Name: Um método modificado para heterotópico Rato coração transplante (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-23T19:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Aprenda a técnica de transplante cardíaco heterotópico em camundongos, incluindo colheita do coração doador e anastomose vascular. Este método permite estudar rejeição de enxertos e compatibilidade entre linhagens em pesquisa cardiovascular.

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Este trabalho foi financiado pelo Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica (NHMRC) da Austrália Projeto Grant 1029205, pela Fundação Microsearch da Austrália, e pela Fundação Myee Codrington Pesquisa Médica.

Antes do início das experiências, obter aprovação do Comitê de Ética Animal Care da instituição relevante para os experimentos planejados. Manter os ratos na conformidade com os requisitos da sua instituição. O protocolo a seguir foi aprovado pelos comitês Universidade de Sydney e Royal Prince Alfred Hospital. Antes de iniciar a cirurgia, todos os instrumentos devem ser cuidadosamente limpos e esterilizados por imersão em etanol 80%. Algumas instituições estipular autoclavagem no entanto isso pode danificar os instrumentos de microcirurgia multa no longo prazo. Sempre que possível o uso do equipamento descartável estéril. 1. Anestesia <ol><li> Anestesiar rato com isoflurano em um recipiente fechado, em seguida, colocá-lo em decúbito dorsal em uma placa de funcionamento, de forma rápida conexão anestésico cone do nariz. Teste de adequação da anestesia por beliscar a pata traseira para garantir que não haja reflexo. </li><li> Raspar a pele com uma lâmina cirúrgica eesterilizar com etanol a 80%. Além disso, os 2% de clorexidina em 70% de álcool isopropílico pode ser utilizado para a esterilização da pele. Durante a indução da anestesia isoflurano a concentração é de 3%, mas reduzir isso para 1-1,5% para a manutenção. Faça pequenos ajustes para esta concentração para manter a respiração regular e freqüência cardíaca. Mantenha a temperatura do animal em uma almofada de aquecimento. </li></ol> 2. Operação Donor <ol><li> Fazer uma toracotomia para expor o coração e os vasos cortando o peito por meio de ambos os lados da caixa torácica a partir da borda nervura até à axila seguido de um corte transversal ao nível do processo xifóide, para formar uma aba da parede torácica. Levante essa aba para cima ao lado da cabeça e fixá-lo ao conselho operacional. Rasgue pericárdio para expor o coração e os vasos. </li><li> Levante a veia cava inferior com uma pinça em uma mão e com a outra injetar 1 ml proximal salina heparinizada frio ao coração através da veia cava inferior, em seguida, colocar uma braçadeira pequena artéria no IVC para prevençãofluxo t de solução de perfusão de volta pelo buraco da agulha. </li><li> Usando gaze e um cotonete, retirar o coração para baixo para expor a aorta ascendente e artéria pulmonar. Passe uma lâmina de um par de microtesoura através do (seio transverso) posterior canal para o pacote de aorta e da artéria pulmonar e cortou a aorta ea artéria pulmonar em conjunto, tanto distal quanto possível para garantir comprimento suficiente para anastomose. </li><li> Laço e dividir o IVC, veia cava superior direita (SVC), deixou SVC e veias pulmonares utilizando 6-0 fio de seda. Amarre o IVC e SVC direito separadamente, em seguida, colocar uma única linha posterior ao coração para cercar o SVC esquerda junto com veias pulmonares e amarrá-lo. Colha o coração da área doadora, cortando os vasos distal para os laços, em seguida, armazená-lo em solução salina estéril fria a 4 ° C até o transplante. Isso resulta em morte do doador por sangria. </li></ol> 3. Operação Destinatário <ol><li> Anestesiar odestinatário como acima (seção 1). Raspar cuidadosamente abdômen para evitar a irritação, em seguida, fazer uma laparotomia por incisão mediana do púbis ao processo xifóide e retrair usar clipes de papel dobrado para formar retratores. Enrole o intestino em solução salina estéril gaze embebida quente e retrair a parte superior direita do abdômen. </li><li> Para expor a aorta infra-renal e IVC, libertar os segmentos agrupados de aorta e veia cava inferior da artéria renal esquerda e veia para a bifurcação ilíaca, dividindo-as dos vasos lombares usando um cautério. Tome cuidado para que o cautério está na temperatura correta e usada por um período suficiente para dividir e selar as pontas dos vasos. </li><li> Aplicar pequenas pinças atraumáticas embarcação para a aorta e segmentos VCI distal e proximal. Fazer uma incisão na parede frontal da aorta pelo primeiro perfurar um furo com uma agulha 30 G; em seguida, cortado de uma incisão vertical com microtesouras para coincidir com o tamanho da aorta do doador. Lave o lúmen da aorta com solução salina heparinizada para remover qualquer blcoágulos ood. </li><li> Traga o coração do doador para o site receptor coberto com gaze embebida em solução salina fria e coloque-o para o lado direito do abdômen. Certifique-se a aorta do doador é posicionado ao lado da incisão sobre a aorta do receptor e a artéria pulmonar do doador posicionado ao lado do receptor da VCI. </li><li> Anastomose lado end-to-the aorta do doador para a aorta destinatário usando execução 10-0 suturas de nylon a partir do canto proximal e sutura no lado esquerdo até chegar ao primeiro canto distal, em que fase o animal é girada em 180 °. Suavemente mover o coração de dador para o lado esquerdo do abdómen para expor o lado direito da aorta e continuar a sutura através do lado direito da parede da aorta a partir da extremidade distal para a extremidade proximal. Antes de fechar a anastomose da aorta, lave delicadamente o lúmen com solução salina heparinizada para remover qualquer coágulo e do ar. </li><li> Anastomosar a artéria pulmonar do doador (PA) de ponta-a-lado com o destinatário da VCI. Faça uma incisão vercamente com microtesouras na parede frontal da VCI em um local, em conformidade com a anastomose arterial. Anastomosar dador PA aos receptores com CIV executando 10-0 suturas de nylon a partir da extremidade distal da parede esquerda dentro do lúmen da veia cava inferior. Depois de atingir a extremidade proximal, suturas continuar ao longo da parede lateral direita da frente até a extremidade distal para completar a anastomose. Antes de fechar a anastomose, lave delicadamente a luz para remover quaisquer coágulos e ar. </li><li> Antes de liberar a embarcação grampos, coloque pedaços de Gelfoam em torno dos locais de anastomose, e aplicar uma leve pressão com um aplicador de algodão até que a hemostasia seja alcançado. No momento da revascularização, libertar a pinça distal em primeiro lugar, seguido pela braçadeira proximal. </li><li> Após a revascularização, aplicar soro fisiológico quente a 37 ° C ao enxerto externamente para ajudar na sua recuperação. O enxerto geralmente começa imediatamente atrial e reverte espontaneamente para o ritmo sinusal em poucos minutos. Injetar 0,6 ml quentessubcutaneamente salina para manter a hidratação do destinatário. Injetar buprenorfina subcutânea para analgesia antes da conclusão da cirurgia </li><li> Feche a ferida abdominal com um 5-0 sutura contínua absorvível para ambas as camadas. Comece por completar a camada interna e continuar ao longo da pele. </li></ol> 4. Recuperação e Monitorização do Enxerto <ol><li> Injectar a ampicilina para a profilaxia da infecção e colocar o recipiente em um bloco de aquecimento a 37 ° C durante a recuperação. A maioria dos animais recuperar-se rapidamente e são geralmente beber e comer muitas vezes dentro de 3 horas. Se o mouse mostra sinais de angústia, examinar de perto para determinar a causa. Se nenhuma causa óbvia, tratar com buprenorfina e acompanhar de perto. Consulte um veterinário se os sintomas forem graves ou persistir mais de 8 horas e considerar a eutanásia. Se necessário, dar continuidade 12 injeções por hora de buprenorfina até os sintomas desaparecerem. Se o mouse mostra sinais de angústia após 8 horas, dar continuidade 12injecções horárias de buprenorfina até que resolver. Consulte o veterinário se os sintomas persistirem por mais de 48 horas e sacrificar, se necessário. </li><li> Monitorar enxerto batimento cardíaco por palpação abdominal direto e registrar a força da batida como + + + + para um enxerto saudável + para fraco batimento devido à rejeição avançada e - como não bater devido à completa rejeição do enxerto. Monitorar ratinhos diariamente para os primeiros 10 dias, depois 3x por semana durante a duração da experiência. </li></ol>

<ol><li>Aramaki, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-10+but+not+transforming+growth+factor-beta+is+essential+for+generation+and+suppressor+function+of+regulatory+cells+induced+by+intratracheal+delivery+of+alloantigen%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Interleukin-10 but not transforming growth factor-beta is essential for generation and suppressor function of regulatory cells induced by intratracheal delivery of alloantigen.</a> Transplantation. 79, 568-576 (2005).</li>
<li>Chen, R. H., Bushell, A., Fuggle, S. V., Wood, K. J., Morris, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+granzyme+A+and+perforin+in+mouse+heart+transplants+immunosuppressed+with+donor-specific+transfusion+and+anti-CD4+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Expression of granzyme A and perforin in mouse heart transplants immunosuppressed with donor-specific transfusion and anti-CD4 monoclonal antibody.</a> Transplantation. 61, 625-629 (1996).</li>
<li>Poulin, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-9+promotes+eosinophilic+rejection+of+mouse+heart+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Interleukin-9 promotes eosinophilic rejection of mouse heart allografts.</a> Transplantation. 76, 572-577 (2003).</li>
<li>Ono, K., Lindsey, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+technique+of+heart+transplantation+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thorac.+Cardiovasc.+Surg%22%5BJournal%5D)">Improved technique of heart transplantation in rats.</a> J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 57, 225-229 (1969).</li>
<li>Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primarily+vascularized+allografts+of+heart+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Primarily vascularized allografts of heart in mice.</a> Transplantation. 16, 343-350 (1973).</li>
<li>Larsen, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-gp39+interactions+play+a+critical+role+during+allograft+rejection.+Suppression+of+allograft+rejection+by+blockade+of+the+CD40-gp39+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">CD40-gp39 interactions play a critical role during allograft rejection. Suppression of allograft rejection by blockade of the CD40-gp39 pathway.</a> Transplantation. 61, 4-9 (1996).</li>
<li>Saitovitch, D., Bushell, A., Mabbs, D. W., Morris, P. J., Wood, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+induction+of+transplantation+tolerance+with+a+nondepleting+anti-Cd4+monoclonal+antibody+and+donor-specific+transfusion+before+transplantation.+A+critical+period+of+time+is+required+for+development+of+immunological+unresponsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Kinetics of induction of transplantation tolerance with a nondepleting anti-Cd4 monoclonal antibody and donor-specific transfusion before transplantation. A critical period of time is required for development of immunological unresponsiveness.</a> Transplantation. 61, 1642-1647 (1996).</li>
<li>Callaghan, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+allograft+survival+by+inhibitory+FcgammaRIIb+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of allograft survival by inhibitory FcgammaRIIb signaling.</a> J. Immunol. 189, 5694-5702 (2012).</li>
<li>Qian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+donor+MHC+Class+I+or+Class+II+antigen+deficiency+on+first-+and+second-set+rejection+of+mouse+heart+or+liver+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Impact of donor MHC Class I or Class II antigen deficiency on first- and second-set rejection of mouse heart or liver allografts.</a> Immunology. 88, 124-129 (1996).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+acceptance+of+mouse+kidney+allografts+is+associated+with+increased+Foxp3+expression+and+differences+in+the+B+and+T+cell+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Spontaneous acceptance of mouse kidney allografts is associated with increased Foxp3 expression and differences in the B and T cell compartments.</a> Transpl. Immunol. 24, 149-156 (2011).</li>
<li>Liu, F., Kang, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+Heart+Transplantation+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Heterotopic Heart Transplantation in Mice.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li>
<li>Mottram, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrocardiographic+monitoring+of+cardiac+transplants+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Electrocardiographic monitoring of cardiac transplants in mice.</a> Cardiovasc. Res. 22, 315-321 (1988).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Transplante cardíaco Mouse é um método de microcirurgia exigente, que requer habilidade cirúrgica considerável para dominar. O aspecto mais difícil é o pequeno diâmetro dos vasos. Além disso, é necessário limitar o tempo de funcionamento do destinatário e sangramento. A técnica de transplante cardíaco do rato foi primeiramente descrita por Corry et al. em 1973 e, posteriormente, por Mottram et al 12. Nossos modificações incluem os seguintes pontos. Em primeiro lugar, a perfusão imediata do c...

Os modelos animais de transplante de órgãos pode fornecer informações valiosas para melhorar o tratamento de pacientes transplantados clínicos. Modelos de mouse são particularmente úteis para o estudo do mecanismo imunológico da rejeição de transplantes de órgãos ou de aceitação, devido à ampla gama de ratos e reagentes específicos para os ratos que não estão disponíveis para outros modelos animais geneticamente modificados 1-3. Um desafio com modelos do rato do transplante é a pequena dimensão dos doadores e receptores que requer habilidade técnica considerável para alcançar resultados satisfatórios. A técnica foi descrita pela primeira vez para o transplante heterotópico de coração de ratos 4, que foi posteriormente adaptado para transplante cardíaco do rato por Corry et al 5. Esta técnica envolveu a preparação do receptor antes da operação de dador e sem perfusão do coração de dador, ambos os quais são de natureza a comprometer a sobrevivência do transplante cardíaco ou tele destinatário. O procedimento tem sido amplamente utilizado como descrito originalmente para examinar os mecanismos de rejeição de transplantes e de tolerância de 6-8. Outros têm adaptado o procedimento original coração de rato transplante de Ono e Lindsey para transplantes cardíacos em ratos 9,10. Mais recentemente, uma técnica foi publicada por transplante de coração rato que superou alguns dos problemas associados com o método de Corry et al 11. O protocolo aqui descrito incorpora nossas modificações, com base no método de Mottram et al, 12, os quais incluem: perfusão in situ com solução salina heparinizada a frio imediatamente após toracotomia e realizar a operação de dador antes da operação de receptor para receptor minimizar o tempo de operação. Além disso, podemos usar grampos embarcação atraumáticas pequenas em vez de gravatas de seda 6-0. Embora grampos vasos têm a desvantagem de tomar mais espaço que eles são mais fáceis de controlar do que os laços, que não deve ser muito apertado ou soltoe são menos fáceis de remover do que as braçadeiras. O nosso método utiliza um único fio de sutura de corrida para a anastomose navio, embora na aprendizagem inicial estágios uma alternativa é a utilização de suturas de ancoragem na extremidade proximal e cantos distais para assegurar uniformidade de suturas e, portanto, a permeabilidade da anastomose.

<table><tbody><tr><td>Microscópio cirúrgico&nbsp;</td><td>Leica, Heerbrugg, Suíça</td><td>M651</td> Máquina anestésica <td>de ampliação de 10-25X</td></tr><tr><td></td><td>Vet Quip Pty Ltd, Sydney, Austrália</td><td>Vett3</td><td>Capaz de fornecer uma mistura de isoflurano e oxigênio no ar&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de operação&nbsp;</td><td>Loja de ferragens ou fornecedor</td><td></td><td>de escritório Cortiça densa ou sintética capaz de receber alfinetes Solução</td></tr><tr><td>salina heparinizada (5 U/ml, 4 &deg; C)</td><td>Pfizer, EUA</td><td>FW25</td><td>Em seringa de 1 ml com agulha de 23 G no gelo</td></tr><tr><td>Solução salina normal (37 &graus; C)</td><td>AstraZeneca Pty Ltd, Austrália</td><td>4538</td><td>Em seringa de 1 ml com agulha de 23 G em almofada quente</td></tr><tr><td>Suturas 10- nylon, 5-0 Vicryl</td><td>Ethicon, Inc. NJ, EUA</td><td>2870G/J421H</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina (0,05 mg/kg em solução salina de 0,1 ml)</td><td>Reckitt Benckiser, Sydney, Austrália</td><td></td><td>Em seringa de 1 ml com agulha de 23 G em gelo</td></tr><tr><td>Ampcilina (5 mg/kg em solução salina de 0,1 ml)</td><td>Aspen, Sydney, Austrália</td><td></td><td>Em seringa de 1 ml com agulha de 23 G em gelo</td></tr><tr><td>Gel Foam</td><td>Pharmacia & Upjohn Co. USA</td><td>801289304</td><td>Corte em pedaços pequenos Dispositivo</td></tr> de <tr><td>cautério de alta temperatura</td><td>Medtronic, USA</td><td>8444000</td><td></td></tr><tr><td>Almofada de Aquecimento/Temperatura Direita</td><td>Kent Scientific Corporation, Turrington, CT 06790</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instrumentos de microcirurgia:</td><td>Shanghai Medical Instruments Co. Ltd.,&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microagulhas</td><td>Shanghai, China</td><td>WT2020</td><td></td></tr><tr><td>Microtesouras</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "</td><td>WT1020</td><td></td></tr><tr><td>Microfórceps (ponta reta)</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "</td><td>WA3010</td><td></td></tr><tr><td>Microfórceps (ponta curva)</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "</td>Abraçadeiras de micromosquito <td>WA3020</td><td></td></tr><tr><td>(1 par)</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "</td><td>W40350</td><td></td></tr><tr><td>Abraçadeiras atraumáticas de microvasos (1 par)</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "</td><td>W40130/W40150</td><td></td></tr></tbody></table>

um método modificado para heterotópico rato coração transplante

A Modified Method for Heterotopic Mouse Heart Transplantion

Ratos são muitas vezes utilizados como doadores de transplante de coração e receptores em estudos de imunologia do transplante devido à ampla gama de camundongos transgênicos e reagentes disponíveis. A dificuldade é apresentada devido ao pequeno tamanho do animal e os desafios técnicos consideráveis ​​da microcirurgia envolvidos no transplante de coração. Em particular, uma alta taxa de falha técnica logo após o transplante pode resultar da morte do destinatário e complicações pós-operatórias, como a paralisia dos membros posteriores ou um coração sem bater. Aqui, a técnica completa para o coração transplante heterotópico rato é demonstrado, envolvendo a colheita do coração do doador e sua posterior implantação em um rato destinatário. O coração de dador é colhido imediatamente após perfusão in situ com solução salina heparinizada a frio e a transecção da aorta ascendente e da artéria pulmonar. A operação envolve a preparação de receptor a aorta abdominal e veia cava inferior (IVC), seguido pelaanastomose término-lateral da aorta do doador com a aorta do receptor através de um único corredor 10-0 microsuture e uma anastomose semelhante da artéria pulmonar do dador com o destinatário da VCI. Na sequência da operação, o animal é injectado com 0,6 ml de solução salina normal subcutaneamente e deixados a recuperar numa almofada de aquecimento de 37 ° C. Os resultados de 227 transplantes de coração do rato são resumidas com uma taxa de sucesso de 48 horas de 86,8%. Das falhas 13,2% dentro de 48 horas, 5 (2,2%) apresentaram paralisia dos membros posteriores, 10 (4,4%) tinha um coração não bater devido ao enxertar lesão isquêmica e / ou trombose, enquanto 15 (6,6%) morreram dentro de 48 horas .

Depois de um período de formação inicial, foram analisados ​​227 casos de rato transplante cardíaco heterotópico em nosso grupo. A taxa de sucesso nas primeiras 24 horas foi de 90,3% e em 48 horas foi de 86,8%. Dos 30 (13,2%) falhas dentro de 48 horas, 5 (2,2%) apresentaram paralisia dos membros posteriores e teve que ser sacrificado, 10 (4,4%) tinha um coração não bater devido a lesão de isquemia do enxerto e / ou trombose, enquanto 15 (6,6%) morreram dentro de 48 horas. Alguns sobreviventes de enxertos experimentais s...

Uma técnica é demonstrada para o procedimento microcirúrgico para transplante heterotópico de corações em camundongos, incluindo métodos simplificados para coleta de doadores e anastomose de vasos receptores.

Um método modificado para heterotópico Rato coração transplante

Mice are often used as heart transplant donors and recipients in studies of transplant immunology due to the wide range of transgenic mice and reagents ...

O objetivo geral deste procedimento é transplantar um coração de um doador para um camundongo receptor. Isso é realizado primeiramente removendo o coração da caixa torácica do doador e armazenando-o em solução salina fria. Os próximos passos consistem em transplantar o coração para o abdômen do receptor e, em seguida, monitorar as batidas cardíacas do órgão transplantado.Por fim, a rejeição do transplante é confirmada por inspeção visual e análise de patologia. Em última análise, os resultados mostram que corações transplantados entre cepas não relacionadas de camundongos são rejeitados, enquanto corações transplantados entre a mesma cepa são aceitos. A demonstração em vídeo a longo prazo deste procedimento é crítica, pois os passos microcirúrgicos são difíceis de aprender devido ao tamanho muito pequeno dos animais doadores e receptores.O procedimento cirúrgico complicado envolvido e a necessidade de aumentar a precisão e a velocidade na realização das operações em receptores sempre exigem que todos os instrumentos sejam cuidadosamente limpos e esterilizados em uma solução de etanol a 80%. O uso de equipamentos descartáveis esterilizados é altamente recomendável. Após anestesiar o camundongo doador em uma câmara com isoflurano, posicione-o em decúbito dorsal sobre a mesa cirúrgica.Em seguida, conecte rapidamente o cone nasal, administrando o anestésico. Certifique-se de testar a qualidade da anestesia com uma pinça no pé traseiro. Se não houver resposta de contração, inicie a depilação da pele usando uma lâmina cirúrgica.Em seguida, esterilize a pele com três passadas alternadas de clorexidina 2% em álcool isopropílico 70% durante toda a cirurgia. Monitore visualmente a respiração e a frequência cardíaca do animal. Ajuste a administração de isoflurano conforme necessário.Inicie realizando uma toracotomia para expor o coração e os vasos, abrindo o tórax por ambos os lados da caixa torácica. Corte da borda da costela até a axila e transversalmente ao nível do esterno xifoide. Isso forma um retalho da parede torácica.Fixe com alfinetes a aba aberta na placa cirúrgica próxima à cabeça. Em seguida, remova o pericárdio ao redor do coração. Levante a veia cava inferior com pinça e injete um mililitro de solução salina heparinizada fria na veia cava inferior próxima ao coração.Em seguida, prenda uma pequena pinça arterial à veia cava inferior para evitar que a solução retorne pelo orifício da agulha, utilizando gaze e um aplicador de algodão. Desloque o coração para baixo a fim de expor a aorta e a artéria pulmonar. O seio transverso é o canal localizado posteriormente ao conjunto formado pela aorta e pela artéria pulmonar.Em seguida, corte a aorta e a artéria pulmonar o mais distalmente possível para maximizar o comprimento dos vasos para a anastomose. Agora, divida a VCI, a VCS direita, a VCS esquerda e as veias pulmonares. Cada uma deve ser ligada separadamente usando fio de seda 6,0.Primeiro, amarre a VCI e a VCS direita. Em seguida, amarre a VCS esquerda e as veias pulmonares. Agora, remova o coração cortando todos os vasos distais aos amarros.Armazene o coração em solução salina estéril e fria a quatro graus Celsius até o transplante. Após preparar o animal para a cirurgia conforme descrito para o doador, inicie realizando uma laparotomia. Corte ao longo da linha média, desde a sínfise púbica até o processo xifóide do esterno.Usando clipes de papel dobrados como retratores. Abra o abdômen, envolva as alças intestinais em gaze umedecida com solução salina aquecida e retraias para o quadrante superior direito do abdômen. Em seguida, exponha a aorta infrarrenal e a veia cava inferior (IVC) entre a bifurcação ilíaca e a artéria e veia renais esquerdas.Solte o segmento empacotado da aorta e da veia cava inferior (VCI). Em seguida, separe a aorta e a VCI dos vasos lombares com um dispositivo de eletrocautério calibrado. Aplique pequenos grampos não traumáticos nas extremidades proximal e distal do segmento livre de aorta e VCI.Usando uma agulha de 30 mm, faça um orifício na parede anterior da aorta a partir do corte feito verticalmente, criando uma abertura do tamanho da aorta do doador. Aproveite esta oportunidade para remover quaisquer coágulos sanguíneos da luz da aorta com uma lavagem de solução salina heparinizada. Agora, introduza o coração do doador em solução salina fria.Posicione o coração doador ao lado da incisão na aorta do receptor. Posicione a artéria pulmonar doadora ao lado da VCI do receptor utilizando suturas de náilon contínuas 10-0. Anastomose as aortas de extremidade para lateral.Inicie no canto proximal e suture ao longo do lado esquerdo até o canto distal. Em seguida, gire o animal 180 graus. Depois, desloque o coração e continue os pontos pelo lado direito da parede aórtica, do distal para o proximal.Antes de fechar a anastomose, lave suavemente a luz com solução salina de olhos com heparina para remover coágulos e ar. Em seguida, finalize o sutura. Depois, faça uma incisão vertical na parede anterior da VCI onde a artéria pulmonar será anastomosada.Em segundo lugar, utilize 10 pontos contínuos para a anastomose. Os vasos começam na extremidade distal da parede esquerda dentro da luz da VCI na extremidade proximal. Continue ao longo da parede frontal direita e suture até a extremidade distal novamente.Realize uma boa lavagem do lúmen antes de concluir a anastomose. Em seguida, coloque pedaços de espuma de gel ao redor da anastomose. A hemostasia é alcançada com pressão suave aplicada por aplicadores de algodão.Para revascularizar o receptor. Solte primeiro a pinça distal, depois a pinça proximal. Durante a cirurgia do receptor, é fundamental otimizar a precisão e a velocidade do procedimento.Assim, o tempo de pinçamento cruzado deve ser idealmente inferior a 30 minutos. Para auxiliar a recuperação, aplique solução salina aquecida a 37 graus Celsius no local do enxerto. A fibrilação deve ser imediata e reverter espontaneamente para o ritmo sinusal dentro de alguns minutos.Antes de fechar o local cirúrgico, deve-se administrar uma injeção de buprenorfina por via intramuscular. Finalize a operação fechando a ferida com um ponto contínuo absorvível 5-0 para todas as camadas teciduais. Após o fechamento da ferida cirúrgica, injete o animal receptor com ampicilina e uma injeção subcutânea de 0,6 mililitros de solução salina.Para auxiliar na hidratação, coloque o animal sobre uma placa aquecida regulada em 37 graus Celsius até que recupere a consciência. A maioria dos animais bebe e até se alimenta dentro de três horas após a cirurgia. Se após oito horas o camundongo ainda apresentar sinais de desconforto, administre injeções de buprenorfina a cada 12 horas até que os sintomas desapareçam.Se o camundongo permanecer em estado de sofrimento por mais de 48 horas, entre em contato com um veterinário durante os primeiros 10 dias pós-operatórios. Monitore diretamente a frequência cardíaca do enxerto por meio de palpação abdominal. Diariamente, registre a intensidade da pulsação como quatro mais (+) para um enxerto saudável até um mais (+) para uma pulsação fraca devido à rejeição avançada.Registre um enxerto sem batimento como negativo devido à rejeição completa do enxerto após 10 dias. Continue monitorando o pulso cardíaco do enxerto três vezes por semana. Após 227 transplantes cardíacos heterotópicos, 90,3% foram bem-sucedidos por 24 horas e 86,8% foram bem-sucedidos por 48 horas. As falhas incluíram paralisia dos membros posteriores, coração sem batimento devido ao enxerto, lesão isquêmica e/ou trombose, e morte; os sobreviventes ao enxerto foram catalogados.A causa da falha no transplante de coração foi determinada por meio de análise anatomopatológica. A análise do coração transplantado, aqui marcado por uma seta, revelou trombose e infarto do tecido cardíaco, sendo essa a causa da falência desse coração enxertado na combinação de linhagem doador C57 Black seis e receptor; nenhum coração foi rejeitado e os corações transplantados sobreviveram por mais de 100 dias. Neste caso, o coração havia reduzido ligeiramente de tamanho devido à atrofia muscular secundária ao seu status não sustentador de vida.Em contraste, na combinação de linhagens com rejeição de doador DBA dois para receptor C 57 Black seis, esse coração transplantado deixou de bater no sétimo dia e apresentou evidências de rejeição em 100 dias. O mesmo coração estava completamente fibrotico e contraído quando analisado posteriormente. Esta técnica pode ser realizada em 90 milhões ou menos, se for executada corretamente, e não se esqueça de que trabalhar com gás de óxido nitroso pode ser extremamente perigoso.O uso de um sistema de aspiração de gás anestésico está amplamente disponível.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

O rato modelo de transplante cardíaco heterotópico tem sido comprovada por muitos pesquisadores de ser um método importante para o estudo dos mecanismos de rejeição e de resposta imune. No entanto, as técnicas envolvidas são ainda um desafio. Ao modificar as técnicas padrão que temos tido sucesso com mais de 1.000 transplantes.

Transplante cardíaco heterotópico em ratos

O modelo de transplante de coração de murídeo cervical é bem adequado para imunológico, bem como estudos de lesão de reperfusão de isquemia. Nós modificamos o procedimento usando uma técnica cuff não sutura e realizou mais de 1.000 transplantes de sucesso com essa abordagem.  Aqui, nós fornecemos mais detalhes desta técnica para complementar o vídeo.

Murino Cervical Modelo de coração Transplante usando uma técnica Cuff Modificado

O manuscrito descreve as etapas necessárias para realizar o transplante cardíaco heterotópico no mouse.

Técnica de transplante heterotópico Murino Coração

A técnica do manguito encurta e facilita o modelo de transplante cardíaco cervical heterotópico em camundongos, evitando anastomoses de sutura tecnicamente desafiadoras de pequenos vasos. Os detalhes técnicos mostrados neste vídeo devem permitir que as pesquisas estabeleçam esse modelo em seus laboratórios.

Heterotopic Cervical Transplante Cardíaco em Ratos

Introduzimos uma abordagem interna do tubo da técnica de manguito para transplante de coração heterotópico cervical do rato para ajudar a everter o vaso sobre a braçadeira. Descobrimos que a cooperação entre dois cirurgiões experientes diminui significativamente o tempo de operação.

Otimização da Técnica de Manguito para Transplante de Coração de Murine

Uma nova técnica para reconstrução do circuito sanguíneo em um modelo de transplante de coração de camundongo heterotópico é demonstrada.

Reconstrução do circuito sanguíneo em um modelo de transplante de coração de rato abdominal

No presente protocolo, um modelo de transplante cardíaco em camundongos é utilizado para investigar o mecanismo de rejeição do enxerto cardíaco. Neste modelo heterotópico de transplante cardíaco, a eficiência da operação é melhorada, e a sobrevida dos enxertos cardíacos é garantida por uma anastomose cervical término-terminal do implante cardíaco usando uma técnica de Cuff modificada.

Técnica de Cuff Modificada para Modelo de Transplante Cardíaco Heterotópico Cervical:

Modelos de transplante cardíaco de camundongos representam valiosas ferramentas de pesquisa para o estudo da imunologia do transplante. O presente protocolo detalha o transplante cardíaco cervical heterotópico de camundongos que envolve a colocação de manguitos na artéria carótida comum do receptor e no tronco da artéria pulmonar do doador para permitir o fluxo sanguíneo laminar.

Transplante cardíaco cervical heterotópico de camundongo utilizando manguitos vasculares

O presente artigo descreve uma técnica modificada para transplante cardíaco vascularizado heterotópico com técnica asséptica atualizada, analgesia e anestesia.

Protocolo de transplante cardíaco heterotópico murino modificado que atende aos padrões contemporâneos de técnica asséptica, anestesia e analgesia

Este protocolo apresenta uma técnica simplificada de anastomose de sutura ponta a ponta para transplante cardíaco cervical murino, fornecendo um modelo robusto e reprodutível para o estudo da imunologia de transplantes.

Transplante cardíaco de camundongo heterópico cervical usando a técnica de anastomose ponta a lateral para estudar imunologia de transplante

Aprenda a técnica de transplante cardíaco heterotópico em camundongos, incluindo colheita do coração doador e anastomose vascular. Este método permite estudar rejeição de enxertos e compatibilidade entre linhagens em pesquisa cardiovascular.

Um método modificado para heterotópico Rato coração transplante

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