Cromatográfica em camada delgada (TLC) Separações e Bioensaios de extratos de plantas para identificar compostos antimicrobianos

O objetivo geral deste procedimento é identificar metabólitos vegetais que apresentam atividade antimicrobiana contra bactérias anaeróbias. Isso é realizado primeiramente separando um extrato vegetal por cromatografia em camada delgada ou CLC. Em seguida, o cromatograma é cortado em zonas que compreendem um ou mais compostos.

As zonas são então colocadas em ágar inoculado com bactérias anaeróbicas e incubadas. Após a incubação, as zonas são removidas e as placas são coradas para identificar compostos que inibem o crescimento bacteriano. Os dados resultantes revelam a presença ou ausência de metabólitos vegetais antimicrobianos.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da nutrição de ruminantes, como quais são os efeitos dos metabólitos secundários das plantas na utilização de nutrientes por microrganismos específicos. Embora este método revele compostos vegetais que inibem bactérias ruminais, ele também pode ser aplicado para identificar compostos inibitórios a outras bactérias ou fungos.

Neste protocolo, compostos fenólicos do trevo vermelho serão utilizados para demonstrar a identificação de compostos antimicrobianos por meio da biografia de contato. Comece limpando as placas de cromatografia em camada delgada ou placas CCF, trabalhando em uma cabine de segurança química. Prepare quantidade suficiente de solvente de limpeza para cobrir o fundo da câmara de eluição para CCF, bem como a borda inferior de uma placa de CCF.

Quando colocado dentro da câmara aqui, prepara-se acetato de etila e metanol na proporção de dois para um. Em seguida, utilizando luvas e trabalhando em uma capela de exaustão, use uma tesoura para cortar placas de sílica flexíveis com suporte de alumínio ou plástico, ajustando-as ao tamanho da câmara de eluição.

Insira as placas na câmara com as tampas apoiadas nas paredes da câmara. As placas não devem tocar umas nas outras. Cubra a câmara e deixe o solvente subir pelas placas por ação capilar.

Quando o solvente atingir o topo das placas, remova-as da câmara e organize-as em posição vertical na capela até que o solvente evapore. Uma vez que as placas estejam secas, verifique se impurezas migraram próximo ao topo das placas de TLC. Elas aparecerão como uma faixa amarela sob luz visível ou como uma faixa fluorescente sob luz ultravioleta.

Se a maior parte da placa ainda apresentar uma coloração amarelada, repita o processo de limpeza na mesma câmara de TLC usando o mesmo solvente. Após remover as placas de TLC da câmara, descarte o solvente. Deixe o solvente residual evaporar completamente antes de usar a câmara na próxima etapa do protocolo.

Em seguida, para remover a umidade residual que pode afetar a migração dos compostos na sílica, posicione as placas verticalmente em uma estufa de secagem a 100 graus Celsius por 10 a 15 minutos para placas de 20 por 20 centímetros, e por cinco minutos para placas de 7 por 10 centímetros. Após as placas estarem secas, deixe-as esfriar até a temperatura ambiente antes de carregá-las com os extratos. Para preparar as câmaras para a separação dos extratos, use uma tesoura para cortar um pedaço de papel filtro ligeiramente abaixo da altura da câmara e com largura aproximadamente igual à metade do perímetro da câmara.

Este papel funcionará como um pavio para puxar os solventes pela parede da câmara e saturar o compartimento com papéis solventes, melhorando assim a reprodutibilidade das separações. Em uma capela, misture os solventes aqui. Os solventes utilizados são acetato de etila e metanol na proporção de quatro para um (volume por volume). Despeje a mistura de solventes na câmara e cubra.

Use um lápis para marcar levemente a origem em um ponto da placa de TLC que ficará acima da superfície do solvente de eluição na câmara. Se o material absorvente da placa de TLC for macio e facilmente danificado, faça marcas nas bordas, como mostrado aqui. Em seguida, dissolva os extratos em quantidade suficiente de solvente orgânico para obter uma solução concentrada em vez de uma suspensão turva.

Aqui, o solvente utilizado é o metanol. Utilizando micropipetas capilares ou uma seringa microlitros, carregue os padrões e as amostras como faixas estreitas, deixando uma borda de um centímetro nas laterais da placa; permita que as faixas sequem — ventilar a placa ou colocá-la em uma câmara de fluxo ajuda a acelerar a secagem. Após a secagem das faixas, recarregue as amostras novamente no mesmo local ou sobre o local anterior.

Se for necessária uma concentração maior de amostra na placa, repita conforme necessário na câmara de CCF. Certifique-se de que a mecha inteira tenha sido saturada com o solvente. Em seguida, com pinça ou pegador, coloque as placas dentro da câmara de CCF.

As placas não devem tocar o pavio. Tampe a câmara e deixe as placas desenvolverem até que a frente do solvente atinja o topo da placa. Retire as placas do tanque de TLC e marque a altura da frente do solvente com um lápis.

Deixe a placa secar. Em uma capela, desenvolva quaisquer placas de TLC restantes na mesma câmara de TLC, que geralmente pode ser usada por um dia inteiro se mantida fechada. Se a quantidade de solvente na câmara diminuir visivelmente, prepare mais mistura de solvente após as placas estarem secas.

Visualize as bandas sob luz visível ou UV. Uma câmara de visualização com uma lâmpada UV portátil é conveniente, especialmente se a lâmpada puder detectar compostos em ambas as faixas de UV de onda curta de 254 nanômetros e UV de onda longa de 365 nanômetros. Use um lápis para delinear as bandas e obtenha imagens das placas utilizando um sistema de documentação fotográfica de géis equipado com luzes superiores, UV e/ou luz visível.

Por fim, para auxiliar na caracterização das bandas, calcule o fator de retenção ou valores de RF medindo primeiro a distância percorrida pelo composto, depois medindo a distância percorrida pelo solvente e dividindo o primeiro valor pelo segundo. Uma vez que as posições das bandas tenham sido marcadas, as placas podem ser armazenadas para uso posterior. Utilize na bioensaio.

Envolva as placas em plástico e cubra-as com papel alumínio. Armazene as placas a menos 20 graus Celsius. O tempo máximo de armazenamento depende da estabilidade do composto, pois a sílica não é neutra.

Alguns compostos podem se degradar enquanto estão na placa de cromatografia em camada delgada (TLC). Em preparação para o ensaio de biografia por contato, prepare e inocule o meio para bactérias produtoras de amônia em excesso (HAB) sob condições anaeróbicas. A cultura utilizada neste caso é a cepa *Clostridium sticklandii* sr.

Cultive a cultura em fase exponencial ou estacionária a 39 graus Celsius. Utilize técnicas estéreis anaeróbicas ao trabalhar com microrganismos anaeróbicos. Prepare zero vírgula setenta e cinco por cento peso por volume.

Ágar no mesmo meio utilizado para cultivar as bactérias após a temperatura do ágar ter diminuído para menos de 60 graus Celsius. Inocule o ágar fundido com 1% volume por volume da cultura e misture suavemente, colocando-o imediatamente em uma câmara anaeróbica e despejando-o em placas de Petri plásticas de 15 por 100 milímetros com auxílio de tesoura. Corte a placa de cromatografia em camada delgada (TLC) em zonas contendo a(s) faixa(s) de interesse.

Usando uma caneta marcadora, marque os lados traseiros das placas. Coloque uma tira de TLC não utilizada sobre a placa de ágar como controle. Em seguida, coloque as bandas com a face voltada para baixo sobre as placas de ágar.

Incubar as placas com o lado do ágar voltado para baixo na câmara anaeróbica. Incubar por 24 horas a 39 graus Celsius com pinça. Remover as bandas de TLC das placas de ágar enquanto estiverem dentro da câmara anaeróbica.

Adicione ácido tetra oleico vermelho gota a gota sobre as superfícies das placas de ágar. Deixe a cor se desenvolver por pelo menos 20 minutos. Quando a placa controle ficar completamente vermelha, remova as placas da câmara anaeróbica.

Clostridium stick Landi é uma bactéria anaeróbica, portanto começará a perder viabilidade imediatamente após a remoção da câmara anaeróbica, mas a cor permanece estável por mais de 24 horas. Utilizando uma câmera digital, fotografe as placas sob luz visível em um fundo que forneça contraste suficiente. Uma coloração vermelha brilhante será observada quando as células vivas forem coradas.

Células mortas não são coradas. Aqui são mostradas separações representativas por sílica, em camada delgada (TLC), de extratos de trevo vermelho contendo compostos fenólicos. A separação em acetato de etila e hexano na proporção de nove para um, ao longo de 8,5 centímetros, resultou em cinco bandas, sendo uma completamente resolvida a partir da origem.

Os padrões carregados foram Formin Bio Canon A e Genine. Quatro bandas desta placa foram aplicadas em culturas com Clostridium stick Landi, uma bactéria ruminal produtora de amônia em alta taxa, durante 24 horas e coradas com vermelho de tetraoleína conforme descrito aqui. A incubação com a banda um, Bio Canon A, e parte da banda dois, quatro Monon nein, em ágar semeado com bactérias resultou em uma zona bem definida de inibição.

No entanto, a incubação do restante da faixa dois, juntamente com as faixas três e quatro, não inibiu o crescimento bacteriano. Esses resultados demonstraram que o bio Canon A foi inibitório para o crescimento de see stickland eye, mas a forma aone Nein não foi. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a técnica é flexível.

Outros microrganismos de teste podem ser utilizados desde que sejam selecionados meios apropriados e incluídos controles para garantir que a química de separação e o método de detecção sejam compatíveis com este procedimento. Outras técnicas, como cromatografia líquida de alta eficiência e espectrometria de massas, podem ser utilizadas para auxiliar na caracterização dos compostos antimicrobianos identificados em um bioensaio.