Transcrição e Metabolite Profiling de Avaliação dos Árvore Tabaco e Poplar como matéria-prima para a indústria baseada em Bio
16 de maio de 2014
Biomassa da planta oferece um recurso renovável para vários produtos, incluindo combustível, alimentação, alimentação e uma variedade de materiais. Neste trabalho, investigar as propriedades de árvore de tabaco (Nicotiana glauca) e álamo como fontes adequadas para um gasoduto biorrefinaria.
O objetivo geral deste procedimento é estabelecer e otimizar dados de sequenciamento de metabólitos e RNA do material foliar da árvore do tabaco para estimativas orientadas à biologia de sistemas. Isso é feito coletando primeiro o material biológico de uma série de folhas em desenvolvimento. O segundo passo é realizar a extração do material usando os solventes apropriados, dependendo da análise subsequente.
Em seguida, metabólitos e hidrocarbonetos são medidos usando cromatografia gasosa, espectrometria de massa ou GCMS e os transcritos são analisados usando aquisição de dados de sequenciamento de RNA. Em última análise, a combinação de perfil de metabólitos e perfil transcricional via sequenciamento de RNA é usada para mostrar como as folhas do tabaco desenvolvem hidrocarbonetos de cadeia longa e outros compostos importantes. Este método pode ser usado para identificar e quantificar importantes metabólitos úteis produzidos nas folhas da árvore do tabaco.
Embora este método possa fornecer informações sobre o metaboloma da árvore do tabaco. Também pode ser usado para outros sistemas, como tabaco ou espécies relacionadas. Geralmente, os indivíduos novos nesse método terão dificuldades porque as folhas do tabaco são difíceis de extrair um bom RNA.
Neste vídeo multi Bioo PRO, você verá membros do grupo FERNA extrair e metabolizar o perfil. Usando GCMS, você também verá um membro do Grupo Fraser extrair hidrocarbonetos e também um membro do meu próprio grupo que extrairá RNA para sequenciamento de RNA Comece cultivando plantas neko Oceana Glauca em vasos de 30 centímetros de diâmetro contendo M dois meios de cultivo profissionais, conforme detalhado no protocolo de texto para preparar os metabólitos primários, Colha as folhas e caules da planta e congele o material imediatamente liofilize os materiais vegetais congelados por liofilização por três dias, depois moa as amostras liofilizadas por moinho misturador com bolas de metal, alíquota dos materiais secos moídos finos resultantes em um tubo de centrífuga de dois mililitros ou frasco de vidro. Em seguida, alíquota de 10 miligramas de folha ou 20 miligramas de material vegetal seco moído em dois mililitros de tubos de fundo redondo com tampa de rosca.
Adicione 1,4 mililitros de metanol 100% e vórtice por 10 segundos. Em seguida, adicione 60 microlitros de atol de costela como um padrão quantitativo interno antes do vórtice. Por mais 10 segundos, adicione uma esfera de aço inoxidável e homogeneize o material com um moinho misturador por dois minutos a 25 hertz após centrifugação por 10 minutos.
Com uma gravidade de 11 000 vezes, transferir o sobrenadante para um frasco de vidro. Adicione 750 microlitros de clorofórmio e 1,5 mililitros de água antes de agitar a mistura por 10 segundos. Em seguida, transfira 150 microlitros da fase superior para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.
Em seguida, seque as amostras usando um aspirador rápido. É imperativo que as amostras sejam reduzidas à secura por três a 24 horas até que nenhum líquido residual esteja presente. Depois de seco, adicione 40 microlitros de cloridrato de metina.
Em seguida, agite a mistura em um agitador de bloco de calor horizontal por duas horas a 37 graus Celsius. Adicione 70 microlitros da mistura M-S-T-F-A antes de agitar novamente por duas horas a 37 graus Celsius. Gire as gotas na tampa por uma centrifugação curta antes, antes de transferir o líquido para frascos de vidro adequados para análise de GC MS.
O GCMS segue a análise dos dados configurando o software para a análise de dados de espectrometria de massa e selecionando a análise de dados a ser processada. Preparar um quadro dos picos de interesse detetados de acordo com a classe composta. Identificar os picos por coalizão de compostos padrão, posteriormente anotar os picos detectados usando análise de espectrometria de massa, algoritmos de caracterização estrutural, levantamento bibliográfico e pesquisa de banco de dados de metabólitos para extração de hidrocarbonetos.
Mergulhe cerca de 200 miligramas de folhas de ncoa glauco recém-colhidas insolventes durante dois a 20 minutos, retire as folhas e seque completamente os solventes por evaporação rotativa. Em seguida, ressuspender as amostras em um mililitro de hexano de grau HPLC. Prossiga para executar a análise do GCM das amostras usando os parâmetros detalhados no protocolo de texto.
Processe inicialmente os componentes do cromatograma usando um MS automatizado. Sistema de deconvolução e identificação e o NIST 98 MS. Biblioteca. Confirmar a identificação de hidrocarbonetos de acan de cadeia longa saturados, comparando os tempos de retenção e os padrões clássicos de fragmentação com as normas autênticas conhecidas. Em seguida, determine os hidrocarbonetos quantitativamente comparando as áreas de pico integradas com as curvas de resposta à dose.
Construído a partir de padrões autênticos, calcule as médias e o erro padrão das médias usando o software Excel. Este protocolo combina a extração de RNA TRIOL com um kit RN easy para obter moagem de RNA de alta qualidade 100 miligramas de material vegetal congelado em tubos de centrífuga de dois mililitros com uma bola de metal por um moinho misturador. Após a homogeneização da amostra, adicione um mililitro de triol após centrifugar o material por 10 minutos a 12.000 vezes a gravidade e quatro graus Celsius.
Transferir o sobrenadante para um novo tubo de reacção. Adicione 200 microlitros de clorofórmio e inverta o tubo várias vezes antes de incubar por três minutos em temperatura ambiente. Depois de centrifugar a mistura por 15 minutos.
Como antes, transfira a fase aquosa superior para um novo tubo de reação. Adicione aproximadamente 2,5 volumes de etanol. Inverta o tubo várias vezes e incube por 30 minutos a 80 graus Celsius negativos.
Em seguida, mova a amostra, incluindo qualquer precipitado, para uma coluna de rotação. Centrifugue a coluna por 15 segundos a 8.000 vezes a gravidade e descarte o fluxo. Adicione 700 microlitros de tampão de lavagem RW um, que é fornecido no kit de extração, à coluna de centrifugação e à centrífuga.
Novamente, após descartar o fluxo, adicione 500 microlitros do segundo tampão de lavagem, RPE também fornecido pelo kit à coluna de centrifugação. Centrifugue a coluna novamente e descarte o fluxo antes de adicionar mais buffer RPE e centrifugação. Como antes, em seguida, coloque a coluna de rotação em um novo tubo de reação de 1,5 mililitro e adicione 50 microlitros de centrífuga de água livre de RNAs, a coluna por um minuto a 8.000 vezes a gravidade para eluir, o RNA.
Remova o DNA residual usando um kit sem DNA de acordo com as instruções do fabricante. Como etapa final, determine a qualidade do RNA. O RNA deve ter números de integridade de RNA acima de oito antes de enviar o RNA para sequenciamento de próxima geração.
O perfil de HPLC mostra um resultado representativo da análise isoprenóide dos extratos de folhas de ncoa glauca. Os diferentes ISOPRENOIDES de C 40 e acima foram detectados usando um detector de matriz de fotodiodos. Os picos foram anotados com base em cromatografia de código e comparação espectral entre padrões autênticos.
Os dois cromatogramas MS são o resultado da análise de metabólitos primários de ncoa, folha de glauco e material do caule. O espectro MS de um pico correspondente à serina também é dado, como exemplo, a saída representativa do bioanalisador usado para determinar a qualidade do RNA é mostrada. Os dois picos principais no cromatograma correspondem a 18 s e 25 s ribossômicos, RNA indicando RNA intacto nesta amostra.
Picos adicionais de RNA ribossômico fragmentado apareceriam no caso de RNA parcial ou fortemente degradado Uma vez dominado. Esta técnica pode ser realizada rapidamente e é compatível com a análise de outros metabólitos após este procedimento. Outros métodos, como PCR em tempo real ou outras formas de análise de RNA, podem ser usados para responder a perguntas adicionais, como produção de pequenos RNAs ou expressão de genes específicos.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como extrair e avaliar dados de metabólitos da árvore do tabaco.
Visão Geral
Este estudo investiga as propriedades da árvore-do-tabaco (Nicotiana glauca) e do álamo como fontes potenciais para um processo de biorrefinação. O foco está na otimização de dados de metabólitos e sequenciamento de RNA obtidos a partir das folhas da árvore-do-tabaco.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Biologia vegetal
- Processos de biorrefinaria
- Metabolômica
Antecedentes
- A biomassa vegetal é um recurso renovável para diversos produtos.
- As folhas da árvore de tabaco são investigadas por suas propriedades metabólicas.
- O entendimento dos perfis de metabólitos pode aprimorar aplicações em biorrefinarias.
- A sequenciação de RNA auxilia na análise da expressão gênica relacionada à produção de metabólitos.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um método para extrair e analisar metabólitos de folhas de árvore de tabaco.
- Otimizar o sequenciamento de RNA para análise transcricional.
- Identificar e quantificar metabólitos úteis em folhas de árvore de tabaco.
Métodos Utilizados
- Coleta de material foliar de árvore de tabaco de séries desenvolvimentais.
- Extração de metabólitos utilizando solventes para análise subsequente.
- Medição de metabólitos e hidrocarbonetos por cromatografia gasosa e espectrometria de massas.
- Extração de RNA e sequenciamento para perfilagem de transcritos.
Resultados Principais
- Extração e perfilagem bem-sucedidas de metabólitos das folhas da árvore do tabaco.
- Identificação de hidrocarbonetos de cadeia longa e outros compostos importantes.
- Informações sobre o metaboloma da árvore do tabaco e suas possíveis aplicações.
- Método aplicável a outras espécies relacionadas.
Conclusões
- O estudo fornece um método robusto para extração de metabólitos e RNA.
- Os resultados aprimoram a compreensão do desenvolvimento da folha da árvore de tabaco.
- Implicações potenciais para processos de biorrefinaria utilizando biomassa vegetal.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite o perfilamento sistemático de metabólitos e transcritos em folhas de árvore de tabaco, apoiando a identificação de hidrocarbonetos de cadeia longa e isoprenoides relevantes para o desenvolvimento de matérias-primas baseadas em biotecnologia. Ao integrar CG-EM e sequenciamento de RNA, fornece uma base para avaliar a adequação da biomassa vegetal em processos sustentáveis de biorrefinaria. A abordagem auxilia na redução de riscos na validação de alvos ao associar os produtos metabólicos à atividade transcripcional em um sistema relevante para doenças.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da correlação entre metabólitos e transcritos na árvore do tabaco.
- Valor Operacional: Apoia a desmistificação biológica ao identificar vias funcionais envolvidas na biossíntese de hidrocarbonetos e isoprenoides.
- Valor Preditivo: Facilita a identificação de compostos ativos ao quantificar substâncias bioativas com potencial relevância industrial.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para triagem subsequente, estabelecendo protocolos reprodutíveis de extração e detecção de metabólitos.
- Valor Operacional: Garante a padronização de ensaios por meio de fluxos de trabalho padronizados de extração com solvente, derivatização e análise por GC-MS.
- Escalabilidade: Permite a reutilização da plataforma em espécies relacionadas devido a métodos adaptáveis de extração e sequenciamento.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinhamento de Biomarcadores Traducionais: Relaciona perfis de metabólitos (por exemplo, hidrocarbonetos de cadeia longa) com atividade transcricional, apoiando a descoberta de biomarcadores em sistemas baseados em plantas.
- Relevância do Modelo Pré-clínico: Utiliza a árvore do tabaco como um sistema relevante para doenças no estudo de acúmulo de biomassa e vias responsivas ao estresse.
- Avanço Ajustado ao Risco: Fornece dados quantitativos para orientar decisões de avançar/não avançar na seleção de matéria-prima para aplicações em biorrefinarias.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao conectar o perfilhamento de metabólitos com a análise transcritômica, apoiando as etapas de validação direcionada de alvos e identificação de compostos promissores.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao correlacionar níveis de metabólitos com dados de expressão gênica provenientes de sequenciamento de RNA.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios por meio da quantificação padronizada e reprodutível de metabólitos e hidrocarbonetos via GC-MS com padrões internos.
- Análises: Gera dados quantitativos de área dos picos e saídas espectrais que permitem análise comparativa entre estágios de desenvolvimento e condições de tratamento.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas à continuidade pré-clínica ao identificar relações entre metabólitos e transcritos preditivas da utilidade da biomassa.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para perfilagem de metabólitos e transcritos aplicável a outras espécies vegetais em processos de biorrefinaria.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista por meio da correlação multi-ômica.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e escalabilidade por meio de protocolos padronizados de extração, derivatização e sequenciamento.
- Valor Estratégico: Aprimora a tomada de decisões de avanço ou interrupção ao fornecer dados quantitativos de metabólitos e transcritos para a priorização de matérias-primas.
- Impacto no Portfólio: Permite decisões de avanço ajustadas ao risco com base em saídas validadas semelhantes a biomarcadores em sistemas vegetais.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em extração de metabólitos vegetais, operação de GC-MS e avaliação da integridade do RNA.
- Depende do acesso a GC-MS, HPLC, moinhos agitadores, evaporadores à vácuo e infraestrutura de sequenciamento de RNA.
- Necessita padronização entre equipes dos volumes de solvente, parâmetros de centrifugação e tempos de derivatização.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes graus de rigidez dos tecidos vegetais e estabilidade de metabólitos entre espécies.
- Limitado a metabólitos bem caracterizados devido à dependência de bancos de dados de referência para anotação, conforme observado na fonte.
