A utilização de orofaringe Intratraqueal Administração PAMP e Lavagem Broncoalveolar para avaliar a resposta imune do hospedeiro em camundongos

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar o uso de intratraqueia orofaríngea, administração de LPS e lavagem broncoalveolar para avaliar a resposta imune do hospedeiro em camundongos. Isso é feito inoculando primeiro o camundongo com LPS usando administração orofaríngea. Na segunda etapa, uma cânula traqueal é inserida no lavado broncoalveolar ou, em seguida, é coletada através da cânula para avaliação da resposta inflamatória local.

Na etapa final, os pulmões são inflados com formalina para avaliação histopatológica. Em última análise, o perfil de citocinas do intestino e a histopatologia do pulmão podem ser analisados para avaliar a resposta imune do hospedeiro ao LPS. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como administração intranasal e administração intratraqueal cirúrgica, é que essa técnica é relativamente simples de executar e permite dosagem precisa e deposição pulmonar.

Para intratraquealmente, injete o LPS primeiro. Suspenda um camundongo anestesiado em uma intubação. Fique ao lado dos incisivos frontais, garantindo que o animal esteja bem contido e que a boca e a língua estejam acessíveis.

Prenda suavemente a língua com uma pinça reta, depois segure a língua com uma pinça angular e puxe suavemente o músculo para fora da boca até sentir uma leve resistência ao segurar a língua. Nesta posição, administre uma dose de 50 microlitros de LPS na parte de trás da garganta e cubra imediatamente as narinas do animal com um dedo enluvado por cinco a 10 respirações para coletar o banho após o sacrifício. Em seguida, faça uma incisão horizontal em todo o comprimento da cavidade peritoneal e uma incisão vertical da cavidade peritoneal até a mandíbula inferior do camundongo.

Em seguida, segure os dois lados da incisão com a pinça e puxe suavemente a pele para longe das cavidades peritoneal e torácica subjacentes. Em seguida, faça uma grande incisão ao longo do comprimento da cavidade peritoneal dos órgãos genitais ao esterno, tomando cuidado para evitar cortar o diafragma. Em seguida, desloque suavemente os intestinos dentro da cavidade peritoneal para permitir o acesso a um dos rins.

Corte a veia renal que leva ao rim para servir como um ponto de drenagem para perfusão. Em seguida, corte o diafragma com uma tesoura, tomando cuidado para evitar os pulmões e o coração. Para expor o lado esquerdo do coração, use uma seringa de 10 mililitros equipada com uma agulha de calibre 27 para perfundir manualmente o coração com PBS.

O sangue restante deve ser drenado da incisão da veia porta. Em seguida, use uma tesoura cega e romba para cortar cuidadosamente a caixa torácica ao longo do esterno. Tomando cuidado para evitar cortar o coração e os pulmões.

Isole suavemente o coração e os pulmões e, em seguida, corte cuidadosamente cada seção da caixa torácica com a tesoura cega e romba o mais próximo possível da coluna. Depois de remover completamente as duas seções das costelas, separe as glândulas salivares para expor a traqueia e corte cuidadosamente os músculos que recobrem a traqueia sem cortar a própria traqueia. Agora separe a clavícula e segure suavemente o timo, afastando-o do coração.

Em seguida, remova o timo com uma tesoura para evitar cortar o coração ou os pulmões. Em seguida, use uma tesoura afiada e afiada para fazer uma pequena incisão horizontal grande o suficiente para prender firmemente uma cânula na traqueia, um a dois anéis abaixo da laringe. Em seguida, insira uma cânula de modo que a extremidade cônica se estenda de dois a três anéis traqueais.

Abaixo da incisão, passe uma sutura de seda entre a traqueia e o esôfago, puxando a sutura firmemente na cânula para prendê-la. Em seguida, encha uma seringa de um mililitro com HBSS e insira suavemente sua isca na cânula usando um movimento lento, mas constante. Em seguida, injete aproximadamente 900 microlitros de HBSS na traqueia para inflar os pulmões e, em seguida, imediatamente com a extração do HBSS, dispense a válvula recuperada em um tubo cônico de 15 mililitros.

Depois de repetir a lavagem mais duas vezes para coletar aproximadamente três mililitros de válvula. Armazene a válvula no gelo para dissecar os pulmões Para análise histopatológica, insira uma seringa de 10 mililitros em um suporte de insuflação pulmonar e conecte o tubo à isca, a isca à torneira de parada e a torneira de parada à seringa, confirme se a torneira está na posição fechada e, em seguida, encha a seringa com solução de formalina tamponada neutra. Quando a seringa estiver completamente cheia de fixador, coloque uma toalha absorvente sob a extremidade aberta do tubo e abra a torneira de parada para permitir que o fixador encha o tubo.

Assim que o fixador começar a fluir do tubo, feche imediatamente a torneira de parada e encha novamente a seringa até o topo com fixador. Em seguida, passa suavemente o segundo pedaço de fio de sutura sob a traqueia, aproximadamente um a dois anéis traqueais. Abaixo da extremidade da cânula, dê um único nó solto na sutura e, em seguida, insira o tubo da inflação do mouse.

Fique na cânula. Abra a torneira de parada e deixe os pulmões se encherem pela inflação da gravidade. E então, quando os pulmões atingirem seu nível máximo de inflação, puxe a sutura com força e dê um segundo nó.

Feche a torneira de parada e remova o tubo da cânula e, em seguida, segure a sutura com uma pinça. Puxe firmemente a sutura para baixo em direção à cavidade torácica e puxe suavemente a cânula de volta para o nariz do camundongo para remover a cânula. Em seguida, levante suavemente a traqueia da cavidade do pescoço e use uma tesoura romba para cortar o mimo da traqueia para a sutura da maré.

Quando a traqueia estiver livre dos tecidos subjacentes, comece a puxar a traqueia para longe do camundongo e levante suavemente os pulmões para fora da cavidade torácica. Em seguida, corte cuidadosamente o tecido conjuntivo que segura os pulmões na cavidade torácica com uma força constante para cima e continue puxando a traqueia para longe do corpo do camundongo, tomando cuidado para não cortar os pulmões. Finalmente, fixe os pulmões em 10 mililitros de formina tamponada.

Em modelos de exposição ao LPS, tanto a temperatura corporal quanto o peso, nossos marcadores substitutos típicos de morbidade animal e progressão da doença, o desafio com LPS causará uma diminuição significativa na temperatura corporal nas primeiras seis horas, conforme ilustrado no gráfico, que aumenta gradualmente de volta à linha de base ao longo de 24 horas. O peso corporal, no entanto, diminui constantemente ao longo de 24 horas, quando atingirá o pico e se recuperará gradualmente nas próximas 48 a 72 horas. Assim, a temperatura corporal é um marcador mais apropriado para avaliar os estágios iniciais do início da inflamação.

Enquanto o peso corporal é mais confiável durante os estágios posteriores da patogênese e recuperação, a exposição ao LPS das vias aéreas resulta em um influxo significativo de leucócitos. Os pulmões nas primeiras seis horas células associadas à resposta imune inata do hospedeiro podem ser observadas na válvula valvar. A celularidade continua a aumentar nas próximas 24 a 48 horas, quando a resposta imune atinge o pico e, subsequentemente, entra em um período de resolução da inflamação Em 24 horas, um número significativo de neutrófilos está presente nos pulmões e pode ser observado na válvula após a coloração diferencial.

As avaliações de celularidade valvar fornecem uma técnica robusta e quantificável para caracterizar as células associadas à resposta imune do hospedeiro nos pulmões. Esse aumento é consistente com um influxo significativo de neutrófilos nas vias aéreas, vasos sanguíneos e parênquima pulmonar. A histopatologia pulmonar pode ser avaliada de forma eficaz usando um sistema de pontuação semiquantitativo, como pode ser observado na imagem.

O LPS induz um aumento significativo da inflamação perivascular, peribronquiolar e parenquimatosa. A administração de LPS induz altos níveis de mediadores pró-inflamatórios locais e sistêmicos, incluindo várias citocinas associadas à resposta imune inata, conforme detectado por Eliza As citocinas comuns que são reguladas positivamente nos pulmões após a administração de LPS incluem TNF, alfa IL um beta e IL seis. Os níveis de citocinas sistêmicas também podem ser avaliados no soro usando as mesmas técnicas demonstradas para as avaliações intestinais.

O método de fixação por deslocamento por gravidade facilita as condições ideais de avaliação histopatológica em comparação com pulmões não inflados ou pulmões de insuflação manual fixados por gravidade. A inflação demonstra características uniformes, permitindo pontuação precisa, dano alveolar reduzido, visualização aprimorada e maior resolução Avaliações de inflamação, inflação manual dos pulmões normalmente resultam em áreas não uniformes de inflação. Essas áreas são frequentemente parcialmente infladas, resultando em colapso tecidual que é comumente confundido com características patológicas por revisores novatos.

A inflação manual também resulta em áreas dos pulmões que estão superinfladas, resultando em espaços alveolares amplamente danificados. Pulmões não inflados demonstram espaços alveolares colapsados e áreas difíceis de resolver e avaliar sem treinamento extensivo. Da mesma forma, devido ao colapso do órgão, esta técnica não permite a visualização dos pulmões como eles aparecem in situ.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como induzir e avaliar a inflamação pulmonar aguda mediada por LPS em camundongos usando um procedimento simples de administração orofaríngea e traqueal não cirúrgica e coleta de tecido.