Análise da Global RNA Síntese no nível da célula única seguinte hipóxia

O objetivo geral deste procedimento é rotular com fluorescência e quantificar a quantidade de RNA nascente produzido sob condições de tratamento, utilizando análise de imagem quantitativa para alcançar esse fim. Células cultivadas em lamínulas são tratadas com a base modificada alquino. Cinco etal uridina, referida doravante como cinco EU, e incubadas sob condições hipóxicas.

Durante a incubação, cinco EU são incorporados durante a síntese de RNA sem interromper a maquinaria de transcrição celular. Em seguida, os cinco EU incorporados são marcados fluorescentemente por meio de uma reação de cicloadição azida-alcino catalisada por cobre, ou reação "click". O RNA recém-sintetizado marcado fluorescentemente é então visualizado por microscopia de fluorescência e as imagens resultantes são analisadas para comparar a quantidade de RNA gerado sob condições de tratamento e controle.

A análise estatística dos dados resultantes mostra as alterações na geração de RNA nascente em resposta à hipóxia por meio da quantificação de cinco incorporações de EU e detecção por microscopia de fluorescência. A principal vantagem dessa técnica em comparação com métodos existentes, como a BCR quantitativa, é que ela permite a visualização direta da produção de RNA em células no nível individual. Embora aqui utilizemos este método para estudar como as células respondem ao baixo oxigênio, ele também pode ser usado para investigar respostas a fármacos quimioterápicos.

Nossas respostas a respostas adicionais ao estresse demonstrando um procedimento serão de John Leston, um estudante de pós-graduação do meu laboratório com a ajuda de Ish Kova, também estudante de pós-graduação, e Humana Druker, uma pesquisadora pós-doutoranda. Por fim, Gus Ferguson demonstrará o uso do software de visualização de imagens. Inicie este experimento mergulhando várias lamínulas em etanol 70% para esterilizá-las.

Coloque as lamínulas na borda de uma placa na cabine de cultura de tecidos e deixe secar ao ar sob fluxo laminar. Uma vez que as lamínulas estejam secas, coloque uma em cada um dos seis recipientes de 3,5 centímetros. Adicione dois mililitros de DMEM completo morno a cada recipiente.

Pressione com a pinça para garantir que cada lamínula permaneça aderida ao fundo do poço. Em seguida, para destacar as células U2 OS do frasco de cultura de tecidos, lave uma vez com três mililitros de PBS. Depois, adicione quatro mililitros de tripsina 0,05% quente, EDTA 1% e incube a 37 graus Celsius por sete minutos.

Após sete minutos, adicione o meio Resus e suspenda as células em seis mililitros de DMEM completo e aquecido para inativar a tripsina-EDTA. Conte as células utilizando um hemocitômetro e semeie em cada uma das placas de 3,5 centímetros contendo lamínulas duas vezes 10 à quinta células. Agite suavemente a placa para garantir uma distribuição uniforme das células e incube durante a noite a 37 graus Celsius, 21% de oxigênio, 5% de dióxido de carbono, para permitir a adesão celular.

No dia seguinte, retire cinco das placas do incubador. Deixe a placa restante intacta. Ela será usada como controle positivo normóxico.

Coloque quatro das placas na estação de trabalho de hipóxia. Exponha as células a condições hipóxicas por 75 minutos, 90 minutos, duas horas e 24 horas. À outra placa.

Adicione actinomicina D ao meio até uma concentração final de 10 microgramas por mililitro e coloque-o novamente no incubador a 37 graus sob condições normais de oxigênio por quatro horas. Este recipiente funciona como o controle negativo normóxico. Enquanto as células estão em incubação, prepare e reúna os seguintes reagentes para o ensaio click it.

O kit de ensaio click it contém PBS em um pH de 7,2 a 7,6, paraformaldeído a 3,7% em PBS, Triton X-100 a 1% em PBS, água desionizada, dimetil sulfoxida, hidróxido de sódio 10 molar, ácido clorídrico a 37% e tiras indicadoras de pH. Você deve planejar estar pronto para iniciar um ensaio rotulado sob condições não tratadas. Uma hora antes do término do tratamento de hipóxia, para rotular as células, prepare uma solução de trabalho 2x de EU a partir do estoque de 100 milimolar em meio completo pré-aquecido.

Em seguida, adicione um volume igual de dois XEU ao meio no recipiente contendo as células tratadas com actinomicina D, diluindo assim o EU até a concentração de trabalho. Depois, na câmara de hipóxia, adicione o estoque de EU às células tratadas com hipóxia. Incube por uma hora sob as condições de cultura celular do tratamento após o tratamento de hipóxia ou após quatro horas para as amostras controle.

Lave cada placa uma vez com PBS e adicione um mililitro do estoque de paraformaldeído a 3,7% sob as condições de tratamento; incube por 15 minutos nessas condições. Após a fixação, remova as células da câmara de hipóxia e coloque-as na capela. Descarte o fixador com cuidado, assegurando-se de eliminar adequadamente o resíduo de paraformaldeído.

Em seguida, lave as células uma vez com PBS. Realize os próximos passos à temperatura ambiente, mantendo todas as soluções em gelo a dois a seis graus Celsius. Para permeabilizar as células, remova a solução de lavagem e adicione um mililitro de Triton X-100 1% em PBS a cada poço, incubando por 15 minutos à temperatura ambiente.

Remova o tampão de permeabilização e lave cada poço uma vez com PBS. Remova a solução de lavagem das células e adicione 500 microlitros de coquetel de reação recém-preparado do kit de imagem de RNA a cada amostra. Proteja as células da luz e incube por 30 minutos à temperatura ambiente.

Após a incubação, remova a reação do kit de imagem de RNA, o coquetel e a lavagem. Uma vez com um mililitro da reação do kit de imagem de RNA, enxágue com tampão; qualquer marcação adicional com anticorpos deve ser realizada neste momento. Para colorir o DNA, lave as amostras com PBS, em seguida dilua o herst 3,3,3,4,2 na proporção de 1 para 1000.

Em PBS, adicione um mililitro da solução diluída de HERC a cada poço. Proteja da luz e incube por 15 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, remova a solução de HERC e lave as células duas vezes com PBS para montar as lamínulas.

Coloque 10 microlitros de meio de montagem no centro de um microscópio padrão. Deslize e posicione a lamínula com o lado das células voltado para baixo sobre a gota de meio de montagem. Evite gerar bolhas, pois isso dificultará a aquisição subsequente de imagens.

Aplicar esmalte incolor em todo o perímetro da lamínula para fixá-la à lâmina do microscópio. Deixar o esmalte secar por cinco minutos à temperatura ambiente. As amostras protegidas da luz podem ser armazenadas a menos 20 graus Celsius.

Após o montagem, adquira imagens utilizando um microscópio de campo amplo capaz de detecção de fluorescência. Realize a aquisição de imagens utilizando uma objetiva imersão a óleo de 40 V 1,30 NA e capture as imagens com uma câmera CCD refrigerada. Um mínimo de 30 células após a aquisição das imagens.

Utilize um software de processamento de imagens para corrigir as imagens. Isso corrigirá a distorção óptica mediante a aplicação de uma fórmula matemática baseada em software às imagens capturadas. O resultado é uma imagem mais nítida, que garantirá que a análise subsequente seja limitada apenas às células imagiadas.

Em seguida, importe as imagens para o cliente Omer O. Miniaturas de todas as imagens obtidas serão exibidas para normalizar as configurações de renderização de todas as imagens no mesmo experimento. Aplique as configurações de renderização das células normóxicas controle a todas as outras condições utilizando a ferramenta de região de interesse (ROI) no software de análise.

Selecione os núcleos de cada imagem no software. Escolha a opção de análise de intensidade e obtenha as intensidades médias para cada ROI de 30 a 50 células. Salve os dados e, em seguida, calcule a média e o desvio padrão para cada condição.

Por fim, utilize um software de representação gráfica de dados para construir gráficos de dispersão com todos os valores médios individuais de intensidade, refletindo a variabilidade entre as células em cada condição. Representar os dados de intensidade dessa forma é útil porque permite uma comparação rápida dos resultados dos tratamentos e demonstra claramente a heterogeneidade significativa dentro da população celular de um tratamento, que de outra forma seria oculta ao se usar representações padrão de dados. Alternativamente, construa gráficos de barras para representar a média da intensidade mais o desvio padrão do RNA recém-sintetizado, a fim de determinar quantitativamente a síntese total de RNA. Células U2 OS tratadas com hipóxia e cultivadas na presença de uridina al ou EU foram então processadas e analisadas.

Como demonstrado neste vídeo, as intensidades de fluorescência de todas as células dentro de cada população tratada foram médias e representadas graficamente. Neste gráfico de barras, um teste t de Student foi utilizado para calcular a probabilidade estatística de cada grupo tratado diferir significativamente do controle. Curiosamente, esses dados mostram que há um aumento estatisticamente significativo na síntese global de RNA ao longo do tempo.

Quando as células U2 OS são tratadas com hipóxia por mais de uma hora e meia, como esperado, o tratamento com actinomicina D abole completamente a intensidade da fluorescência. Esses dados sugerem que, após períodos prolongados de tratamento com hipóxia, a célula concentra seus esforços na produção de RNA, mesmo nesse ambiente hipóxico hostil. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como rotular e quantificar RNA recém-sintetizado ao nível de célula única em condições de hipóxia e normóxia; uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em duas horas seguindo este procedimento.

Outros métodos, como a dupla marcação com anticorpos para a RNA polimerase e HIF um, podem ser realizados para determinar se os níveis de RNA polimerase estão alterados e se o HIF está ativado. Não se esqueça de que trabalhar com formaldeído pode ser extremamente perigoso durante este procedimento. Sempre use luvas e trabalhe em uma cabine de segurança química.