Name: Medição simultânea em pH endocítica e citossólicos Compartimentos em células vivas usando microscopia confocal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Aprenda a medir simultaneamente o pH vesicular e citosólico em células vivas usando microscopia confocal com as sondas HPTS e SNF F1. Este método permite estudar a dinâmica do pH intracelular em biologia celular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos ao Dr. Gilles Dupuis pela leitura crítica do manuscrito. 
Financiamento
Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde, concessão # MOP-126173. O C.M.D é membro do Centre de Recherche Clinique Étienne LeBel, financiado pelo Fonds de la Recherche en Santé (FRSQ).

1. Preparação das soluções de calibração para pH celular <ol><li> Adicionar os seguintes compostos de cinco tubos cónicos de 50 ml separados para preparar soluções a 5 para ser utilizados para a calibração: <ul><li> De NaCl (1 ml de 1 M de NaCl) (NaCl 1 M = 0,58 g em 10 ml de H 2 0) </li><li> KCl (6,75 ml de 1 M de KCl) (1 M KCl = 0,75 g em 10 ml de H 2 0) </li><li> Glucose (1 ml de 1 M de D-glicose) (1M de D-Glucose = 1,80 g em 10 ml de H 2 0) </li><li> MgS0 4 (0,05 ml de 1 M de MgSO4) (1 M MgSO4 = 1,20 g em 10 ml de H 2 0) </li><li> HEPES 20 mM (1 ml de HEPES 1M) (HEPES 1 M = 2,38 g em 10 ml de H 2 0) </li><li> CaCl2 (0,05 ml de 1M de CaCl2) (1 M CaCl2 = 1,47 g em 10 ml de H 2 0) Prepare todas as soluções em duas vezes destilada H 2 O (DDH 2 O). </li></ul></li><li> Complete cada solução com 35 ml de ddH2O e misturar com um agitador magnético até entãolução é alcançado. </li><li> Ajustar o pH de cada solução com 1 N de KOH ou HCl 1 N para se obter os valores de 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 e 7,5 de pH. Em seguida, ajustar o volume com água desionizada até um volume final de 50 ml. </li><li> Medida 5 mg de nigericina e adicioná-lo ao 670 ul de EtOH absoluto para se preparar uma solução de 10 mM de nigericina estoque. Atenção: nigericina é altamente tóxico e deve ser manuseado com muito cuidado (luvas, óculos de segurança e máscara). Misture a solução por inversão até a nigericina esteja completamente dissolvido. </li><li> Adicionar 0,05 ml de nigericina 10 mM (concentração final 10 uM) a cada solução de calibração. Nigericina é um ionóforo que aumenta a permeabilidade da membrana da célula e causa de equilíbrio do pH intracelular e extracelular, na presença de uma concentração de despolarização de K + extracelular. </li><li> Soluções de calibração podem ser armazenados até 1 mês a 4 ° C </li></ol> 2. Preparação celular <ol><li> Sob um Safet biológicay capuz, as células de semente de 35 milímetros x 10 milímetros em pratos de cultura de 2 ml de meio de crescimento suplementado com 10% de soro fetal bovino e antibióticos. Utilizar a quantidade de células necessárias para assegurar cerca de 50% de confluência após 24 hr. NOTA: Em nossos experimentos, usamos a linha de células HT-1080 e placa 1 x 10 5 células por placa de cultura. </li><li> Determinar o número de pratos de cultura necessárias para a 5 pratos de cultura adicionais experimento e placa a ser usada para a calibração. </li><li> Pratos de cultura em lugar de um de 37 ° C / 5% de CO2 durante pelo menos 24 horas. </li></ol> 3. Preparação de Sondas de pH sensores <ol><li> Prepare uma solução estoque 1M da sonda fluorescente pH 8 hidroxipireno-1, 3,6 trissulfónico, sal trissódico (HPTS / piranina) em DDH 2 a 0. Esta solução deve ser armazenada à temperatura ambiente e protegida da luz. </li><li> Prepara-se uma solução de reserva de 1 mM de 5 - (e-6)-carboxil seminaphthorhodafluor acetoximetil éster de etilo (C-SNARF-01:00; chamado Thereaepois SNARF-1) através da dissolução de 1 mg de SNARF-1 em 1,76 ml de DMSO. Misture bem por pipetagem repetida. SNARF-1 solução deve ser armazenada a -20 ° C e protegida da luz. </li></ol> 4. Labeling celular <ol><li> Dezasseis horas antes de imagem ao vivo de células, adicionar 2 ml de solução de estoque 1M HPTS (concentração final 1 mM) para cada placa de cultura contendo 2 ml de meio completo. </li><li> Retorne os pratos de cultura para a incubadora. A sonda HPTS é célula-impermeant, portanto, a etiqueta organelas a sonda deve ser tomada por pinocitose. Esta condição implica que as incubações das células com HPTS são realizadas em meio de cultura suplementado com soro. </li><li> Após a incubação com HPTS, lavar as células duas vezes com PBS estéril e adicionar 2 ml de meio isento de soro, durante pelo menos 2 horas. A incubação com SNARF-1 tem de ser realizada em meio isento de soro, porque o soro pode impedir a absorção da sonda. </li><li> Adicionam-se 10 ul de uma SNARF-1 de solução stock a 1 mM para se obter afinal concentração de 5 uM e permitir que as células a incubar durante 20 minutos a 37 ° C, sob luz fraca. C-1-SNARF concentração e tempo de incubação pode variar de acordo com o tipo de célula. </li><li> No final da incubação, lavar as células duas vezes em PBS estéril e adicionar 2 ml de meio isento de soro. </li></ol> 5. Adição de pH moduladores <ol><li> Para avaliar se o método pode detectar alterações de pH nas células, diferentes reagentes que modulam o pH intracelular pode ser usado: <ul><li> Bafilomicina A1, um inibidor específico da V-ATPase 5 </li><li> Isoforma permutador Na + / H + 1 (NHE-1) 6 </li><li> NH4Cl, uma base fraca que aumenta o pH intracelular 7 </li></ul><ol><li> Preparar soluções estoque de reagentes mencionados acima: <ul><li> Bafilomicina A1: acrescentar 10 ug de bafilomicina A1 a 160 ul de DMSO para se obter uma solução stock de 100 uM </li><li> EIPA: adicionar 25 mg de EIPA para 1,67 ml de metanol a obtina concentração final de 50 mM </li><li> NH4Cl: dissolver 0,53 g de cloreto de amónio em 10 ml de ddH2O para obter uma concentração final de 1 mM. </li></ul> Nota: Todas as soluções de reserva deve ser mantida a 4 ° C, excepto para bafilomicina A1, que deve ser armazenada a -20 ° C e protegida da luz. </li><li> Em pratos de cultura separados, adicionar um dos reagentes, tal como descrito abaixo: <ul><li> 2 ul de 100 uM bafilomicina A1 (concentração final 100 nM) </li><li> 1 ul de EIPA 50 mM (concentração final 25 uM) </li><li> 40 ul de 1M de NH 4 Cl (concentração final 20 mM) </li></ul></li><li> Incubar as células durante 30 min a 37 ° C. </li></ol></li><li> Vá para a aquisição de imagem. </li></ol> 6. Especificações do Microscópio de imagem de células vivas e configurações de aquisição <ol><li> Realize imagens ao vivo de células usando uma objetiva de 40X montado em um invertido digitalização microscopia confocal espectralpe equipado com um estágio XY motorizada, uma câmara de vidro que acomoda placas de cultura de fundo em um ambiente controlado (temperatura, umidade, CO 2) fase incubadora. </li><li> O instrumento confocal (Olympus FV1000) usada aqui está equipado com: <ul><li> Um laser de diodo 405 nm </li><li> Um laser de argônio de 40 mW (458 nm, 488 nm, 515 nm) </li><li> Um laser neon hélio (543 nm) </li><li> Objetivo de fluorita de 10x, NA0.4 </li><li> Um objectivo LUCPLFLN 40X, NA0.60 </li><li> Um objectivo óleo PLAPONSC PLANO APO 60X, NA1.4 </li><li> Um espelho dicróico 405/458/488/543 DM </li><li> A SDM 560 e um SDM 640 filtros dicróicas </li><li> Um filtro de barreira BA655-755 </li><li> A BS20/80 divisor de feixe </li><li> O software de análise de dados para a aquisição e análise de imagem, </li></ul></li><li> Uma vez que a incubadora estágio tem aquecido até 37 ° C e o microscópio está configurado, coloque um prato de cultura previamente incubadas com HPTS e SNARF-1 para a câmara de estágio imagem confocal. </li><li> Aepois de localizar uma área de interesse, ajuste as configurações de aquisição de software Figura 1. <ul><li> Configure dois conjuntos de canais virtuais. </li><li> Iniciar a primeira fase que corresponde ao HPTS excitação a 405 nm e coleta de emissão em 505-525 nm e SNARF-1 de excitação em 543 nm e coleta de emissão em 570-600 nm. </li><li> Inicie a segunda fase que corresponde ao HPTS excitação em 458 nm e coleta de emissão em 505-525 nm e SNARF-1 de excitação em 543 nm e coleta de emissão em 640 - 650 nm. </li><li> A abertura confocal está definido para 175 um por padrão e abertura ideal precisa ser configurado manualmente em 300 mm. </li><li> Tome Imagem por empilhamento de série secções ópticas horizontais (800 x 800 pixels) de 0,4 m de espessura. </li></ul></li></ol> NOTA: uma objetiva de 40X é útil para observar várias células simultaneamente e funciona bem para a visão organela. No entanto, a resolução espacial e intensidade do sinal são better conseguido usando uma objetiva de óleo 60X. Além disso, não há excitação ou de emissão de conversa cruzada entre os dois corantes. 7. Calibração de Sondas de pH de sensoriamento <ol><li> Antes da calibração, remover o meio da placa de cultura previamente incubadas com HPTS e SNARF-1, lavar duas vezes com PBS estéril e, em seguida, adicionar 2 ml de uma das cinco soluções de calibração. </li><li> Coloque o prato de cultura na câmara de estágio confocal. </li><li> Vá para a aquisição de imagens de lapso de tempo de acordo com as seguintes definições: <ol><li> Defina o número de imagens e tempo de duração do intervalo para o experimento. NOTA: Normalmente usamos um intervalo de 1 min entre as imagens por até 30 min. </li><li> Programe o obturador para fechar entre a aquisição de cada imagem. </li></ol></li><li> Gravar a intensidade de fluorescência por minuto em um software de folha de cálculo e de determinar o momento em que a intensidade de fluorescência é constante. PH intracelular é geralmente estável depois de 15 - 20 min. </li><li> REPEAT os passos 7.1 a 7.4 usando um novo prato de cultura para cada solução de calibração restante. </li></ol> 8. Aquisição de Dados <ol><li> Uma vez que a calibração foi feito, adquirir dados de amostra 4-5 campos escolhidos aleatoriamente contendo 15-20 células por campo. Duas imagens são obtidas para cada campo: um para rotulagem HPTS (vesículas) e o segundo para SNARF-1 rotulagem (citosol). </li><li> A fluorescência de fundo (zona extracelular) é subtraído digitalmente imagens fluorescentes de ambas as sondas. Vesículas rotulados e citosol de suas respectivas imagens armazenadas são selecionados usando uma máscara binária. Para cada sonda de pH-sensing, intensidades de fluorescência são medidos em uma escala numérica (0-4,095 escala de nível de cinza). A intensidade média de todos os pixels na organelo ou citoplasma é calculada e os valores são utilizados para calcular os rácios de fluorescência. </li></ol> 9. Data Analysis <ol><li> Vários pacotes de software estão comercialmente disponíveis para a análise de dados. IstoSoftware FluoView. </li><li> Em uma planilha, valores de registro e calcular índices de fluorescência da seguinte forma: No caso de HPTS, R = (F 458 nm / F 405 nm) e, no caso de SNARF-1, R = (F 644 nm / F 584 nm ). </li><li> Plotar os dados usando o software de gráficos científica como GraphPad Prism. A trama deve representar proporções de fluorescência (eixo Y) como uma função do pH (eixo X). Ajuste de curva é obtida por meio de regressão não-linear. </li><li> Recolhe intensidades de fluorescência das amostras, conforme descrito no passo 8.2 e calcular rácios de fluorescência. Use as curvas de calibração para transformar proporções em valores de pH. </li></ol>

<ol><li>Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+Homeostasis+of+cellular+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22News+Physiol+Sci%22%5BJournal%5D)">pH Homeostasis of cellular organelles.</a> News Physiol Sci. 17, 1-5 (2002).</li>
<li>Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulated+pH%3A+a+perfect+storm+for+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression.</a> Nat Rev Cancer. 11, 671-677 (2011).</li>
<li>Hinton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+a+subunit+isoforms+of+the+V-ATPase+in+pH+homeostasis+and+in+vitro+invasion+of+MDA-MB231+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Function of a subunit isoforms of the V-ATPase in pH homeostasis and in vitro invasion of MDA-MB231 human breast cancer cells.</a> J Biol Chem. 284, 16400-16408 (2009).</li>
<li>Overly, C. C., Lee, K. D., Berthiaume, E., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+of+intraorganelle+pH+in+the+endosomal-lysosomal+pathway+in+neurons+by+using+ratiometric+imaging+with+pyranine%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement of intraorganelle pH in the endosomal-lysosomal pathway in neurons by using ratiometric imaging with pyranine.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 3156-3160 (1995).</li>
<li>Drose, S., Altendorf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bafilomycins+and+concanamycins+as+inhibitors+of+V-ATPases+and+P-ATPases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Bafilomycins and concanamycins as inhibitors of V-ATPases and P-ATPases.</a> J Exp Biol. 200, 1-8 (1997).</li>
<li>Pedersen, S. F., King, S. A., Nygaard, E. B., Rigor, R. R., Cala, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NHE1+inhibition+by+amiloride-+and+benzoylguanidine-type+compounds.+Inhibitor+binding+loci+deduced+from+chimeras+of+NHE1+homologues+with+endogenous+differences+in+inhibitor+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">NHE1 inhibition by amiloride- and benzoylguanidine-type compounds. Inhibitor binding loci deduced from chimeras of NHE1 homologues with endogenous differences in inhibitor sensitivity.</a> J Biol Chem. 282, 19716-19727 (2007).</li>
<li>Alfonso, A., Cabado, A. G., Vieytes, M. R., Botana, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-pH+crosstalks+in+rat+mast+cells%3A+cytosolic+alkalinization%2C+but+not+intracellular+calcium+release%2C+is+a+sufficient+signal+for+degranulation%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Calcium-pH crosstalks in rat mast cells: cytosolic alkalinization, but not intracellular calcium release, is a sufficient signal for degranulation.</a> Br J Pharmacol. 130, 1809-1816 (2000).</li>
<li>Han, J., Burgess, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+intracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for intracellular pH.</a> Chem Rev. 110, 2709-2728 (2010).</li>
<li>Giuliano, K. A., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+intracellular+pH+of+BALB%2Fc-3T3+cells+using+the+fluorescence+of+pyranine%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determination of intracellular pH of BALB/c-3T3 cells using the fluorescence of pyranine.</a> Anal Biochem. 167, 362-371 (1987).</li>
<li>Willoughby, D., Thomas, R., Schwiening, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+intracellular+pH+changes+on+resting+cytosolic+calcium+in+voltage-clamped+snail+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The effects of intracellular pH changes on resting cytosolic calcium in voltage-clamped snail neurones.</a> J Physiol. 530, 405-416 (2001).</li>
</ol>

Nenhum conflito de interesses declarado.

Medição de pH quantitativa em imagens ao vivo de células de diferentes compartimentos celulares é necessário para medir com precisão as variações de pH em respostas das células aos desafios externos. No entanto, um dos principais obstáculos que resta é fácil e visam especificamente compartimentos celulares. A este respeito, alguns estudos puseram em evidência o uso de HPTS como um indicador de pH intracelular introduzido nas células por electroporação ou microinjecção 8-10. Estas técnicas sofrem de graves inc...

<table><tbody><tr><td>Soluções para calibração</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Fischer</td><td>L-11621</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Fischer</td><td>M-12445</td><td></td></tr><tr><td>D-Glicose (dextrose)</td><td>Fischer</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio</td><td>Fischer</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Fischer</td><td>M-1612</td><td></td></tr><tr><td>Água deionizada</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nigericina</td><td>Calbiochem</td><td>481990</td><td>Tóxico por inalação ou em contato com a pele</td></tr><tr><td colspan="4">Mantenha protegido da luz a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Placas de cultura &vazias; 35mm</td><td>BD Biosciences</td><td>354456</td><td></td></tr><tr><td>sondas</td><td></td><td></td><td></td>sensíveis ao pH</tr><tr><td>8-Hidroxipireno-1,3,6-ácido trisulfônico (HPTS)</td><td>Life technologies</td><td>H-348</td><td>Mantenha longe da luz à temperatura ambiente</td></tr><tr><td>5-(e-6)-Carboxy SNARF&reg;-1, Éster Acetoximetílico, Acetato</td><td>Life technologies</td><td>C-1271</td><td>Mantenha longe da luz e da umidade a -20 > C</td></tr><tr><td>Dimetil Sufoxide (DMSO)</td><td>Fischer</td><td>BP231-1&nbsp;</td><td>nocivo</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS) 100X</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Fischer</td><td>M-12445</td><td>20 g</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico</td><td>Fischer</td><td>S369-1</td><td>115 g</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td>J.T Baker</td><td>3246-01</td><td>20 g</td></tr><tr><td>Água deionizada</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Leve para 1 L</td></tr><tr><td>Autoclave e ajuste o pH para 7,4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1X</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 100X</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Fischer</td><td>L-11621</td><td>40,5 g</td></tr><tr><td>Água desoinizada</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Leve para 5 L</td></tr><tr><td>moduladores</td><td></td><td></td><td></td>de pH</tr><tr><td>Bafilomicina A1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-1793</td><td></td></tr><tr><td>5- (N-Etil-N-isopropil)amilorida (EIPA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3085</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de amônio</td><td>Fischer</td><td>A649-500</td><td></td></tr></tbody></table>

medição simultânea em ph endocítica e citossólicos compartimentos em células vivas usando microscopia confocal

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

O pH intracelular é rigidamente regulado e diferenças de pH entre o citoplasma e as organelas foram relatadas1. A regulação do pH celular é crucial para o controle homeostático de processos fisiológicos que incluem: síntese de proteínas, DNA e RNA, tráfego vesicular, crescimento celular e divisão celular. Alterações na homeostase do pH celular podem levar a alterações funcionais prejudiciais e promover a progressão de várias doenças2. Vários métodos estão disponíveis para medir o pH intracelular, mas muito poucos deles permitem a medição simultânea do pH no citoplasma e nas organelas. Aqui, descrevemos em detalhes um método rápido e preciso para a medição simultânea do pH citoplasmático e organelar usando microscopia confocal em células vivas3. Este objetivo é alcançado com o uso de dois corantes raciométricos com sensor de pH que possuem particionamento seletivo do compartimento celular. Por exemplo, SNARF-1 é compartimentado dentro do citoplasma, enquanto HPTS é compartimentado dentro de organelas endossômicas / lisossômicas. Embora o HPTS seja comumente usado como um indicador de pH citoplasmático, esse corante pode rotular especificamente vesículas ao longo da via endossômico-lisossômica após ser absorvido pela pinocitose3,4. Usando essas sondas de detecção de pH, é possível medir simultaneamente o pH dentro dos compartimentos endocítico e citoplasmático. O comprimento de onda de excitação ideal do HPTS varia dependendo do pH, enquanto para o SNARF-1, é o comprimento de onda de emissão ideal que varia. Após o carregamento com SNARF-1 e HPTS, as células são cultivadas em diferentes soluções calibradas de pH para construir uma curva padrão de pH para cada sonda. A imagem celular por microscopia confocal permite a eliminação de artefatos e ruído de fundo. Devido às propriedades espectrais do HPTS, esta sonda é mais adequada para medição do compartimento endossômico levemente ácido ou para demonstrar a alcalinização das organelas endossômicas/lisossômicas. Este método simplifica a análise de dados, melhora a precisão das medições de pH e pode ser usado para abordar questões fundamentais relacionadas à modulação do pH durante as respostas celulares a desafios externos.

Para a medição simultânea de pH em ambos os compartimentos da célula intracelular e endossomal / lisossomal, foram usadas as sondas de pH de detecção fluorescente raciométrica Snarf-1 e HPTS. SNARF-1 é restrita ao compartimento citosólico enquanto HPTS permite a medição de o compartimento endossomal / lisossomal raciométrica pH. Carregamento celular com HPTS para 16 horas permite a sua localização seletiva em endossomas / 4 lisossomos. Um exemplo típico de fluorescência registada a partir de células HT-1080 c...

Vários métodos estão disponíveis para medir o pH intracelular, mas muito poucos deles permitem a medição simultânea do pH citoplasmático e organelar. Aqui, descrevemos em detalhes uma metodologia rápida e precisa para medir simultaneamente o pH citoplasmático e vesicular por imagem raciométrica de células vivas.

Medição simultânea em pH endocítica e citossólicos Compartimentos em células vivas usando microscopia confocal

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

O objetivo geral do experimento a seguir é medir simultaneamente o pH vesicular e citosólico em células vivas por microscopia confocal. Isso é conseguido primeiramente incubando as células com as sondas sensoras de pH, HPTS e SNF F1, que marcam os compartimentos endossomais e lisossomais e o citosol, respectivamente. Em seguida, as células são colocadas em uma câmara com controle ambiental sob um microscópio confocal, e o software é configurado para medir a fluorescência das sondas na câmara.As células são incubadas com diferentes soluções calibradas de pH. Uma curva padrão de pH é construída utilizando uma regressão não linear. Equações exponenciais são determinadas para ambas as sondas e posteriormente utilizadas para converter as intensidades de fluorescência das amostras em valores de pH.Este método permite a determinação do pH vesicular e citosólico em amostras após diversos tratamentos e pode viabilizar o estudo da regulação do pH intracelular durante processos biológicos. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes para medição do pH intracelular é que o nosso método permite a medição da dinâmica do pH intracelular em células vivas, eliminando artefatos e ruído de fundo durante a aquisição de imagens. Para demonstrar o procedimento, será apresentado Fess Lucier, o estudante de doutorado que desenvolveu este método. Para a calibração do pH celular, é necessário preparar uma série de cinco soluções de 50 mililitros com pH variando de 5,5 a 7,5 em incrementos de 0,5.Adicione uma gota normal de hidróxido de potássio ou ácido clorídrico gota a gota para ajustar os valores de pH. Em seguida, adicione a cada solução calibrada em pH 0,05 mililitros do gersin IOR. A 10 milimolar, para uma concentração final de 10 micromolar, o risin aumentará a permeabilidade da membrana celular na presença de concentrações despolarizantes de potássio extracelular. Semeie as células sob capela em placas de cultura de 35 milímetros com dois mililitros de meio contendo 10% de soro bovino fetal e antibióticos, com o objetivo de atingir 50% de confluência após 24 horas de incubação a 37 graus Celsius.Após semear todas as placas necessárias para o experimento, semeie cinco placas adicionais para a calibração. Incube essas placas por 24 horas, 24 horas depois e 16 horas antes da aquisição de imagens. Adicione dois microlitros do marcador de organelas HPTS a um molar para uma concentração final de um milimolar de HPTS na solução na manhã seguinte, cerca de três horas.Antes da aquisição de imagens, remova o HPTS realizando duas lavagens com PBS. Em seguida, adicione dois mililitros de meio livre de soro e deixe as células incubarem por pelo menos mais duas horas.Imediatamente antes da aquisição de imagens, incubar as células com cinco micromolares de snf, um, adicionando 10 microlitros de snf, um a um milimolar, após o período de incubação com snf, um. Lavar as células duas vezes com PBS e adicionar dois mililitros de meio livre de soro, em seguida, prosseguir com a aquisição de imagens. As células.A imagem das células deve ser realizada com um microscópio confocal invertido espectral, equipado com estágio motorizado e câmara ambiental. Ao utilizar placas de Petri de plástico, uma objetiva de 40 x é a mais apropriada. O software deve ser ajustado para dois conjuntos de canais virtuais no software, ajuste o comprimento de onda de excitação e os comprimentos de onda de emissão.Para o HPTS e o SNF um, a abertura confocal é definida como 175 mícrons por padrão, e a abertura ideal precisa ser ajustada manualmente para 300 mícrons. Uma vez que a câmara tenha atingido 37 graus Celsius, inicie a calibração, lave uma placa de células mais duas vezes usando PBS e, em seguida, substitua o meio pela primeira solução de calibração. Agora, posicione as células na câmara e calibre ambas as sondas sensíveis a pH, adquirindo até 30 imagens com intervalos de um minuto.Cada pilha de imagens pode ser coletada com espessura de 0,4 mícrons e 800 pixels quadrados. E entre as imagens, o obturador deve ser programado para permanecer fechado. Anote a intensidade fluorescente a cada minuto, a qual geralmente se estabiliza por volta dos 20 minutos.Uma vez que a fluorescência esteja estável, capture imagens de quatro ou cinco campos contendo de 15 a 20 células e ambas as sondas. Essas imagens são utilizadas para os cálculos da curva. Repita este processo para cada solução de calibração.Em seguida, prossiga com a aquisição de imagens das placas das condições experimentais para as quais não são necessários lavagens. Ao analisar cada imagem, primeiramente subtraia digitalmente a fluorescência de fundo extracelular. Então, selecione vesículas marcadas e citosol a partir das imagens armazenadas utilizando uma máscara binária. Para cada sonda de detecção de pH, as intensidades de fluorescência são medidas em uma escala de zero a 4.095.Calcule a intensidade média para todos os pixels na organela ou no citoplasma. Usando esses valores, calcule as razões de fluorescência para HPTS e para snf. Para curvas de calibração, plote as razões de fluorescência obtidas para cada solução de calibração em função do pH; o ajuste da curva de calibração deve ser feito utilizando uma equação exponencial.Por fim, utilize as curvas de calibração para transformar as razões em valores de pH e, assim, obter os valores de pH citosólico e de organelas em células vivas sob condições experimentais. Obteve-se evidência clara de que o HPTS marca tanto compartimentos endossomais quanto lisossomais por meio de coloração dupla com transferrina conjugada ao Alexa 546 para marcar endossomos ou com uma sonda fluorescente lissotrópica, LysoTracker.Imagens em lapso de tempo na cor vermelho profundo foram coletadas para cada sonda conforme descrito em células HT 10 80. Cinco soluções de calibração foram testadas para avaliar a estabilidade da fluorescência após 15 minutos nas soluções, como as soluções com pH 6 e pH 7,5. Na curva de calibração para um determinado pH, os dados representam a razão entre as intensidades de fluorescência em 558 e 405 nanômetros para HPTS ou em 644 e 584 nanômetros para SNF um. Ambas as curvas foram ajustadas com uma equação exponencial.A eficiência do método em células vivas HT 10 80 foi avaliada utilizando cloreto de amônio, uma base fraca que aumenta o pH intracelular. A base elevou o pH do citosol e das vesículas. O método também foi avaliado utilizando B micina, A um, um inibidor de va a TPAs bamy, A um induziu alcalinização dos compartimentos endossomal e lisossomal, mas não alterou o pH citosólico.Por fim, foi testado o EIPA, um inibidor da NHE1. Ele acidificou o citosol até um pH de 6,62, mas não afetou o pH. Por enquanto.O estudo da homeostase de pH celular tem sido limitado tanto por mudanças rápidas de pH que ocorrem dentro das células, quanto pela falta de ferramentas para investigar o pH no interior das células. Descrevemos aqui uma abordagem simples e passo a passo para medir simultaneamente o pH citosólico e endossomal em células vivas individuais. Isso é especialmente importante para o estudo da homeostase de pH celular em células nas quais mutações ou fármacos podem afetar a entrada e saída de prótons no compartimento endossomal.

simultaneous-ph-measurement-endocytic-cytosolic-compartments-living

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

O vídeo demonstra a medição simultânea dos níveis de cálcio intracelular e alterações no potencial de membrana em células endoteliais de segmentos de artéria cerebral de camundongos. O tubo endotelial isolado é carregado com um indicador fluorescente de cálcio e tratado com um medicamento que induz a liberação intracelular de cálcio, resultando em uma alteração no potencial de membrana. A fluorescência do indicador permite a medição dos níveis de cálcio e um eletrodo de registro é inserido em...

Medição simultânea do cálcio intracelular e do potencial de membrana em um endotélio cerebral de camundongo

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Estudo da fagolisossomo Biogenesis em macrófagos ao vivo

O pH fagossômico influencia a maturação do fagossomo, a produção de oxidantes, a morte fagossômica, bem como a apresentação do antígeno. Aqui descrevemos um método raciométrico para medir as mudanças de pH no curso do tempo e no ponto final em fagossomos individuais em fagócitos vivos usando microscopia de fluorescência.

Medindo phagosome pH Raciometrico por microscopia de fluorescência

Este manuscrito descreve um método simples para medir o pH e phagosomal área, bem como o pH citoplasmática de neutrófilos humanos e de rato utilizando o indicador de medida proporcional seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, ou S-1. Isto é conseguido usando microscopia de fluorescência confocal ao vivo de células e análise de imagem.

Imaging o neutrófilos fagossoma e citoplasma utilizando um indicador de pH Ratiometric

As mitocôndrias pode utilizar o potencial electroquímico através da membrana seu interior (Δ Ψm) para sequestrar cálcio (Ca2 +), o que lhes permite moldar citosólica de Ca 2+ de sinalização dentro da célula. Descreve-se um método para medir simultaneamente mitocôndrias Ca 2+ de fixação e ΔΨ m em células vivas utilizando corantes fluorescentes e microscopia confocal.

Medição simultânea de mitocondrial de cálcio e mitocondrial potencial de membrana em células vivas por Microscopia fluorescente

Rotular o domínio extracelular de uma proteína de membrana com um fluoróforo sensível ao pH, superecliptic pHluorin (SEP), permite a localização subcelular, expressão, e o tráfico de ser determinado. proteínas imagiologia SEP-rotulado com microscopia de fluorescência de reflexão total interna (TIRFM) permite a quantificação dos níveis da proteína na membrana do RE e periférico plasma.

Utilizando Receptores pHluorin-tag para monitorar subcelular Localização e Tráfico

Este protocolo descreve um método novo, permitindo a visualização quantitativa da formação do complexo de proteínas SNARE, baseado na transferência de energia de ressonância de Förster e vida de fluorescência, microscopia de imagem.

Visualizando intracelular SNARE tráfico pela vida de fluorescência, microscopia de imagem

Demonstrado aqui são protocolos para isolar (1) recém endoteliais cerebrais intactos "tubos" e medições (2) simultâneas de cálcio endotelial e potencial durante o endotélio-derivado hiperpolarização de membrana. Além disso, esses métodos permitem a otimização farmacológica de cálcio da célula endotelial e sinalização eléctrica como variáveis experimentais individuais ou interativas.

Medições simultâneas de cálcio intracelular e potencial de membrana no endotélio Cerebral rato recém isoladas e intacta

Apresentado aqui é o protocolo da técnica Conpokal, que combina microscopia de força confocal e atômica em uma única plataforma de instrumentos. Conpokal fornece a mesma célula, mesma região, imagens confocal simultâneas e caracterização mecânica de amostras biológicas vivas.

Microscopia confocal e força atômica (Conpokal) em células vivas

Este protocolo descreve uma técnica de imagem confocal para detectar três modos de fusão em células adrenals de chromaffin bovinas. Esses modos de fusão incluem 1) close-fusion (também chamado de kiss-and-run), envolvendo abertura e fechamento de poros de fusão, 2) stay-fusion, envolvendo abertura de poros de fusão e manutenção do poro aberto, e 3) redução de fusão, envolvendo encolhimento vesícula fundido.

Microscopia Confocal para medir três modos de dinâmica de poros de fusão em células adrenal chromaffin

O protocolo descreve uma plataforma microfluídica avançada para medir quantitativamente a dinâmica da secreção de citocinas de células mononucleares individuais do sangue periférico humano. A plataforma mede até três citocinas em paralelo (IL-6, TNFα e IL-1β) para cada célula individual estimulada com lipopolissacarídeo como exemplo.

Abordagem microfluídica para resolver a secreção simultânea e sequencial de citocinas de células polifuncionais individuais 

Aprenda a medir simultaneamente o pH vesicular e citosólico em células vivas usando microscopia confocal com as sondas HPTS e SNF F1. Este método permite estudar a dinâmica do pH intracelular em biologia celular.

Medição simultânea em pH endocítica e citossólicos Compartimentos em células vivas usando microscopia confocal

Explorar mais vídeos