Captura de Espectrometria de Massa Compound - uma ferramenta poderosa para identificar novos c-di-GMP efetoras Proteínas

O onipresente segundo mensageiro c-di-GMP controla o crescimento e o comportamento de muitas bactérias. Desenvolvemos uma nova tecnologia baseada em espectrometria de massa composta de captura para identificar e caracterizar bioquimicamente as proteínas de ligação c-di-GMP em praticamente qualquer espécie bacteriana.

O objetivo geral do experimento de espectrometria de massa composta de captura é capturar e identificar proteínas de ligação GMP de matriz cíclica. Isso é conseguido fracionando, uma cultura de células por prensa francesa e removendo o dado cíclico livre gmp. Usando uma coluna PD 10 como segunda etapa, o composto de captura é adicionado e ativado por luz ultravioleta para reticular covalentemente as proteínas de ligação GMP da matriz cíclica ligadas ao composto de captura na ausência ou presença de um excesso de GMP da matriz cíclica livre.

Em seguida, o composto de captura é ligado a esferas magnéticas revestidas com estreptavidina para lavar intensamente as proteínas capturadas. Finalmente, as proteínas capturadas são digeridas e preparadas para espectrometria de massa para identificar os peptídeos gerados. Os resultados são então analisados in silico. A principal vantagem do CCMS de nossos métodos existentes, como a coprecipitação, é que o composto de captura melhora a captura específica de parceiros diretos e permite condições de lavagem adversas graças à ligação de custo covalente.

Agora, este método pode fornecer informações sobre a sinalização cíclica bacteriana di GMP. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como sinalização de nucleotídeos em geral e praticamente qualquer molécula alimentada para o composto de captura. Antes de iniciar este procedimento, prepare e lise as células de aerógeno p através de uma ultracentrífuga de células de pressão francesas ultra o lisado celular a 100.000 vezes G por uma hora a quatro graus Celsius.

Depois de salvar o sobrenadante, lave o pellet com um mililitro de um tampão de lise x, pipetando para cima e para baixo após ultracentrifugação nas mesmas condições de antes. Congele rapidamente o pellet em nitrogênio líquido e, em seguida, armazene a amostra congelada a menos 20 graus Celsius até ser usada para a captura de proteínas de membrana. Em seguida, lave-se uma coluna de dessalinização PD 10 com 10 mililitros de tampão de lise a frio.

Despeje o sobrenadante no PD 10 para remover os nucleotídeos e, em seguida, elua com quatro mililitros de tampão de lise fria em incrementos de 500 microlitros. Use o ensaio de Bradford para determinar as frações mais concentradas. Em seguida, agrupe as frações selecionadas em um tubo de 1,5 mililitro Resus.

Suspenda o pellet previamente armazenado em 500 a 1000 microlitros de um x tampão de captura sem detergente. Adicione uma solução de 1% de peso por volume de purina Beta D multipurina de acaso à amostra. Em seguida, incube a amostra a quatro graus Celsius por pelo menos duas horas em uma roda giratória.

Quando terminar, ultracentrifugue a amostra a 100.000 vezes G por uma hora a quatro graus Celsius. Após a ultracentrifugação, transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mililitros. Neste ponto, misture 300 microgramas de proteína com um milimolar de G-D-P-G-T-P-A-T-P-C-T-P e 20 microlitros de cinco x tampão de captura.

Ajuste o volume de reação para 100 microlitros com água. Depois de incubar a amostra a quatro graus Celsius em uma roda giratória, adicione 10 micromolares de composto de captura GMP de matriz cíclica. Em seguida, incubar a amostra a quatro graus Celsius durante pelo menos duas horas para a fracção solúvel ou durante a noite para a fracção de membrana numa roda rotativa no escuro.

Após uma breve centrifugação e remoção da tampa, reticulação por ativação da porção reativa do composto de captura GMP da matriz cíclica com luz ultravioleta por quatro minutos usando uma caixa de linha de tampa. Em seguida, adicione 25 microlitros de tampão de lavagem de cinco x e 50 microlitros de estreptococos bem ressuspensos AVID em esferas magnéticas. Homogeneizar suavemente a amostra.

Em seguida, incube a amostra a quatro graus Celsius por uma hora em uma roda giratória. Depois de capturar as esferas na tampa com um ímã, lave as frações solúveis seis vezes em 200 microlitros de um tampão de lavagem X após lavar uma vez em 200 microlitros de água de grau HPLC lavar seis vezes em 200 microlitros de 80% aceto nitrilo e duas vezes em 200 microlitros de água de grau HPLC para a fração de membrana lavar cinco vezes em 200 microlitros de um tampão de lavagem X e diminuir as concentrações de labuta final beta D multi púrico à parte. Em seguida, ressuspenda as esferas em 20 microlitros de bicarbonato de amônio 100 milimolares para a fração solúvel e 100 bicarbonato de amônio milimolar mais oito uréias molares.

Para a fração de membrana, transferir cada suspensão para tubos de 1,5 mililitro. Depois de incubar a fração de membrana, adicione 0,5 microlitros de 200 tris milimolares. Duas carboxietil fosfina para ambas as frações e incubar a 60 graus Celsius por uma hora com agitação a 500 RPM.

Assim que as amostras esfriarem a 25 graus Celsius, adicione 0,5 microlitros de acetamida de 400 milimolares recém-preparada após a incubação no escuro. Adicione 0,5 microlitros de 0,5 molar e acetilcisteína a cada fração. Em seguida, incube as amostras a 25 graus Celsius por 10 minutos com agitação a 500 RPM.

Neste ponto, adicione um microlitro de LY C à fração de membrana após incubação noturna a 37 graus Celsius. Adicione dois microgramas de tripsina a cada amostra e envolva-os em paraforme para evitar o ressecamento. Depois de incubar e girar as amostras, transfira o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mililitro com a ajuda do ímã para evitar a coleta das contas.

Em seguida, adicione cinco microlitros de ácido tricloroacético a 5% e um microlitro de ácido clorídrico de dois molares à fração solúvel, adicione 15 microlitros de ácido tricloroacético a 5% e cinco microlitros de ácido clorídrico de dois molares à condição da fração de membrana. C 18 micro colunas de centrifugação com 150 microlitros de acetonitrilo girando 20 segundos a 2.400 RPM. Uma vez que as colunas tenham sido equilibradas duas vezes com 150 microlitros de ácido tri-fluoroacético 0,1%, carregue a amostra e gire por dois minutos.

A 2000 RPM, recarregue o fluxo nas colunas. Depois de repetir a fiação e lavar as colunas com ácido tri-fluoroacético 0,1 e aceto nitrilo, pegue um novo tubo e elua duas vezes com 150 microlitros de ácido tri-fluoroacético 0,1% e 50% de aceto nitrilo. Uma vez que os peptídeos tenham sido secos em um aspirador de velocidade, ressuspenda-os novamente em 40 microlitros de 98% de água, 2% de acetil nitrilo e 0,15% de ácido fórmico.

Uma vez que as amostras tenham sido sonicadas por 20 segundos, gire-as por cinco segundos a 12.000 RPM Após o vórtice e a rotação, transfira as amostras para frascos de HPLC para análise lc MS MS. A lista inicial de ocorrências de uma cultura de fase logarítmica de aérgeno P compreende 768 proteínas de fração solúvel e 433 proteínas de fração de membrana Após a remoção de proteínas capturadas não especificamente, a lista foi reduzida para 76 proteínas de fratura solúveis e 133 proteínas de fração de membrana. Isso incluiu 13 proteínas solúveis e 21 de membrana do aerogênio P que são conhecidas ou previstas para se ligarem ao corante cíclico. GMP.

As outras 63 proteínas solúveis e 112 de membrana são novas matrizes cíclicas putativas. Proteínas de ligação a GMP, que não contêm um dos domínios de ligação de GMP de matriz cíclica conhecidos. CCMS com extratos celulares colhidos de diferentes condições de crescimento e com várias matrizes cíclicas intracelulares.

Concentrações de GMP também foram usadas. No geral, 74% dos componentes de sinalização p aerogênio, PO um dado cíclico e GMP conhecidos ou previstos foram capturados. Dado que pelo menos nove desses genes foram transcritos sob condições específicas e que alguns podem não se ligar à matriz cíclica, GMP, esse grau de cobertura pode estar próximo da saturação.

Isso, juntamente com a observação de que a maioria desses componentes foi capturada com alta especificidade, argumenta fortemente que essa técnica é eficaz e poderosa. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a seleção de candidatos potentes será alcançada comparando a especificidade de captura de efetores DGP psíquicos conhecidos. Assim, seguindo este procedimento, métodos como Drac, ubi, reticulação, varredura diferencial, micros de fluorometria ou telemetria isotérmica podem ser realizados para validar uma ligação específica dos candidatos ao ciclo desse GMP.