Comprimento de Onda Único Sombra Imagem de

O objetivo geral deste procedimento é medir e avaliar a velocidade do percurso vertical e as forças exercidas por um nematódeo nadando livremente, utilizando radiação coerente monocromática. Isso é realizado primeiramente montando um experimento de sombra coerente monocromática para o "sea elegance" nadando livremente. Em seguida, um indivíduo adulto de "sea elegance" é colocado na câmara de visualização do experimento de sombra, que é um vet.

A sombra do verme ao descer através do feixe de laser é registrada como um vídeo, e esse vídeo é usado para analisar o movimento do animal. Assim, determina-se a trajetória de um nematódeo nadando livremente e as forças associadas geradas. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como a microscopia tradicional em um plano horizontal, é que o movimento de microrganismos nadando livremente pode ser investigado utilizando uma ampla gama de luz monocromática a um baixo custo.

Este método pode responder perguntas fundamentais sobre as forças geradas por ou respondidas por nematoides em um ambiente líquido. Tivemos a ideia inicial deste método quando começamos a explorar a possibilidade de movimento vertical em espécies microscópicas. A demonstração visual deste método é essencial, pois as etapas do procedimento são difíceis de aprender, já que é necessário algum treinamento para ajustar corretamente o alinhamento do laser.

Além disso, é necessário algum tempo no laboratório de biologia para aprender como preparar os vermes, montar a configuração experimental para criar imagens de sombra. Use dois ou mais espelhos para direcionar o laser de hélio-neônio para o expansor de feixe galileano, onde ele deve aumentar para 12 milímetros. Coloque um ou dois orifícios de alfinete no trajeto do feixe para garantir seu alinhamento a partir do expansor.

Direcione o feixe para um quartzo Q montado. Após a passagem do feixe, o quartzo Q o amplia usando uma lente plano-convexa com uma distância focal positiva de 75 milímetros. Em seguida, posicione uma tela a cerca de 120 centímetros da lente, que é a distância de resolução ideal.

Posicione uma câmera de alta velocidade de forma que possa capturar a imagem da tela, como ao lado do Q vet. Um microscópio estereoscópico para coletar os vermes também deve estar próximo ao qve. Prenda temporariamente uma régua transparente com divisões em milímetros ao centro do suporte QVAD na tela, próximo à borda do campo de visão da câmera.

Use as linhas da régua para marcar a distância da escala para um milímetro. Faça isso para cada comprimento de onda utilizado, pois a refração variará devido às aberrações cromáticas no QV e às mudanças na ampliação conforme descrito anteriormente. No JoVE, tenha nematoides adultos jovens prontos para o qve.

Prepare também nematoides mortos devido à exposição ao clorofórmio. Comece enchendo o Q Vet com água destilada até um milímetro da borda. Inicie uma gravação com as luzes do ambiente acesas, de modo que a linha na tela seja inicialmente visível, e então apague as luzes do ambiente.

Em seguida, colete um nematódeo com uma alça de fio de platina. É importante colocar os vermes na placa vetorial tocando levemente a alça na superfície da água, sem agitar o meio. A imagem projetada do verme e da coluna de água é invertida.

Os vermes que descem com a gravidade parecerão mover-se para cima na tela. Para cada verme, grave cerca de 20 segundos e registre cerca de 50 vermes por condição. Primeiro, importe o vídeo para o programa de análise de vídeo.

Defina a escala utilizando as marcações de comprimento no vídeo para determinar o fator de ampliação. Em seguida, comece a rastrear o deslocamento linear da cabeça do nematódeo sombreado. Selecione pelo menos 10 pontos de dados ao longo do trajeto percorrido, um a cada 0,3 segundos aproximadamente.

A velocidade vertical é então calculada a partir da derivada dividida pelo fator de ampliação. É fundamental criar curvas separadas para o deslocamento horizontal e o deslocamento vertical. Já que a gravidade atua apenas na direção vertical.

Se os pontos de dados formarem uma linha geralmente reta, o trajeto é linear. Algum desvio no movimento da cabeça pode ser ignorado. Em seguida, no menu de análise, crie uma linha de regressão linear ajustando uma linha reta aos dados.

A inclinação da linha é a velocidade vertical do verme. Se um verme se mover de forma não linear, selecione ajuste de curva no menu de análise. A partir daí, ajuste a curva a uma equação de segunda ou terceira ordem.

Polinômio para cada curva no caminho ajusta uma curva aos dados. Ao deslizar os colchetes em cada lado do gráfico, a expressão matemática da curva é apresentada. Um erro relativo de até 15% aqui é aceitável.

Adicione curvas adicionais conforme necessário para cobrir os pontos de dados e tente interpolar as funções. Os ajustes das curvas devem ter a mesma inclinação onde se sobrepõem. A primeira e a segunda derivadas da curva fornecem a velocidade e a aceleração.

O empuxo é calculado utilizando três microgramas como massa do verme durante a deriva; não houve diferença distinguível nas taxas de descida de Caenorhabditis elegans vivos e mortos. A taxa de deriva descendente para ambos foi de 1,5 milímetro por segundo. No entanto, nematoides vivos são capazes de mudar de direção e nadar contra a gravidade; curvas são ajustadas ao deslocamento vertical do nematoide e a aceleração é calculada a partir de suas segundas derivadas.

As forças que atuam sobre o verme até que ele atinja o ponto de inversão são a gravidade, o arrasto, o empuxo e o empuxo propulsivo. A força resultante equivale à soma vetorial dessas forças. Considere as componentes verticais da força.

A força gravitacional é igual em magnitude à força de empuxo, assumindo que o verme possui densidade aproximadamente igual à da água, de modo que a equação pode ser simplificada até o ponto de inversão. O arrasto somado ao empuxo é constante. Inicialmente, o arrasto é maior, mas reduz-se gradualmente a zero enquanto o empuxo aumenta; no ponto de inversão, não há arrasto vertical, e o empuxo está direcionado para cima durante o movimento do verme.

O arrasto de subida vertical aumenta na direção descendente, portanto a força de empuxo deve ser maior que o arrasto mais o peso. O caminho não linear desta minhoca foi analisado. Ela mudou de direção.

Analisando seu deslocamento, ele desacelerou e começou a inverter o movimento aos 68 segundos. No entanto, a aceleração para cima diminuiu continuamente até que a aceleração resultante atingiu zero aos 68,5 segundos. Em seguida, passou a acelerar na direção negativa, descendo novamente.

Assim, quando a velocidade era zero, o verme apresentava um empuxo ascendente significativo, calculado em 1,32 piconewtons. Uma vez dominado, os dados podem ser obtidos em 10 minutos, desde que os vermes estejam prontos para serem retirados do parafuso sem-fim. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manter constante a taxa de gravação da câmera para todos os dados coletados, pois precisamos ajustar a taxa de quadros no programa de análise de vídeo após este procedimento. Outros estudos podem ser realizados, como estudos com comprimento de onda único, com o objetivo de responder perguntas como quais forças são exercidas em várias direções, vertical e horizontal.

Por exemplo, esta técnica óptica poderia ser usada por outros biólogos interessados nas propriedades de locomoção de organismos pequenos, como Proti ou outras unás aquáticas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa ideia de como analisar o movimento de micro-organismos nadando livremente utilizando a ampliação de imagens de sombra e, em seguida, um programa de análise de vídeo.