiólogos, os avanços tecnológicos são necessários para preparar minimalistas neuronais co-culturas. Isso permite disentanglement da rede neuronal para a investigação do sistema com uma única célula e precisão sub-celular. O requisito mínimo para o número de células é aberta a possibilidade de analisar os tipos de células raras, incluindo células dopaminérgicas substantia nigra relevantes para a doença de Parkinson, gânglios espirais do ouvido, os neurónios periféricos, e células estaminais. Além disso, a economia celular é relevante para a iniciativa 3Rs. Usando essas plataformas microfluídicos, telas de toxicidade em grande escala ou outra alta taxa de transferência, os dados rico série experimental exigindo neurônios animais já pode ser considerado. Neste trabalho são descritos os protocolos para a fabricação e uso de um dispositivo micro. Arraying microfluídicos em combinação com um em biomateri situmétodo de padronização al pode ser utilizado para o registro de altamente interconectadas co-culturas de neurônios que usam números de celular mínimos. Arraying microfluídico se baseia numa abordagem de fluxo diferencial de 12-15, em que armadilhas microestruturados são posicionadas dentro de um circuito de fluido (ilustrado, juntamente com imagens de MEV da Figura 1). O caminho 0 → 1 tem a resistência mais baixa de fluidos (R2&gt; R 1) para o transporte de neurónios de um conjunto linear de aberturas microestruturadas - As entradas para os canais de crescimento de neurites. Ocupação da armadilha por uma única célula localmente impede o fluxo para desviar as linhas de corrente para capturar células subseqüentes em armadilhas vizinhos. Ocupação completa das armadilhas na matriz de liga a proporção de fluidos (1 R&gt; R 2) para desviar as linhas de corrente para o trajecto sinuoso (0 → 2) para produzir um modo de operação manual para a remoção de excesso de neurónios. Figura 1. Microfluidic Circuit. A) O circuito de resistência diferencial fluídico para arraying único neurônio, com flanquear câmaras cultura interligados por canais de crescimento de neuritos. B, imagens C) SEM da bicamada neurônio compartimentada co-cultura array com menisco fixando micropillars. Com este projeto, as estruturas de neurônio de captura em forma de tridente foram usados ​​para promover fasciculation das excrescências neurite. Figura e lenda reproduzido com permissão da Royal Society of Chemistry (RSC) 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51389/51389fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> A preparação de redes neuronais micropatterned em substratos planares pode ser facilmente alcançada (para exampl<html> es do nosso grupo, ver Frimat et al. 16 e Heike et al. 17). No entanto, encapsulando padrões materiais bioativos dentro de dispositivos de PDMS e com a exigência de alinhamento micrômetro escala destes para os canais microfluídicos representa um grande desafio técnico. Na seção 3.1 um protocolo para a em-chip, ou in situ, a preparação de padrões de biomateriais é apresentado. Esses padrões permitem registro neurônio durante prazos longos de cultura e promover outgrowths entre os compartimentos. Microestruturas menisco-pinagem são usados ​​para alinhar uma máscara de água chamado com o neurônio arraying sites e canais de crescimento de neuritos. A máscara de água protege revestimentos moléculas de adesão durante o tratamento de plasma, enquanto que as superfícies expostas são desintegrados para definir o padrão biomaterial. Além disso, os protocolos são fornecidos para a cultura de células e para o isolamento de fluidos necessários para o tratamento selectivo dos diferentes compartimentos de co-cultura. ve_content &quot;&gt; Os protocolos são projetados para alavancar os princípios user-friendly de litografia suave para a replicação de poli (dimetilsiloxano) (PDMS) dispositivos microfluídicos 18. Da mesma forma, em biomaterial situ padronização é simples, explorando de evaporação de superfície e fenômenos de tensão, e só exigindo uma fonte de plasma de mão barato. microfluídicos O circuito de forma eficaz os programas de carregamento do compartimento celular e tratamentos específicos que fazem essas operações simplesmente uma questão de distribuição de materiais na porta inferior correto e aspiração de cima. Desta forma, pretende-se dar os neurobiólogos a liberdade de preparar e utilizar dispositivos microfluídicos em seus próprios laboratórios.

<table><tbody><tr><td>PDMS Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS Elastosil RT 601</td><td>Wacker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas</td><td>VWR</td><td>630-1590</td><td>130-160 mm de espessura</td></tr><tr><td>3 mm punções de biópsia</td><td>Kai Medical</td><td></td><td>Lidar com cuidado -</td></tr><tr><td>tubulação Tygon</td> extremamente afiada <td>Fisher Scientific</td><td>S-50-HL</td><td>1,65 mm de diâmetro; 3,35 mm OD</td></tr><tr><td>Seringa de 1 ml ( Inkjekt e Omnifix)</td><td>Braun</td><td>6064204</td><td></td></tr><tr><td>Conector de tubulação de 4 vias</td><td>VWR ou Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Regulador de fluxo</td><td>Harvard Apparatus</td><td>722645</td><td></td></tr><tr><td>pinos de 0,5 mm</td><td>Departamentos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de costura PLL-g-PEG</td><td>SuSoS</td><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)</td><td>A estabilidade no armazenamento pode ser um problema</td></tr><tr><td>poli-D-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Polilisina-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3069</td><td></td></tr><tr><td>Poliornitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio fluorescente invertido</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Exemplo de bomba de aspiração</td><td>KNF Neuberger, Laboport</td><td>N811KVP</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo portátil de descarga corona</td><td>Leybold-Heraeus, USA</td><td>VP23</td><td>Pode não estar em conformidade com as normas de segurança do seu país</td></tr><tr><td>Forno de plasma Femto</td><td>Diener Dessecador ou</td> centrífuga a vácuo eletrônico <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparação de neuronal co-culturas com precisão única célula

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Realizações microfluídicos da câmara Campenot têm atraído grande interesse da comunidade da neurociência. Estas plataformas de co-cultura interligados pode ser usado para investigar uma variedade de questões, abrangendo desenvolvimento neurobiologia e funcional para a infecção e propagação da doença. No entanto, os sistemas convencionais requerem entradas significativas celulares (muitos milhares por compartimento), inadequados para o estudo de células de baixa abundância, como nigra primário dopaminérgico substantia, gânglios espiral, e os neurônios melanogaster Drosophilia e impraticável para a experimentação de alto rendimento. As culturas densas são também altamente enredada localmente, com algumas excrescências (&lt;10%) que interligam as duas culturas. Neste trabalho protocolos microfluídicos e padronização simples são descritos que enfrentar esses desafios: (i) um neurônio único microfluídicos método arraying, e (ii) um método de mascaramento de água para revestimentos de biomateriais padronização de plasma para register neurônios e promover crescimento entre os compartimentos. Minimalista neuronais co-culturas foram preparadas com de alto nível (&gt; 85%) conectividade intercompartimental e pode ser usado para experimentos neurobiologia alto rendimento com precisão uma única célula.

Exploits mascaramento Água tensão superficial. A tolerância de pressão na interface ar-líquido escalas inversamente com o raio de curvatura [ <img fo:content-width="1in" src="files/ftp_upload/51389/51389eq1.jpg" width="113" /> , Produzindo as interfaces altamente estáveis ​​em dimensões de microfluidos. Os micropillars efetivamente ancorar a máscara de água no local. Formação máscara água é conduzida através de evaporação a partir das portas de microfluidos, com a taxa de aumento de aquecimento. Usando o calor de baixa ...

Protocolos para único neurônio microfluídicos arraying e mascaramento de água para a padronização dos revestimentos de biomateriais plasma em-chip são descritos. Altamente interligados co-cultura pode ser preparado através de entradas de células mínima.

Preparação de Neuronal co-culturas com precisão única célula

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

O objetivo geral deste procedimento é dispor neurônios individuais em dois compartimentos microfluídicos para o preparo de uma cocultura neuronal conectada. Isso é realizado primeiramente por moldagem por replicaç&atilde;o do dispositivo microfluídico em PDMS e encapsulamento do dispositivo por ligação com plasma. O segundo passo é fazer o padr&atilde;o de polilisina dentro do dispositivo microfluídico.Isso é conseguido preenchendo o dispositivo com polilisina, permitindo a formação de uma massa de água por evaporação e, em seguida, utilizando um tratamento com plasma para remover a polilisina exposta, criando assim o padrão do biomaterial. Em seguida, use uma seringa para aspirar os neurônios através do circuito microfluídico para o arranjo de neurônios individuais. O dispositivo é colocado no incubador de cultura de tecidos para que os neuritos possam crescer e conectar as duas populações de neurônios.O passo final envolve o uso de uma bomba de aspiração para tratar seletivamente um compartimento e monitorar a propagação de materiais e patologia dentro do circuito neuronal. A demonstração do procedimento será feita por Yayu Chang e Sarada do laboratório ISIS. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como as câmaras comerciais de componente PDMS, é que as culturas neuronais são preparadas com posicionamento de célula única para a análise de algoritmos neurais individuais.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da neurociência. Por exemplo, qual é o mecanismo subjacente à propagação de agregados hiperfosforilados de proteína tau na doença de Alzheimer ou como o agente infeccioso se espalha por todo o cérebro? A técnica é ideal para aplicações de alto rendimento, já que apenas algumas centenas de neurônios são necessárias para cada condição experimental.Inicie o procedimento misturando completamente o pré-polímero de PDMS com o agente de cura numa proporção de 10 para 1. Em seguida, remova o ar da mistura em um dessecador a vácuo durante aproximadamente 20 minutos. Depois, coloque a pastilha de silício com estrutura microfabricada em duas camadas sobre uma placa aquecida a 80 graus Celsius e alinhe as molduras poliméricas a cada dispositivo na pastilha.Despeje o PDMS na estrutura e aguarde uma hora para garantir a cura térmica completa. Após a cura, retire a pastilha da placa aquecida e deixe esfriar sobre uma superfície plana. Em seguida, usando proteção ocular, utilize um bisturi rígido para levantar suavemente a estrutura e o PDMS da pastilha a partir de um canto.Remova o molde de PDMS do quadro e use uma tesoura para aparar o dispositivo. Aplique o PDMS restante em toda a pastilha para protegê-la durante o armazenamento. Ao destacar essa camada de PDMS da pastilha, quaisquer contaminantes particulados são removidos da superfície, preparando-a para um novo molde de PDMS.Agora prepare os seis portos de interface utilizando um furador de biópsia de três milímetros, com as estruturas microestruturadas voltadas para cima, para facilitar o alinhamento dos portos com os canais microfluídicos. Inspecione o dispositivo em busca de partículas e remova-as usando fita adesiva reversível. Em seguida, prepare uma camada fina de PDMS montada sobre uma lamínula de vidro despejando uma pequena quantidade da mistura do agente de cura de PDMS sobre a placa de Petri.Pressione uma lamínula sobre a camada de PDMS. Coloque-a na placa aquecedora e cure-a termicamente por cerca de 10 minutos. Logo após o resfriamento e usando óculos de proteção, use um bisturi para soltar a lamínula.PDMS em duas camadas retirado da placa de Petri para encapsular o dispositivo. É necessário um bom vínculo P-D-M-S-P-D-M-S. Coloque a camada dupla de PDMS e o dispositivo microfluídico no forno de plasma por 40 segundos.Uma vez tratado o plasma, pressione as duas partes juntas e permita que se liguem completamente logo após a ligação por plasma. Pipete 0,5 microlitros de polilisina no orifício central inferior. Todo o circuito microfluídico deve ser preenchido por ação capilar em segundos. Em seguida, deixe por alguns minutos para revestir completamente as superfícies hidrofílicas de PDMS com polilisina.Em seguida, remova a polilisina não ligada por meio de lavagem com aspiração. Use uma junção em cruz para conectar a bomba às três portas superiores com tubos de mesmo comprimento e inicie a aspiração. Adicione PBS às três portas inferiores e lave por um minuto. Posteriormente, desconecte os tubos e remova todo o PBS remanescente das portas.Transfira o dispositivo para um microscópio e aqueça utilizando iluminação para aumentar a evaporação pelos orifícios, promovendo a formação rápida da máscara de água. Inspecione o dispositivo por microscopia para garantir que a máscara de água esteja completa. Em seguida, insira pinos de aço inoxidável nos orifícios para acoplar o plasma gerado por um gerador de descarga coronal portátil aos canais microfluídicos vazios.Posicione a ponta da fonte de plasma próximo à ponta de um dos pinos e aplique o plasma. Trate o microcanal por um segundo. Em seguida, remova os pinos e conecte as três portas superiores à bomba.Inicie a aspiração e dispense PBS nos três portos inferiores. A fim de puxar o PBS através do circuito microfluídico. Remova todo o PBS do circuito microfluídico e deixe-o durante a noite para concluir a padronização do biomaterial.Aqui, o padrão é visualizado usando polilisina marcada com fluoresceína. Neste procedimento, prepare o dispositivo com o meio apropriado adicionando 20 microlitros a cada um dos três portos inferiores. Em seguida, use aspiração paralela a partir dos três portos superiores para preencher rapidamente o circuito microfluídico com o meio.Adicione 20 microlitros de uma suspensão de células dissociadas a cada um dos orifícios inferiores laterais. Utilize uma seringa para aspirar suavemente pelos três orifícios superiores. A reorganização completa dos neurônios geralmente requer um minuto.Em seguida, utilizando uma pipeta, colete os neurônios excedentes remanescentes nas portas para um anel em dispositivos microfluídicos subsequentes. Este exemplo mostra como os neurônios são dispostos com precisão de célula única. Depois disso, submerja o dispositivo no meio e coloque-o no incubador para que as células adiram completamente ao padrão de biomaterial em algumas horas.Como em culturas normais, o meio deve ser reposto periodicamente para tratar seletivamente ou o compartimento da cultura de neurônios ou o compartimento central de crescimento neural. Adicione 20 microlitros da substância em teste no orifício inferior, conectado ao canal de interesse, e aspire pelo orifício diretamente acima. Neste exemplo, um tratamento seletivo foi aplicado ao compartimento central, e neste exemplo, o compartimento lateral foi tratado.Os tratamentos foram estabelecidos em um minuto e mantidos por 60 minutos. Os cultivos celulares de neurônios podem então ser monitorados para medir a propagação de materiais ou patologia. Após dominado, muitos dispositivos microfluídicos podem ser preparados em uma única manhã.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa ideia de como preparar culturas neuronais minimalistas em seus próprios laboratórios e utilizá-las para investigar os mecanismos subjacentes à propagação de materiais e doenças no cérebro.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo mostra um procedimento para a geração de culturas de neurônios a partir de embrião tarde e córtex do rato pós-natal precoce. Essas culturas podem ser usados ​​para imunocitoquímica, bioquímica, eletrofisiologia, cálcio e sódio de imagem e fornecer uma plataforma para estudar o desenvolvimento neuronal de animais transgênicos que carregam uma mutação genética pós-natal letal.

Preparação de Dissociated rato Culturas Neuron Cortical

Nós desenvolvemos um romance de vários compartimentos neurônio plataforma microssistema co-cultura para a investigação in vitro a interação do SNC axônio glia. A plataforma é capaz de realizar até seis experimentos independentes em paralelo e foi fabricado usando um recém-desenvolvido macro / micro método de fabricação híbrida.

Um compartimento Multi-glia do SNC Neuron-Co-cultura plataforma microfluídica

Aqui nós fornecemos um protocolo para a cultura de neurônios corticais de ratos na presença de uma camada de alimentação glial. Os neurônios cultivados estabelecer polaridade e criar sinapses, e pode ser separada da glia para uso em diversas aplicações, tais como eletrofisiologia, imageamento de cálcio, ensaios de sobrevivência celular, imunocitoquímica e RNA / DNA / isolamento de proteínas.

Bilaminar Co-cultura de neurônios de rato Primária Cortical e Glia

Este vídeo demonstra um método para diferenciar células progenitoras neurais humanas (NPCs) em neurônios. Os NPCs são introduzidos em uma co-cultura estabelecida de neurônios corticais de astrócitos de camundongos e ratos, promovendo a diferenciação de NPCs em neurônios. A diferenciação é confirmada pela visualização das células sob um microscópio confocal.

Uma técnica de co-cultura para diferenciar células progenitoras neurais humanas em neurônios

Este vídeo ilustra um método para estabelecer uma co-cultura indireta de neurônio-astrócitos usando uma abordagem compartimentada. Nessa configuração, neurônios e astrócitos são espacialmente separados, mas compartilham um meio condicionado. Fatores neurotróficos liberados pelos astrócitos promovem a diferenciação de neurônios e a formação de conexões sinápticas, sugerindo interações neurônio-glia.

Uma técnica indireta de co-cultura neurônio-astrócitos para estudar as interações neurônio-glia

Células neuroprogenitoras Humanos (NPCs) foram expandidas em condições de proliferação. NPCs foram diferenciadas em culturas ricas em neurônios na presença de uma combinação de neurotrofinas. Marcadores neuronais foram detectadas pela técnica de imunofluorescência. Para isolar uma população pura de neurônios, NPCs foram diferenciadas em PEN lâminas de membrana e captura de microdissecção a laser foi realizada.

Captura Laser Microdissecção de neurônios a partir de células diferenciadas neuroprogenitoras humanas em cultura

Um protocolo para gerar um sistema de co-cultura consistindo de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), neurônios corticais primários e astrócitos é descrito. Este sistema de co-cultura permite a detecção da formação de contatos e circuitos sinápticos entre novos neurônios derivados de iPSC e neurônios corticais pré-existentes que expressam channelrhodopsina-2.

Uma Abordagem Optogenetic para Avaliar Formação das conexões neuronais em um sistema de co-cultura

Este estudo apresenta uma técnica para o isolamento de neurônios de ratos neonatais WT. Requer a dissecção cuidadosa da medula espinhal do rato neonatal, seguida da separação de neurônios do tecido da medula espinhal através da clivagem mecânica e enzimática.

Isolamento e cultura de neurônios da medula espinhal de ratos neonatais

Este protocolo descreve uma co-cultura microglia-neuronal estabelecida a partir de células neuronais primárias isoladas de embriões de camundongos nos dias embrionários 15-16 e microglia primária gerada a partir dos cérebros de camundongos neonatais nos dias pós-natais 1-2.

Geração e co-cultura de microglia primária murina e neurônios corticais

A técnica amperométrica mede a libertação de dopamina a partir de uma única célula, detectando a corrente de oxidante produzido pela oxidação da dopamina espontânea. Braçadeira de tensão simultânea e metodologia amperometria revelar a relação mecanicista entre a "atividade" geral do transportador de dopamina eo papel regulador da atividade no transporte reverso da dopamina.

Medição única célula de liberação de dopamina com simultânea de tensão-clamp e amperometria

Aprenda a preparar co-culturas neuronais interconectadas com precisão de célula única usando dispositivos microfluídicos e padrões de biomateriais por plasma. Este método permite estudos de neurociência com entradas celulares mínimas.

Preparação de Neuronal co-culturas com precisão única célula

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