Name: Técnica de Subnormothermic Ex Vivo Fígado de Perfusão para o armazenamento, Avaliação e Reparação de enxertos de fígado Marginal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Aprenda a técnica de perfusão subnormotérmica ex vivo de fígado para preservar e avaliar enxertos marginais antes do transplante. Este método reduz lesões de preservação e permite avaliação funcional.

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O estudo foi suportado por concessões do transplante de órgãos Roche Research Foundation (ROTRF) e Astellas pesquisa. Markus Selzner foi apoiado por uma concessão do Desenvolvimento ASTS carreira. Matthias Knaak foi apoiado pelo Bolsa Astellas Research. Agradecemos Uwe Mummenhoff ea família Birmingham para o seu apoio generoso.

Uma visão geral esquemática do protocolo é apresentado na Figura 1. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/51419/51419fig1highres.jpg" /> Figura 1 Protocolo do estudo. O desenho do estudo suíno de lesão hepática é baseada em uma doação pós-morte cardíaca modelo (DCD). Após a dissecção de todos os vasos do fígado, morte cardíaca é induzida seguido de 45 min de isquemia do enxerto quente. Para simular um transporte do enxerto entre o doador eo receptor hospitais em um ambiente clínico, o enxerto é armazenado no gelo durante 4 h após a frio, dual flush. Após o armazenamento a frio, o órgão é perfundido subnormothermic de 6 horas, a fim de avaliar a estabilidade de perfusão. Em um modelo de transplante, o tempo de perfusão podia ser encurtado, a fim de recarregar as baterias de armazenamento de energia e para avaliar a viabilidade de órgãos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51419/51419fig1large.jpg" target="_blank">Ao clicar ele</a>re para ver uma versão maior desta figura. 1. Os animais NOTA: suínos machos Yorkshire, 30-35 kg, foram utilizados para este estudo. Todos os animais receberam cuidados de acordo com as &#39;&#39; Princípios de Laboratório Animal Care &#39;&quot;formulados pela Sociedade Nacional de Pesquisa Médica e do&#39; Guia para o Cuidado de Animais de Laboratório &#39;&quot;, publicado pelo National Institutes of Health. O Comitê do Instituto Geral de Toronto Research Animal Care aprovado todos os estudos. 2 Órgão Retrieval <ol><li> Casa masculinos porcos Yorkshire em unidades de investigação para uma semana antes da perfusão / transplante para reduzir o nível de estresse e para acostumar os animais às condições habitacionais. Menos de 2 dias de alojamento dentro da instalação levará a uma reação física induzida pelo estresse, o que pode alterar o resultado da perfusão 22,23. </li><li> Anestesiar porcospor uma via intramuscular (im) a injecção de uma mistura de cetamina (25 mg / kg), a atropina (0,04 mg / kg) e midazolam (0,15 mg / kg). </li><li> Antes da intubação, garantir o porco respira espontaneamente 2 L de O 2 tratados com 5% de isoflurano. Pulverizar as cordas vocais com lidocaína a 2% 2 min antes da intubação para evitar espasmos nas cordas vocais. Por exemplo, para um porco 35 kg utilizar uma fr 6,5. tubo traqueal. Bloqueie o tubo traqueal com 3-5 ml de ar ambiente. </li><li> Após a intubação, use a capnografia para confirmar a intubação correta. Abaixe o gás isoflurano a 2%. Defina o ventilador para 14-16 ciclos / min e um volume corrente de 10 ml / kg de peso corporal. </li><li> Coloque a 20 L por via intravenosa (iv) do cateter numa das veias da orelha para permitir a infusão de uma solução de lactato de Ringer (200 ml por hora). Em seguida, esfregue o porco e cobri-lo com campos estéreis. </li><li> Fazer uma incisão na linha média, seguido por uma extensão lateral esquerda. Use uma toalha para cobrir grandes e pequenas entranhas e movê-los para o lado esquerdo. </li><li> INFE separadoveia cava rior (IVC) e aorta distais do outro; ramos da aorta ligam a parte de trás; isolar e artérias renais livres do tecido aderente. </li><li> Divida o ligamento falciforme e do ligamento triangular com bisturi. </li><li> Solte a veia porta por uma incisão do peritônio entre o pâncreas ea veia portal. Empate fora veias de drenagem do pâncreas para a veia porta. </li><li> Dissecar o tronco celíaco abaixo da veia porta e segui-lo para trás, para a aorta. Cerque-se a artéria mesentérica com um empate 2-0; circundam as artérias esplênica e gástrica esquerda, que posteriormente ao ramo do tronco celíaco. Dissecar o tronco celíaco fora da veia portal. </li><li> Ligadura dos vasos linfáticos dentro do ligamento hepatoduodenal para evitar vazamento linfático. Divida a artéria gástrica direita entre laços. Ligadura veias menores. Separe o ducto biliar do ligamento e dividi-lo distal após a ligadura. </li><li> Dissecar a aorta por trás do diafragma entre coração e tr celíacaunk; colocar um laço 2-0 em torno da aorta. </li><li> Solte o fígado a partir da cava inferior, no lado direito com bisturi eletro; use uma tesoura para a parte superior entre cava e fígado. </li><li> Remover a vesícula biliar e cauterizar sangradores de leito da vesícula biliar. </li><li> Administrar iv 1.000 IU / kg de peso do dador de heparina. Para um modelo de DCD, induzir parada cardíaca por injeção intracardíaca de 40 mval KCl 3 min após a administração de heparina. Definir parada cardíaca como o ponto de partida de isquemia quente. </li><li> Para a perfusão, coletar 1,6 L de sangue de porco em CPDA sacos (citrato, fosfato, dextrose, adenosina) imediatamente após a morte cardíaca. Realizar uma rotação suave (2.000 xg sem freio). Remover o plasma eo creme leucocitário sob condição estéril (biossegurança classe gabinete II) e armazenar os eritrócitos no CPDA bolsas para transfusão. </li><li> Veia portal e aorta canular com linhas de descarga do órgão. Amarre os laços estabelecidos anteriormente em torno femoral, renais, baço, mesentérica e arte gástrica esquerdaérie bem como a aorta superior. Para um modelo de coração batendo doador (HBD), realizar a punção da aorta e veia porta em condições coração batendo. </li><li> Após 45 min de isquemia quente, lave o fígado com a solução (UW) da Universidade de Wisconsin usando dupla perfusão via aorta (saco de pressão) e da veia porta (gravidade driven). </li><li> Corte o fígado de porco, deixando os restantes navios de comprimento. </li><li> Durante a preparação para trás da mesa, prender o IVC superior usando um Satinsky prender e lavar o fígado uma segunda vez com cerca de 0,5 L de solução UW retrógrada via menor IVC até a saída da veia porta é clara. </li><li> Empate fora todos os ramos arteriais da aorta e tronco celíaco. Executar uma perfusão pressão arterial back-mesa com cerca de 0,5 L de solução de UW. </li><li> Lave o ducto biliar utilizando solução UW. </li><li> Canular as partes superiores e inferiores do IVC usando meia &quot;x 3/8&quot;, com redutores de Luer Lock; canular a veia porta e da artéria hepática por meio de 3/8 &quot;; x 1/4 &quot;e 1/4&quot; x 3/8 &quot;redutores com Luer Lock. Use a veia cava superior e inferior, como a drenagem venosa. </li><li> Inserir o fígado num saco de órgãos, fechar o saco de órgãos, e armazenar o fígado em gelo até a perfusão foi iniciada. </li></ol> 3 Ex vivo fígado Perfusão <ol><li> Preparar a solução de perfusão contendo solução de 2,000 ml de Steen, 400 ml de eritrócitos lavados, 550 mg de piruvato de sódio, 100 ml de solução de amino ácido (10% Travasol), 10 mg de gluconato de cálcio, 1000 IE de insulina de acção rápida, 1 g de cefazolina, 500 mg de metronidazol e 10.000 UI de heparina. Adicionar outras moléculas para vasodilatação, imunossupressão, a eliminação de espécies reativas de oxigênio, ou o tratamento de células do fígado com base no protocolo de estudo particular. </li><li> Para a componente de diálise, utilizar dialisado padrão contendo 3,5 mM de potássio, 25 mM de bicarbonato, glicose 27 mM, assim como 275 mg / l de piruvato. </li><li> Configure o circuito de perfusão (esquema veja a Figura 2). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/51419/51419fig2highres.jpg" /> Figura 2 circuito configurado. Vindo do reservatório principal como o ponto de partida e final, a solução de perfusão é impulsionado por uma bomba centrífuga por meio de um oxigenador. Logo após a oxigenação da solução, o circuito é dividida em uma linha de menor corrente para uma unidade para a homeostase do dialisador, e uma linha de electrólito maior execução de um filtro de leucócitos para a redução dos glóbulos brancos (WBC) remanescentes. A solução que funciona através do dialisador retorna para o reservatório principal. Depois de o filtro de leucócitos, o circuito divide-se novamente em duas linhas iguais. Uma linha funciona a alta pressão (cerca de 60 mm Hg) directamente no interior da aorta para perfundir a artéria hepática. A outra linha de drena para um segundo reservatório. A partir deste reservatório da veia porta é perfundido. A pressão da perfusão portal depende da energia de elevação do nível de solução do reservatório (cerca de 2-6 mm Hg). Todos os fluidos são drained elevação através da infra e supra-hepática cava de volta para o reservatório principal. Para a redução da gravidade e da perfusão homogénea, o fígado é colocado numa piscina cheia de água com temperatura regulada. Ele é separado da água por uma membrana impermeável e nada em uma suspensão de perfusão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51419/51419fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol><li> Colete todos os fluidos do circuito em um 3 L reservatório (reservatório principal) e apertar a saída. </li><li> Conecte a saída de uma bomba centrífuga seguido por um oxigenador comercial. </li><li> Atrás do oxigenador, dividir o tubo em duas linhas. Conecte uma linha de um dialisador e drená-lo de volta para o reservatório principal. Conecte a segunda linha para um filtro de redução de leucócitos. </li><li> Dividir a linha após o filtro de redução de leucócitos para uma linha arterial, que fornece solução de perfusão da artéria hepática e um portal vlinha genas entregar solução de perfusão para um segundo reservatório, que escoa para dentro da veia portal de saída por gravidade. Prenda o ingresso portal. </li><li> Conecte a linha arterial para uma linha de veia cava drenando para o principal reservatório para o recolhimento do fluido. </li><li> Para a recolha de ascite ou de vazamento de solução de perfusão do fígado, preparar uma linha de sucção ligada ao reservatório principal. </li></ol></li><li> Libertar a braçadeira de saída do reservatório principal e encher o circuito com a solução de perfusão. Inicie a bomba centrífuga a 1500 rounds / min. A solução de perfusão irá conduzir através da linha arterial na linha de veia cava volta para o reservatório principal. Certifique-se de que todo o ar é expulso do circuito. </li><li> Ligue o fornecimento de gás para o oxigenador. </li><li> Pegue o fígado fora do gelo. Lave a solução UW utilizando solução salina. </li><li> Inserir o fígado, com o seu lado convexo para baixo para facilitar o acesso aos recipientes, de preferência em um ambiente livre de gravidade para evitarcompressão de órgãos na superfície de contato. Use um banho de água calor e coolable. Ajuste da temperatura a partir do circuito de banho e água a 20 ° C. Cobrir o banho de água com uma membrana impermeável e colocar o fígado para que a membrana. Reduzir a gravidade compressão conduzido por submergir o fígado com solução de perfusão. </li><li> Reduzir a velocidade da bomba centrífuga de 1000 voltas / min e colocar duas pinças para a ligação de linhas arteriais e vena cava. Em seguida, corte o tubo entre os grampos. Usando um conector de 3 vias, juntar as duas saídas de cava e conectá-los à linha de veia cava. </li><li> Solte o grampo da linha arterial, derrame solução de perfusão na cânula arterial para se livrar de bolhas, e conecte a linha para a cânula. Aumentar a bomba centrífuga de 1500 voltas / min. Solte o segundo grampo da linha de veia cava. </li><li> Solte o grampo do reservatório venoso portal, a fim de preenchê-lo. Vamos solução de perfusão despeje na Cannu portalla e ligá-lo. Tome especial cuidado dos níveis de fluido no reservatório estáveis ​​portal. </li><li> Conecte as linhas de pressão para as Luer Locks das cânulas arterial, portal e de veia cava. </li><li> Para imitar as condições fisiológicas, se aplicam os tratamentos para o vaso de direita. Injectar glicose na veia portal e não na linha arterial, a fim de estabelecer um gradiente de mimetizar um aumento do gradiente de glicose na veia porta e de induzir a síntese de glicogénio 24,25. </li><li> Depois de ligar o fígado para o circuito, aumentar a temperatura até 33 ° C dentro de 60 min. </li><li> Apontar para um escoamento a partir arterial em cerca de 250 ml / min a 40 mmHg. Isto pode chegar a 700 ml / min durante a perfusão, uma vez que a pressão é aumentada até 70 mmHg. </li><li> Ao iniciar a temperatura, apontar para um fluxo da veia portal de 500-600 ml / min em 3-5 mmHg. Depois de elevar a temperatura, monitorar o fluxo venoso portal, que irá aumentar até 1.100 ml / min a 4-6 mmHg. Evitar de ultrapassar a pressão portal acima Physiologicavalores l (cerca de 8 mmHg) para proteger fenestrações sinusoidais 26. Evitar exceder fluxo total acima de 2.000 ml / min, de modo a evitar danificar o órgão. Defina o seu escoamento para -2 mmHg, diminuindo o reservatório principal para evitar congestão hepática por obstrução do fluxo funcional. </li><li> Adicionar o componente de diálise para o circuito de modo a equilibrar a solução de perfusão para valores predeterminados 27. Definir o fluxo de dialisato de 500 ml / h. Tome especial atenção para ajustar o fluxo de saída de diálise de modo a que a solução de perfusão que não é diluído nem concentrada. Na primeira hora da perfusão o principal reservatório deve ser visto com cuidado! </li><li> Assegurar a oxigenação do tecido homogéneo para recuperar e manter a função do órgão por meio de um componente principal da mistura de gases de O 2 (95-98%) e CO 2 (2-5%). Use gás variável durante a perfusão uma vez que o fígado muda o seu metabolismo e sua demanda pH durante a perfusão. </li><li> Manter o pH baixo durante o início daperfusão para proteger o órgão com o conceito paradoxo pH 28 e evitar danos nos tecidos grave que pode resultar a partir de ligações rápidas para pH fisiológico sob reoxigenação, uma vez que depois de armazenamento em solução UW, o órgão tem um pH abaixo de 7 acidótica Ajuste da pressão parcial de CO 2 continuamente para baixo para 25-30 mmHg de forma a que o pH vai atingir um nível fisiológico a 1 hr. </li><li> Adicionar bicarbonato de sódio-potássio ou para o circuito para atingir uma concentração fisiológica de bicarbonato de padrão na solução de perfusão. Injetá-lo cuidadosamente sob gás de sangue repetitivo e controle de eletrólitos. </li><li> Monitorar a perfusão por gás de sangue venoso e arterial periódica e AST analisa. O PO venoso 2 permanece acima de 175 mmHg durante a perfusão. Monitorar o fluxo ea pressão vascular e observe a perfusão estável por uma resistência vascular constante. </li><li> Manter o sistema de perfusão estável durante até 8 horas. No final do período de ex vivo de perfusão, frescoo sistema de perfusão a 20 ° C e, depois de desligar a tubagem do circuito do fígado, lavar a solução de perfusão para o fígado duplamente com uma solução de gelo frio de UW. Armazenar o fígado, uma vez mais colocados em gelo em um saco estéril de órgãos. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Em um modelo de porco que imita o transplante de fígado DCD, demonstramos que a perfusão hepática subnormothermic com uma solução de perfusão celular resulta em parâmetros estáveis ​​de perfusão, lesão hepática mínima, e metabolização hepática ativa. Nossa perfusão subnormothermic configurar demonstrou recuperar um homeostase hepatocelular e metabolismo. Armazenamento de glicogênio é restaurado e metabólitos são descartados. Ex vivo de perfusão do fígado como a técnica de preservação oferece, pela primeira vez, a oportunidade de avaliar os marcadores da função do enxerto e lesão durante a conservação de órgãos e antes do transplante. Ao lado da avaliação macroscópica da homogeneidade de perfusão do enxerto, os valores de fluxo fornecer um bom indicador da viabilidade do enxerto e da extensão da lesão isquêmica que tinha sofrido anteriormente 29. O consumo de oxigênio e produção de bile são os marcadores da função metabólica. Os níveis de enzimas hepáticas, como AST podem ser utilizados comoSess o grau ea dinâmica de lesão hepatocelular 30. Essa avaliação enxerto completa pode permitir que uma discriminação segura entre órgãos marginais transplantados e não-transplantados. Escolhemos uma temperatura subnormothermic de 33 ° C no nosso sistema de perfusão, porque a temperatura é suficiente para permitir que o metabolismo, bem como ATP e a síntese de glicogénio. Ao mesmo tempo, ele fornece uma demanda de oxigênio diminuiu em relação a configurações de perfusão normotérmica que fornece segurança adicional contra a lesão isquêmica. Em geral, as temperaturas de perfusão acima de 30 ° C mostraram a minimizar a lesão de isquemia fria e proporcionar atividade metabólica suficiente 31. Ao contrário de outros grupos, não usamos sangue como perfusato, mas uma solução de albumina normo-osmótica (Steen) com glóbulos vermelhos lavados e filtrados. Ao excluir os componentes do plasma, bem como trombócitos e leucócitos, a solução de perfusão é deassinado para minimizar a sinalização pró-inflamatória durante a perfusão ex-vivo. Para além da avaliação do enxerto, condições de perfusão estáveis ​​ao longo de várias horas permitir o tratamento do enxerto. Numerosas moléculas têm demonstrado para atenuar a lesão de reperfusão em condições experimentais 32. No entanto, quase nenhum regime de tratamento fez o seu caminho para a prática clínica, ainda. Uma das razões parece ser a falta de oportunidade de aplicar os tratamentos durante o armazenamento refrigerado. Um fígado metabolicamente ativo em um sistema de perfusão ex vivo é o ideal para a aplicação de qualquer tipo de tratamento. Neste sentido, não apenas os tratamentos para melhorar as condições de reperfusão como atenuação da atividade das células Kupffer ou eliminação de espécies reativas de oxigênio são concebíveis, mas também tratamentos como a terapia genética para condicionar o enxerto, por exemplo, contra a Hepatite C recorrência. Outras estratégias potenciais podem incluir redução de esteatose durante a perfusão ex vivoperíodo de 33. Em resumo, ex vivo de perfusão hepática é uma nova estratégia para minimizar a lesão de isquemia fria e avaliar enxertos hepáticos marginais antes do transplante de fígado. A definição ex vivo de perfusão proporciona oportunidade única para reparar e enxertos condição antes do transplante.

O transplante de fígado é a única opção de tratamento para pacientes com doença hepática em fase terminal ou carcinoma hepatocelular avançado. Durante os últimos 25 anos, o número de espera em lista candidatos tem aumentado gradualmente e excedeu o número de enxertos disponíveis. O número de doadores de coração batendo tem diminuído ao longo da última década. Ao mesmo tempo, o número de enxertos marginais, como doação após a morte cardíaca (DCD), bem como a idade e os fígados gordos aumentaram 1,2. Enxertos marginais são muitas vezes diminuiu para transplante de fígado devido à maior chance de enxerto função principal não ou atrasado. Em enxertos DCD, o desenvolvimento do tipo isquêmico estenose biliar (EBTs) é de especial preocupação. Com a técnica de preservação a frio estática convencional, ITBS ocorrem em cerca de 10-40% dos enxertos de DCD. Na maioria dos pacientes, ITBS leva a re-transplante ou morte do paciente. Especialmente tempos isquêmicos quentes e frios prolongados são riscofatores para ITBS 3-7. A idade do doador, predisposições genéticas (como CCR5 delta 32), e a escolha de solução de preservação, também têm sido discutidas como factores de risco adicional 7-10. Microtrombose parcial dos vasos peribiliary tem sido sugerido como um mecanismo potencial para ITBS após o transplante de fígado com DCD enxertos 11. Antes da introdução clínica do transplante de fígado, ex vivo perfusões fígado têm sido usadas para estudar o metabolismo hepático e fisiologia 12,13. Após transplante de fígado encontrou seu caminho para o cenário clínico na década de 1960, inúmeras tentativas foram feitas para usar ex vivo de perfusão hepática como um método de conservação, imitando as condições de nutrição e oxigenação fisiológicas. Sua utilidade para a preservação de enxertos marginais foi investigado na última década, mas não chegou a cuidados clínicos padrão. Nós recentemente descrita uma redução na bile lesão do duto em DCD transplante hepático por ex vivo perfusão preservação 14. Diferentes abordagens em relação à solução de perfusão foram feitas. A selecção das soluções varia celulares como sangue total a partir do animal dador ou eritrócitos em combinação com o plasma humano, para abordagens acelulares como máquina Universidade de Wisconsin solução, solução IGL, ou solução Steen 14-19. A temperatura varia 4-37 ° C 20. A nomenclatura em hipotermia, subnormothermic e normotérmica é muito variável e inconsistente. Todas as técnicas, soluções e diferentes configurações de temperatura visam 1) condições de perfusão estáveis, 2) oxigenação suficiente, e 3) o restabelecimento da função do órgão. Uma capacidade de preservação reforçada, bem como a capacidade de avaliação e tratamento de órgãos durante a perfusão normotérmica e subnormothermic enfrenta maior complexidade técnica e os custos em comparação com perfusão hipotérmica 20,21. Desenvolvemos um sistema de perfusão ex vivo de fígado subnormothermic durante os últimos 4 anos. O sistema pode ser utilizado para 1) &quot;recarregar&quot; o teor de energia hepática, 2) para avaliar a qualidade do enxerto, e 3) reparar fígados marginais antes do transplante. O protocolo a seguir contém todas as informações para uma perfusão hepática estável.

<table><tbody><tr><td>circuito</td><td>Maquet (Hirrlingen, GER)</td> <td>reservatório principal feito sob medida</td><td>(3 L, 3/8" de saída) 
reservatório portal (1,5 L, 1/4", vazão) 
bomba centrífuga 
oxigenador 
filtro de licócitos </td></tr><tr><td>Tubulação (1/4" x 1/16")</td><td>Raumedic (Helmbrechts, GER)</td><td>MED7506</td><td></td></tr><tr><td>Tubulação (3/8" x 3/32")</td><td>Raumedic (Helmbrechts, GER)</td><td>MED7536</td><td></td></tr><tr><td>Conectores de tubulação</td><td>Raumedic (Helmbrechts, GER)</td><td></td><td>vários tamanhos</td></tr><tr><td>Filtro de diálise, Optiflux F160NR</td><td>Fresenius Medical Care (Waltham, MA)</td><td>F160NR</td><td></td></tr><tr><td>Solução STEEN</td><td>XVIVO (G&ouml; teborg, SWE)</td><td>19004</td><td>2 L</td></tr><tr><td>Concentrado de ácido de diálise A</td><td>Baxter (Mississauga, ON)</td><td>D12188M</td><td>45 ml</td></tr><tr><td>Aminoácido, Travasol 10%</td><td>Baxter (Mississauga, ON)</td><td>JB6760</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>P2256</td><td>1,1 g</td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sandoz Canada Inc (Toronto, ON)</td><td>10750</td><td>40.000 iU</td></tr><tr><td>Cálcio gluconato</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada (Richmond Hill, ON)</td><td>C31110</td><td>10 mg</td></tr><tr><td>Insulina de ação rápida</td><td>vários fornecedores</td><td></td><td>1.000 iU</td></tr><tr><td>Cefazolina</td><td>vários fornecedores</td><td></td><td>1 g</td></tr><tr><td>Metronidazol</td><td>Baxter (Mississauga, ON)</td><td>JB3401</td><td>500 mg</td></tr></tbody></table>

técnica de subnormothermic<em&gt; ex vivo</em&gt; fígado de perfusão para o armazenamento, avaliação e reparação de enxertos de fígado marginal

Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts

O sucesso do transplante de fígado resultou numa dramática escassez de órgãos. Na maioria das regiões de transplante 20-30% dos pacientes em lista de espera para transplante de fígado morrem sem receber um transplante de órgão ou são retiradas para a progressão da doença. Uma estratégia para aumentar a lista de dadores é a utilização de enxertos marginais, tais como fígado gorduroso, enxertos de doadores mais velhos, ou doação após morte cardíaca (DCD). A técnica de conservação atual de armazenagem estática frio só é pouco tolerado por fígados marginais, resultando em danos significativos nos órgãos. Além disso, o armazenamento órgão estático frio não permite a avaliação do enxerto ou reparo antes do transplante. Estas deficiências de preservação estática frio provocaram um interesse em quente preservação de órgãos perfundidos para reduzir as lesões de isquemia fria, avaliar enxertos hepáticos durante a preservação, e explorar a oportunidade de reparar fígados marginais antes do transplante. Os pres ideaiscerteza e condições de fluxo, temperatura, composição da perfusão da solução de perfusão e a necessidade de um veículo de oxigénio tem sido controversa no passado. Apesar dos resultados promissores em vários estudos em animais, a complexidade e os custos impediram uma aplicação clínica mais ampla até agora. Recentemente, com a tecnologia melhorada e uma melhor compreensão da fisiologia do fígado durante a perfusão ex-vivo, o resultado do aquecimento de perfusão do fígado melhorou e consistentemente bons resultados podem ser conseguidos. Este artigo irá fornecer informações sobre a recuperação do fígado, técnicas de armazenamento, e isolado de fígado de perfusão em porcos. Vamos ilustrar a) os requisitos para garantir o suprimento de oxigênio suficiente para o órgão, b) As considerações técnicas sobre a máquina de perfusão ea solução de perfusão, e c) aspectos bioquímicos de órgãos isolados.

A seguir, apresentamos os resultados de cinco experimentos de perfusão com DCD-enxertos após 45 min quente- e isquemia fria 4 horas antes do início do subnormothermic ex vivo de perfusão. O principal objetivo de uma perfusão de fígado ex vivo é garantir um suprimento de oxigênio suficiente ao órgão. Isquemia provoca vasoconstrição, aumentando assim a resistência de perfusão. Alcançar fluxos vasculares constantes com pressões estáveis ​​é um bom indicador de oxigenação adequada. Durante um período de indução de 1-2 horas, a solução de perfusão do órgão e são aquecidos até 33 ° C, o que deceases a resistência vascular do fígado. Uma vez que seja alcançado o objectivo de temperatura a 33 ° C, os valores de fluxo em um nível de alcance constante, quase fisiológica durante o resto do tempo de perfusão de 6 horas (Figuras 3A-3D). Ao mesmo tempo, o órgão torna-se metabolicamente activo. Figura 4A mostra a pO venosa &lt;sub&gt; 2, um marcador do consumo de oxigênio. Dentro da 2 hr inicial os venosos pO 2 quedas para um patamar constante. Neste estado metabolicamente activo, o fígado começa a produzir biliar (Figura 4B). O dialisador fornece uma homeostase eletrolítica balanceada (Figuras 4C-4D). Uma hipercalemia inicial é nivelado rapidamente. Medição AST online serve como monitoramento de dano hepatocelular. Figura 5 apresenta apenas um aumento de AST linear rasas ao longo de todo o período de perfusão. H &amp; E coloração após 6 horas da perfusão revela necrose de hepatócitos &lt;5%, com uma estrutura intacta e lobular sinusoidal (Figura 6). Coloração PAS no mesmo ponto do tempo mostra reabastecido armazenamento de glicogênio celular em relação ao armazenamento esgotada no frio preservados DCD-enxertos (Figura 7). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/51419/51419fig3highres.jpg" /> Figura 3. fluxos de perfusão e de pressão (n = 5, barras de erro mostram o desvio padrão). (A, B) artéria hepática (HA) fluxo e pressão: Durante a fase de aquecimento no primeiro 1-2 horas, os aumentos de fluxo em pressões estáveis ​​e é constante depois. Olhando para a pressão venosa portal decrescente (C), o aumento de fluxo de HA para o fim da perfusão pode ser uma reacção de auto-regulador do fígado. (C, D) A venoso portal (PV), os aumentos de fluxo correspondentes para o fluxo de HA durante a primeira 2 horas de aquecimento. As pressões permanecem relativamente estáveis. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/51419/51419fig4highres.jpg" /> Figura 4. parâmetros de monitoramento (n = 5, barras de erros mostram o desvio padrão). (A) O pO 2 venosa como um marcador de carência de oxigénio e a actividade metabólica diminui no decurso da fase inicial de aquecimento, devido ao cellula activadar metabolismo; que se mantém estável depois (B) a produção de bílis como um marcador de actividade metabólica começa a temperaturas em torno de 30 ° C e, assim, entre a primeira e segunda hora de perfusão (C, D) O dialisador assegura a homeostasia de electrólito..; um hipercalemia inicial é rapidamente equilibrada. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/51419/51419fig5highres.jpg" /> Figura 5 AST (n = 5, barras de erro mostram o desvio padrão), de AST é um marcador sensível da lesão hepatocelular.; o aumento superficial sugere que não há danos significativos durante ex vivo de perfusão. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/51419/51419fig6highres.jpg" /> Figura 6 H &amp; E coloração (ampliação de 20X). (A) amostra Sham fígado antes de isquemia quente, um lóbulo representante fígado com architectur intactae. (B) de uma amostra de fígado, após 45 min de isquemia quente, 4 h de isquemia fria e 6 horas da perfusão subnormothermic, a arquitectura lobular é intacto, sem necrose e apenas inchaço celular mínima, os espaços sinusoidais são ligeiramente dilatados em comparação com o amostra farsa.

Enxertos marginais, tais como fígado gorduroso, enxertos de doadores mais velhos, ou fígados recuperados após a morte cardíaca (DCD) tolerar estática de armazenagem convencional, o frio só mal. Foi desenvolvido um novo modelo de subnormothermic ex vivo de perfusão hepática para a preservação, avaliação e reparo de enxertos de fígado marginais antes do transplante.

Técnica de Subnormothermic<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Fígado de Perfusão para o armazenamento, Avaliação e Reparação de enxertos de fígado Marginal

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. In most transplant regions 20-30% of patients on the waiting list for ...

O objetivo deste procedimento é preservar e avaliar um enxerto hepático em condições quase fisiológicas. Isso é feito recuperando primeiro o enxerto de fígado de um porco doador. Na segunda etapa, o fígado é canulado e, em seguida, o enxerto é conectado ao circuito de perfusão ex vivo.Na etapa final, as propriedades de perfusão e as características do enxerto hepático são monitoradas quanto ao tempo de perfusão desejado. Em última análise, os níveis de aspartato aminotransferase ou ST e análises histológicas de biópsias parenquimatosas são usados para mostrar a preservação da lesão e a viabilidade do enxerto hepático. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos de preservação existentes, como o chamado armazenamento estático, é que a preservação em condições fisiológicas resulta em menos lesões de preservação e permite a avaliação funcional e o tratamento do enxerto antes do transplante de órgão propriamente dito.Imediatamente após a indução da morte cardíaca pela administração de cloreto de potássio, colete 1,6 litros de sangue de um porco Yorkshire macho de 30 a 35 kg em bolsas CPDA, feche o abdômen, deixe o fígado intra abdominalmente por 45 minutos para induzir lesão isquêmica quente imediatamente antes do final da isquemia quente. O tempo canula a aorta e a veia porta com linhas de descarga de órgãos também neste momento. Use perfusão dupla por meio de pressão da aorta e bolsas acionadas por gravidade portal para lavar o fígado com a solução da Universidade de Wisconsin.Em seguida, corte o fígado do porco, deixando todos os vasos restantes longos e coloque-o em uma bolsa de órgãos. Canule as partes supra e infra-hepáticas do espeleólogo da veia inferior com redutores de meia polegada por três oitavos de polegada com uma trava de isca. Canule a veia porta e a artéria hepática com três oitavos de polegada por um quarto de polegada e um quarto de polegada por três oitavos de polegada.Reduz com um bloqueio de isca neste momento também. Em seguida, feche a bolsa e guarde o fígado no gelo até a perfusão. Para configurar o circuito de perfusão ex vivo, conecte a vazão de um reservatório principal a uma bomba centrífuga e a um oxigenador comercial atrás do oxigenador.Divida a tubulação em duas linhas. Conecte uma linha a um dialisador que drena de volta para o reservatório principal. Conecte a outra linha a um filtro de redução de leucócitos.Divida a linha após a redução de leucócitos Filtre em uma linha arterial para fornecer perfusão oito para a artéria hepática e em uma linha venosa portal para fornecer perfusão oito para um segundo reservatório que drena para a veia porta por fluxo de saída por gravidade. Prenda o fluxo de entrada do portal e, em seguida, conecte a linha arterial a uma alça de espeleologia de veias que drena para o reservatório principal. Para a recolha de fluidos, defina a temperatura de arranque do circuito e do banho-maria para 20 graus Celsius.Em seguida, cubra o banho com uma membrana impermeável para coletar ascite ou vazamento do perfuso oito. Conecte uma linha de sucção acionada por bomba de rolos ao reservatório principal. Em seguida, solte o grampo de saída do reservatório principal e encha o circuito com a solução de perfusão.Ligue a bomba centrífuga a 1.500 voltas por minuto, certificando-se de que todo o ar seja conduzido para fora do circuito. Em seguida, ligue o suprimento de gás para o oxigenador. Conectar o fígado ao circuito é a parte mais complicada do procedimento.Tome cuidado para evitar dobras no tubo e remover quaisquer bolhas para evitar o impedimento do fluxo de saída do fígado. O nível do reservatório do portal também deve ser seguido com atenção. Nunca deve ficar vazio.Remova o fígado do gelo e lave a solução da Universidade de Wisconsin com solução salina. Em seguida, coloque o fígado na membrana sobre o banho-maria. Reduza a velocidade da bomba centrífuga para 1000 rodadas por minuto e coloque dois grampos no lado arterial da alça de espeleologia de veias.Em seguida, corte a tubulação entre os grampos e conecte as duas saídas do espeleólogo de veias à linha do espeleólogo de veias. Solte o clamp da linha arterial. Despeje perfuse oito na cânula arterial para se livrar das bolhas e conecte a linha à cânula.Aumente a bomba centrífuga para 1.500 rodadas por minuto e solte a segunda pinça da linha da caverna de Venner e solte a pinça do reservatório venoso portal para enchê-la. Deixe a solução de perfusão ser derramada na cânula portal e, em seguida, conecte-a. Tomando cuidado para manter os níveis de fluido no reservatório portal estáveis.Depois de conectar o fígado ao circuito, aumente a temperatura do banho-maria para 33 graus Celsius nos próximos 60 minutos. Procure um fluxo arterial inicial de cerca de 250 mililitros por minuto a 40 milímetros de mercúrio. Isso pode chegar a 700 mililitros por minuto durante a perfusão.Uma vez que a pressão é aumentada até 70 milímetros de mercúrio, procure um fluxo de veia de porta de 500 a 600 mililitros por minuto a três a cinco milímetros de mercúrio. Depois de aumentar a temperatura, o fluxo venoso da porta aumentará até 1.100 mililitros por minuto. Abaixe o reservatório principal para definir o fluxo de saída para menos dois miligramas de mercúrio para evitar congestão hepática por obstrução funcional do fluxo de saída, certificando-se de que nenhuma bolha de ar fique presa no tubo caval.Defina o fluxo de diálise oito para 500 mililitros por hora. Ter o cuidado de ajustar o fluxo de diálise para que o PERFUSE oito não seja diluído nem concentrado. Mantenha um pH baixo durante o início da perfusão para proteger o órgão.Ajustar a pressão parcial do dióxido de carbono continuamente para 25 a 30 milímetros de mercúrio para que o pH atinja um nível fisiológico dentro de uma hora. Para imitar as condições fisiológicas, injete continuamente glicose e insulina na veia porta. Injete cuidadosamente bicarbonato de sódio ou potássio no circuito sob controle repetitivo de sangue, gás e eletrólitos e monitore a perfusão por gasometria venosa e arterial periódica e análises de ST.Monitore o fluxo vascular e a pressão. Uma perfusão estável manterá a resistência vascular constante no final do período de perfusão ex vivo. Desligue o sistema de perfusão e, depois de desconectar o tubo do fígado, lave o PERFUSE oito duplamente para fora do fígado com uma solução gelada da Universidade de Wisconsin.Finalmente, armazene o fígado no gelo em uma bolsa de órgãos estéril antes do transplante. Alcançar fluxos vasculares constantes com pressões estáveis é um bom indicador de oxigenação adequada. Uma vez atingida a temperatura alvo de 33 graus Celsius, os valores de fluxo são níveis constantes, quase fisiológicos, durante o resto do período de perfusão, ao mesmo tempo em que o órgão se torna metabolicamente ativo.Este gráfico mostra a pressão venosa parcial de oxigênio, um marcador do consumo de oxigênio. Nas primeiras duas horas, a pressão venosa parcial de oxigênio diminui para um platô constante. Nesse estado metabolicamente ativo, o fígado começa a produzir bile e o dialisador fornece uma homeostase eletrolítica equilibrada.A medição on-line de A ST serve como um monitor de danos celulares hepáticos. Por exemplo, neste experimento, apenas um aumento superficial de A ST durante todo o período de perfusão é observado. A coloração H e e após seis horas de perfusão revela necrose de hepatócitos inferior a 5% com estrutura lobular e sinusoidal intacta.A coloração BAS de um fígado perfundido ex vivo no mesmo ponto de tempo demonstra um armazenamento de glicogênio celular reabastecido em comparação com o armazenamento esgotado observado em enxertos de morte cardíaca de doadores preservados a frio. Após este procedimento, um modelo de reperfusão de órgãos como um transplante de fígado pode ser realizado para estudar o efeito da perfusão hepática ex vivo na lesão de reperfusão e na função do órgão.

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Research

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Medicine

Medicina

O estudo da fisiologia dos órgãos animais pode ser realizado através da realização de um sistema experimental de perfusão ex vivo. A adição de um rim suíno, como órgão homeostático ao nosso modelo de perfusão hepática ex vivo desenvolvido anteriormente, pode ser um passo fundamental para alcançar um melhor ambiente fisiológico.

Etapas para o experimento autólogo ex vivo perfundido de fígado-rim suíno

Aqui apresentamos um protocolo descrevendo ex oxigenado máquina de perfusão in situ de enxertos de doadores de fígado. Este artigo contém um passo a passo protocolo de adquirir e preparar o enxerto de fígado para a máquina de perfusão, preparar o líquido de perfusão, privilegiada a máquina de perfusão e executar oxigenado máquina de perfusão normotérmica do enxerto de fígado.

Ex Situ Normotérmica máquina de perfusão de fígados doados

Descreve-se um método de perfusão ex vivo máquina de enxertos de fígado humano à temperatura subnormothermic (21 ° C).

Fígado Preservação Human Funcional e cobrança através de Subnormothermic Máquina de Perfusão

A escassez de órgãos grave resultou em aumento do uso de enxertos de rim marginais para transplante. Isso provocou interesse em métodos alternativos de armazenamento, uma vez que os enxertos marginais especialmente tolerar armazenamento a frio mal. A técnica de normothermic ex vivo de perfusão renal (NEVKP) representa um método de conservação de enxertos de rim romance antes do transplante.

Normotérmica<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusão rim para a Preservação do rim Os enxertos antes do transplante

Há uma escassez de doadores de fígado significativo, e expandiram-se critérios para doadores de fígado. Normotérmica ex vivo fígado perfusão (NEVLP) foi desenvolvido para avaliar e modificar a função do órgão. Este estudo demonstra um modelo do rato de NEVLP e testa a capacidade do peguilado-catalase, para atenuar a lesão hepática de preservação.

Um pequeno modelo Animal de perfusão de fígado normotérmica Ex Vivo

A perfusão normotérmica ex vivo em máquina (PENE) tem sido pouco explorada para a preservação de aloenxertos pancreáticos. Apresentamos uma técnica inovadora de preservação de aloenxertos de pâncreas antes do transplante.

Perfusão Normotérmica Ex Vivo do Pâncreas para Preservação de Aloenxertos de Pâncreas antes do Transplante

O modelo suíno de perfusão normotérmica hepática (NMP), descrito aqui, pode ser usado com sucesso para estudar NMP como uma estratégia de preservação, uma ferramenta para avaliação de viabilidade e uma plataforma para reparo de órgãos. Possui um alto valor translacional, no entanto, é tecnicamente desafiador e trabalhoso.

Perfusão hepática isolada normotérmica suína

Um sistema normotérmico ex vivo de perfusão hepática (NEVLP) foi criado para fígados de camundongos. Este sistema requer experiência em microcirurgia, mas permite resultados reprodutíveis de perfusão. A capacidade de utilizar fígados de camundongos facilita a investigação de vias moleculares para identificar novos aditivos de perfusato e permite a execução de experimentos focados no reparo de órgãos.

Perfusão de máquina hepática normotérmica ex vivo em camundongos

Este protocolo descreve a metodologia de estabelecimento de um modelo suíno utilizando Perfusão de Máquina (MP) com temperatura controlada variável para a preservação do fígado do doador, seguido de transplante hepático ortotópico (OLTx). Tem como objetivo promover a taxa de sucesso do OLTx usando doação de doador após morte circulatória (DCD) hepática e estabelecer um modelo estável.

Preservação da Doação de Suínos após Morte Circulatória (DCD) Hepática por Perfusão e Transplante Hepático Ortotópico

Aqui, apresentamos um protocolo para estabelecer um modelo de armazenamento e transplante de fígado a longo prazo em esquilo terrestre Daurian (DGS), que tem sido tecnicamente desafiador em modelos padrão de roedores.

Armazenamento e transplante de fígado a frio nos esquilos terrestres daurianos adaptáveis ao frio

Aprenda a técnica de perfusão subnormotérmica ex vivo de fígado para preservar e avaliar enxertos marginais antes do transplante. Este método reduz lesões de preservação e permite avaliação funcional.

Técnica de Subnormothermic Ex Vivo Fígado de Perfusão para o armazenamento, Avaliação e Reparação de enxertos de fígado Marginal (Vídeo) | JoVE Journal

Técnica de Subnormothermic

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