Name: Comprimento de Onda Único Sombra Imagem de Caenorhabditis elegans Locomotion incluindo a força Estimativas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-18T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Aprenda a medir a velocidade vertical e as forças de nematoides em natação livre usando imagem de sombra com radiação monocromática coerente. Esta técnica de baixo custo permite analisar a dinâmica de locomoção de C. elegans.

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Somos gratos pelo apoio do Instituto Vassar College Iniciação Científica de Verão (URSI), o Fundo de Investigação Salmão Lucy Maynard, NASA prêmio Não. NX09AU90A, National Science Foundation Center for Research Excellence em Ciência e Tecnologia (NSF-CREST) ​​prêmio Não. 0630388 e NSF prêmio No. 1058385.

1. C. elegans Preparação <ol><li> Prepare placas de Petri de jovem adulto C. elegans, conforme descrito em experimentos anteriores envolvendo suspensão de C. elegans em um fluido de preenchimento da cuvete 11. </li><li> No dia da análise de vídeo, escolher nematóides jovens adultos vivos directamente numa cuvete cheia com água desionizada, destilada utilizando uma escolha de platina, tal como descrito no passo 2. </li><li> Prepare mortos C. elegans com exposição clorofórmio. Continuar seguindo o procedimento descrito para a colheita nemátodos vivos descritos no passo 2. </li></ol> 2. Configuração óptica para a Análise de Vídeo <ol><li> Montar a montagem experimental para criar imagens sombreadas conforme mostrado na Figura 1. A câmara pode ser colocado a qualquer distância da tela, enquanto que é capaz de capturar uma vista frontal da tela. Um bom lugar é ao lado da tina de frente para a tela. <ol><li> Usando pelo menos dois espelhos paraorientar a saída ajustável de laser de Hélio-Néon para um expansor de feixe Galileu modo que o feixe é expandido para um diâmetro de 12 mm. </li><li> Coloque um ou dois furos no caminho do feixe de modo que o feixe passa através dos furos sem ser obstruído. Usar os orifícios para garantir o alinhamento seja mantido. </li><li> Direcionar o feixe expandido para uma tina de quartzo montado que é de 10 mm de largura e 10 mm de profundidade e 4 cm de altura. </li><li> Amplia o feixe usando uma lente plano-convexa com uma distância focal de 75 mm para positivo. </li><li> Coloque uma tela de projeção de aproximadamente 120 cm da lente. As distâncias maiores que este trará um maior ampliação da imagem da sombra. No entanto, a qualidade da imagem diminui com uma intensidade de luz mais baixa e um aumento do noticeability de interferência de difracção. </li><li> Colocar uma câmera de alta velocidade, que é capaz de pelo menos 60 fps, mesmo ao lado da tina de frente para a tela. </li></ol></li><li> Coloque um microscópio de dissecação, perto do conjunto ópticopara rápida transferência de nematóides na cuvete. </li><li> Temporariamente garantir uma régua transparente com divisões mm para o centro do suporte do cuvete perpendicular ao feixe expandido de modo que os projectos de viga uma imagem ampliada da régua na tela. Defina a escala de comprimento para análise de vídeo. <ol><li> Na tela de projeção, marcar a distância escala usando uma régua transparente fora do centro da imagem projectada para evitar a interferência com a projeção. <a href="Video_1_633nm.MOV" target="_blank">Clique aqui para o vídeo.</a> </li><li> Grave esta imagem e medir a ampliação. Retire o governante a partir da configuração. Repita este passo para outros comprimentos de onda que o ângulo de refração da luz em cada comprimento de onda através da lente irá variar de acordo com as aberrações cromáticas. </li></ol></li><li> Substitua a tina e preenchê-lo para dentro de 1 mm da borda com água destilada. </li><li> Comece a gravar enquanto a luz da sala está na forma que a distância da escala é incluído na mesmaimagens como a imagem projetada. Desligar a luz. </li><li> Usando uma picareta fio de platina achatado fino, mova jovem adulto indivíduo C. elegans, uma de cada vez a partir da placa de agar para a cuvete tocando a escolha para a superfície da água. O nematóide se tornará visível na coluna de água quando entra no feixe devido à luz difusa. <a href="Video_2_CB678_633nm.mov" target="_blank">Clique aqui para o vídeo.</a> </li><li> Filmar as imagens projetadas dos vermes que passam pelo feixe de laser expandido. É importante notar que a imagem projectada é invertido e os vermes que aparecem a mover-se na direcção contrária do seu movimento real. Worms que estão descendo com a gravidade vai aparecer para se mover para cima na tela (Figura 2). </li></ol> 3. Vídeo Preparação Dados <ol><li> Importe o vídeo para o programa de análise de vídeo. </li><li> Defina a escala usando o fator de ampliação previamente determinado. </li><li> Track o deslocamento linear da cabeça do nematóide sombreada com pelo menos 10 pontos de dados ao longo de todo o caminho percorrido. </li><li> Encontrar a velocidade na direcção vertical, tendo derivado (&quot;Y&quot;, &quot;Tempo&quot;) e dividir este valor pelo coeficiente de ampliação determinado no passo 2.2. </li></ol> 4. Análise de Dados <ol><li> Analisar a descendência linear de um C. elegans: <ol><li> Verifique para garantir que os pontos de dados sobre a posição vertical em relação gráfico de tempo geralmente formam uma linha reta. Alguns desvios podem ser ignorados devido ao movimento da cabeça do nematóide. Se os pontos de dados em geral, formam uma linha reta, continue na etapa 4.1.2, caso contrário, a descida não é linear ea análise deve ser continuado usando o passo 5.1 neste protocolo. </li><li> Criar uma linha de regressão linear ajustando uma linha reta 12 aos dados a partir do menu Análise. O declive desta linha é então a velocidade vertical da C.elegans. O declive é a mudança de posição dividida pela mudança no tempo ao longo de um determinado intervalo. Determinar a velocidade de descida dos vermes vivos e mortos desta maneira (Figura 3). </li><li> Calcule a média das velocidades de natação verticais dos nematóides. Um tamanho de amostra de cerca de 50 vermes é suficiente. Compare velocidades de natação em vermes vivos com velocidades de deriva em vermes mortos. </li></ol></li></ol> 5. Analisar Nonlinear Moção de C. elegans <ol><li> Da Seção 3, selecione um arquivo de vídeo analisadas, o que mostra uma descida não-linear na coluna de água (Figura 4). A descida não-linear pode ser identificada usando o passo 4.1.1 neste protocolo. </li><li> Selecione &quot;Curve Fit &#39;no menu&#39; Análise &#39;no software de análise de vídeo. Selecione uma segunda ordem (quadrática) polinomial. Coloque a curva. </li><li> Para uma região de interesse, ajustar o ajuste no gráfico, deslizando os suportes em cada lado of o ajuste no gráfico até que a curva é muito perto dos pontos de dados dentro da forma e / ou bem no interior das barras de erro. O programa de adaptação dá uma expressão matemática para a curva ajustada, que é a posição vertical, em relação ao tempo. Considere os erros de curva ajustada dada pelo programa relacionado com as propriedades físicas. Um erro relativo de 15% ou inferior é normalmente aceitável. </li><li> Adicionar mais curva se encaixa para cobrir seções adicionais de dados. Spline 13 as funções para a cobertura ideal: certifique-se que a curva se ajusta sobreposição e tente alinhar as curvas adjacentes para que o jogo encostas nas regiões sobrepostas. </li><li> Obter a velocidade para uma região de interesse, tomando a derivada da curva ajustada utilizando a expressão matemática obtido no passo 5.1.3. As velocidades podem variar no tempo. Note-se que o derivado é a inclinação de uma função. O derivado pode ser obtida matematicamente ou graficamente. Neste caso, é prático usar o dado expr matemáticoessão. </li><li> Tome a segunda derivada das curvas ajustadas para obter a aceleração. A aceleração pode variar com o tempo. </li><li> Multiplique a aceleração pela massa verme para calcular o empuxo, que o worm exerce. A massa estimada razoável é de 3 mg, assumindo que o worm é composto principalmente de água. </li></ol>

<ol><li>Ward, A., Lie, J., Feng, Z., Xu, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sensitive+neurons+and+channels+mediate+phototaxis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans.</a> Nature Neurosci. 11, 916-922 (2008).</li>
<li>Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 105-20987 (2008).</li>
<li>Vidal-Gadea, A. G., Davis, S., Becker, L., Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+behavioral+hierarchies+during+environmental+transitions+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Worm%22%5BJournal%5D)">Coordination of behavioral hierarchies during environmental transitions in Caenorhabditis elegans.</a> Worm. 1, 5-11 (2012).</li>
<li>Berri, S., Boyle, J. H., Tassieri, M., Hope, I. A., Cohen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+locomotion+of+the+nematode+C.+elegans+is+achieved+through+modulation+of+a+single+gait%5BTitle%5D)+AND+%22HFSP+Journal%22%5BJournal%5D)">Forward locomotion of the nematode C. elegans is achieved through modulation of a single gait.</a> HFSP Journal. 3, 186-193 (2009).</li>
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<li>Magnes, J., Raley-Susman, K., Melikechi, N., Sampson, A., Eells, R., Bello, A., Lueckheide, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Freely+Swimming+C.+elegans+Using+Laser+Diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Open+J.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Analysis of Freely Swimming C. elegans Using Laser Diffraction.</a> Open J. Biophys. 2 (3), 101-107 (2012).</li>
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<li>Taylor, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTaylor%2C+JR+%22Classical+Mechanics%22">Classical Mechanics</a>. , University Science Books. (2005).</li>
<li>Magnes, J., Susman, K., Eells, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Locomotion+Study+of+Freely+Swimming+Micro-organisms+Using+Laser+Diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction.</a> J. Vis. Exp. (68), (2012).</li>
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<li>Lyche, T., Schumaker, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+spline+approximation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Approximation+Theory%22%5BJournal%5D)">Local spline approximation methods.</a> Journal of Approximation Theory. 15 (4), 294-325 (1975).</li>
<li>Kim, N., Dempsey, C. M., Kuan, C. -J., Zoval, J. V., O'Rourke, E., Ruvkun, G., Madou, M. J., Sze, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gravity+Force+Transduced+by+the+MEC-4%2FMEC-10+DEG%2FENaC+Channel+Modulates+DAF-16%2FFoxO+Activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Gravity Force Transduced by the MEC-4/MEC-10 DEG/ENaC Channel Modulates DAF-16/FoxO Activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 177, 835-845 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A técnica SWSI fornece uma maneira adicional para compreender as capacidades locomotoras de organismos microscópicos, como nematóides de vida livre. Com esta técnica, temos uma distinção entre a locomoção ativa (natação) e deriva passiva devido à gravidade operando em nematóides mortos. Além disso, quando nematóides livre-natação mudar de direção durante a locomoção na água, somos capazes de medir as forças de arrasto e forças angulares, que estão operando em nematóides e exercidas pelos nematóides. Nematóides encontrar diferentes condições ambientais no solo. Existem bolsas de água dentro do solo, assim como as partículas sólidas e materiais biológicos de diferentes formas e texturas. Além disso, nematóides existir dentro de um ambiente gravitacional que eles respondem a 14. Além disso, os nemátodos perto da superfície do solo estão expostos a diferentes comprimentos de onda de luz, alterações de temperatura e humidade, assim como biológicovariáveis ​​como bactérias, fungos predadores e outros organismos do solo. Nematóides deve responder a todas estas diferentes variáveis, nadar e rastejar em diferentes meios de comunicação, transformando e alterando as estratégias de navegação. Todos esses cálculos complexos são efectuadas por apenas 302 neurónios, um subconjunto dos quais estão envolvidas na locomoção, e 95 do corpo células musculares parede. Medidas do tipo descrito pela técnica SWSI fornecer informação importante sobre como nematóides realizar essa complexidade de navegação. Para a primeira parte, medimos a taxa de descida geral do tipo selvagem C. elegans em 633 nm de luz. Com essas medidas, podemos estimar a força de arrasto um verme encontros. Para o estudo de caso de um nematóide acelerando, as forças envolvidas mudança continuamente desde as mudanças da força de arrasto com velocidade. Há algumas indicações de que somos capazes de fazer sobre as forças que actuam sobre o worm. Como o worm desacelera e tenta swim para cima a componente vertical da força de arrasto diminui até chegar a zero no ponto mais baixo da trajetória do nematóide. Neste ponto, o sem-fim deve ter uma força ascendente para nadar até. Este método pode ser modificado de várias maneiras. Quaisquer espécies microscópicas que navega em um líquido claro pode ser monitorado usando SWSI. Os estudos podem ser realizados com qualquer comprimento de onda que são acessíveis para câmeras digitais. As câmeras digitais normalmente pegar comprimentos de onda que vão desde o UV para perto de IR. Além disso, estudos horizontal pode ser realizado por dirigir o laser verticalmente para cima. A espécie pode então ser colocada sobre uma superfície transparente horizontal, como uma lâmina de microscópio. Ajustar o expansor de feixe ou a lente de aumento após o expansor de feixe pode aguçar imagens borradas. O usuário deve ter certeza de prender todos os componentes para a mesa para garantir o alinhamento do feixe consistente e fácil. O método está limitado pela disposição de laser wavelengths e resolução. Em essência, as vantagens deste método mais microscópios existentes, que são a flexibilidade em direções e comprimentos de onda, são também pontos fracos já que a instalação é simples. A ótica sofisticados e manchas de laser limitar a resolução. Algumas dessas desvantagens podem certamente ser melhorado no futuro, incluindo filtro espacial e projetar a imagem diretamente para uma câmera CCD. Os passos mais críticos na protocolo pode ser facilmente aprendido que a experiência é realizada pela primeira vez. Colocar o nemátodo na cuvete sem a criação de turbulência é crítica. Além disso, as vibrações podem perturbar a configuração e alterar o comportamento dos vermes. Certifique-se de limitar o poder, que é usado para sombrear imagem. 2 mW de um feixe de laser que é de 1 mm de diâmetro deveria ser o máximo, para evitar os efeitos de aquecimento. A configuração deve ser testado para efeitos de dispersão ao usar outros do que a água destilada líquidos. Atualmente, a maioria microscopes operar em um plano horizontal, usando luz ou de cor filtros brancos, que ainda são muito ampla na faixa de comprimento de onda. Microscópios que verdadeiramente utilizam comprimentos de onda simples e ter flexibilidade no cenário de visualização, isto é, o posicionamento horizontal, são normalmente limitados a um ou a outro vantagem. Além disso, estes tipos de microscópios são geralmente muito caros e ainda limitado a planos focais ao contrário nosso método. Nossa configuração pode ser facilmente construído com um orçamento extremamente baixo. Este método está pronto para ser usado por escolas, empresas ambientais, bem como outras entidades que operam com poucos fundos. No futuro, este método pode ser usado em uma configuração muito sofisticado para estudar os efeitos em tempo real sobre a locomoção e mechanosensation de espécies microscópicas. Este método faz com que os estudos de comprimento de onda simples, para uma vasta gama de ângulos de visão e profundidades facilmente disponíveis.

Caenorhabditis elegans é um nematóide do solo benéfico de vida livre que é um poderoso organismo modelo para estudar mecanismos de regulação gênica, desenvolvimento e, mais recentemente, para a compreensão da biologia e comportamento sensorial. Apesar de ter apenas 302 neurônios, C. elegans são capazes de padrões complexos locomotora, comportamentos reprodutivos, navegação, quimiotaxia e muitos outros comportamentos. C. elegans possuem mecanorreceptores, quimiorreceptores e até mesmo detectar comprimentos de onda de luz azuis (Ward et al., 2008) 1. Enquanto se sabe muito sobre o circuito neural da função sensório-motor e padrões locomotores gerais C. elegans, pouco se sabe sobre as respostas a vários estímulos simultâneos ou condições ambientais mais complexos do que podem ser modelados sob um microscópio. Alguns estudos revelaram padrões locomotores mais complexas que são 2,3,4 altamente plástico. Nossa abordagem metodológica permitirá estudos de NEMatodes em solução em tempo real, onde podemos facilmente fornecer várias condições ambientais simultaneamente. Esta questão é difícil de resolver usando técnicas de imagem convencionais à base de microscópio. Desenvolvemos uma técnica de imagiologia que permite colocar nemátodos dentro de uma coluna de água para analisar os comportamentos locomotores, bem como determinar as capacidades de nemátodos para alterar a locomoção em resposta a diferentes condições ambientais. Comprimento de Onda Único Sombra Imagem (SWSI) é apresentada neste artigo, pela primeira vez de preencher as lacunas de microscópios tradicionais. Microscópios tradicionais estão limitados a observar espécies num plano focal horizontal poucos microns de profundidade 5,6. Em relação aos estudos de comprimento de onda único, a maioria dos microscópios tradicionais usam filtros de cor para filtrar a luz branca muito ampla, tipicamente, 50-100 nm. Usando um laser para SWSI restringe a selecção de comprimento de onda inferior a 1 nm, enquanto se mantém o sinalificant intensidade de luz 7. Da mesma forma, os comprimentos de onda individuais têm sido usados ​​para medir freqüências de natação de C. elegans em tempo real 8. Para a primeira demonstração de nosso método, monitorar a posição horizontal, x, e a posição vertical, y, de um C. nadar livremente elegans em uma coluna de água, ao longo de uma distância de cerca de um centímetro. Em particular, estamos interessados ​​no movimento vertical já que a gravidade atua também na vertical. A inclinação de uma correlação linear para a posição vertical dá a velocidade vertical, v y, do nemátodo que desce na coluna de água: <img alt="Fórmula" fo:content-width="0.5in" src="/files/ftp_upload/51424/51424eq1.jpg" width="50" /> (1) A raiz quadrada da média do erro (RMSE) 9 indica a qualidade do ajuste e indica se a velocidade de descida é geralmente constante. As velocidades verticais são então a média para each espécies e vermes mortos. Usando estes resultados, o arrasto, que a experiência vermes pode ser estimada. Para a segunda demonstração do nosso método, foram selecionados C. elegans que não fez descer a uma velocidade constante, ao contrário da maioria dos vermes observados. Os vermes selecionados ou se virou e nadou para cima ou pairou durante algum tempo antes de continuar a descida. Fisicamente, este estudo de caso mostra que o impulso de um microorganismo a natação pode ser calculada. As leis de Newton ditam que um corpo que muda de direção acelera, o que implica uma força resultante, <img alt="Fórmula 1" fo:content-width="0.3in" src="/files/ftp_upload/51424/51424eq.jpg" width="25" /> , É agindo sobre o corpo 10: <img alt="Fórmula 2" fo:content-width="0.7in" src="/files/ftp_upload/51424/51424eq2.jpg" width="70" /> (2) onde <img alt="p" fo:content-width="0.1in" src="/files/ftp_upload/51424/51424p.jpg" width="10" /> éo movimento linear e t é o tempo. A aceleração do sem-fim é directamente proporcional à força que age sobre o sem-fim, uma vez a massa do sem-fim permanece constante. Como resultado, a força resultante vertical é: <img alt="Fórmula 3" fo:content-width=".8in" src="/files/ftp_upload/51424/51424eq3.jpg" width="70" /> (3) onde m é a massa de um sem-fim e uma y representa a aceleração vertical. A força resultante na direção vertical representa, em seguida, o impulso verme na mesma direção. O impulso total pode ser calculado com base no componente horizontal em conta.

<table><tbody><tr><td>Laser ajustável de hélio-neon&nbsp;</td><td>Research Electro-Optics</td><td>30602</td><td>Quatro comprimentos de onda podem ser selecionados entre 543 nm e 633 nm.</td></tr><tr><td>2 Espelhos de Alumínio de Superfície Frontal</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-F01</td><td></td></tr><tr><td>Câmera Exilim de Alta Velocidade</td><td>Casio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quartz Cuvette</td><td>Starna Cells</td><td>21/G/5</td><td></td></tr><tr><td>LoggerPro (Software)</td><td>Vernier</td><td></td><td>http://www.vernier.com/products/software/lp/</td></tr> <tr><td>Mathematica 8</td><td>Wolfram</td><td></td><td>http://www.wolfram.com/</td></tr><tr><td>Expansor de feixe galileu com zoom variável 5x-10x</td><td>Thorlabs</td><td>BE05-10-A</td><td></td></tr><tr><td>Lente plano-convexa com distância focal positiva de 75 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1257</td><td></td></tr></tbody></table>

comprimento de onda Único sombra imagem de<em&gt; caenorhabditis elegans</em&gt; locomotion incluindo a força estimativas

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

Este estudo demonstra uma técnica de baixo custo e simples, que permite a medição de propriedades físicas, tais como a posição, velocidade, aceleração e forças envolvidas no comportamento locomotor de nemátodos suspensos na coluna de água, em resposta a comprimentos de onda individuais de luz. Demonstramos como avaliar a locomoção de um organismo microscópico usando Comprimento de Onda Único Sombra Imagem (SWSI) usando dois exemplos diferentes. O primeiro exemplo é um estudo sistemático e estatisticamente viável da descida média de C. elegans em uma coluna de água. Para este estudo, foram utilizados vivos e mortos wildtype C. elegans. Quando comparamos a velocidade e direção do nematóide movimento ativo com a descida passiva de vermes mortos dentro do campo gravitacional, este estudo não mostrou diferença na descida dos tempos. A descida média foi de 1,5 mm / s ± 0,1 mm / s para ambos os vermes vivos e mortos utilizando 633 nm coerenteluz. O segundo exemplo é um estudo de caso de select indivíduo C. elegans mudando de direção durante a descida em uma coluna vertical. Aceleração e força são analisados ​​neste exemplo. Este estudo de caso demonstra o alcance de outras propriedades físicas que podem ser avaliados usando SWSI ao avaliar o comportamento usando comprimentos de onda individuais em um ambiente que não é acessível com microscópios tradicionais. Utilizando esta análise estimou-se um nematóide indivíduo é capaz de empurrar com uma força acima de 28 nN. Nossos resultados indicam que os nematóides vivos exercer 28 nN quando virar, ou movendo-se contra o campo gravitacional. Os resultados sugerem ainda que a nematóides descer passivamente em uma coluna de água, mas pode resistir activamente a força da gravidade, principalmente pelo sentido de rotação.

Descida Firme A primeira investigação não mostra nenhuma diferença distinguível nas taxas descendentes do C. elegans durante SWSI usando 633 nm. As taxas de descendentes foram encontrados para ser constante a 1,5 mm / seg de ± 0,1 mm / s para ambos o vivo e morto a C. elegans. Um tamanho de amostra de 50 vermes gerou uma variação razoável de 7% para os vivos e vermes mortos. Não há nenhuma aceleração agindo sobre os vermes vez que a velocidade descendente é constante, de modo que a força de arrasto é igual à força gravitacional menos a força de empuxo. Isto implica que a densidade do sem-fim é ligeiramente maior que a da água; No entanto, para as estimativas abaixo ainda é prático para supor que a densidade de um nemátodo é aproximadamente a da água. Alterar Direção A segunda investigação, um estudo de caso, demonstra que nematóides são capazes de mudar de direção e pode nadar para cima contragravidade. Duas curvas foram ajustadas para o deslocamento vertical do nemátodo de modo que as segundas derivadas dessas curvas pode ser estriado para representar graficamente a aceleração em função do tempo (Figura 5). &#160; É aconselhável manter a ordem polinomial tão baixa quanto possível mantendo ao mesmo tempo um bom ajuste. A ordem polinomial inferior indica menor variação na aceleração ao longo do tempo. Os termos do polinômio de ordem superior será insignificante e, portanto, desnecessário, se a ordem do polinômio é muito alto. Este verme desacelera com uma velocidade constante de 0,110 milímetros / seg 2 ± 0,002 milímetros / seg 2, gira em torno de e acelera a mesma taxa de 0,110 milímetros / seg 2 ± 0,002 milímetros / seg 2 até pouco depois o ponto de reviravolta. O C. elegans continua a mover-se para cima, com uma aceleração de diminuir 1,252-,00708 t em mm / s 2 até o aceleração cai para zero. Tendo em mente Eq. 3, e um sem-fim de massa estimada de 3 &amp; #956; g, o worm sofre uma força resultante vertical, F Ny, de 0,33 pN até pouco depois do ponto de reviravolta. Descent: Existem três tipos de forças que atuam sobre o verme até o verme atinge o ponto de viragem: a gravidade, de arrasto, de flutuação e empuxo (Figura 6a). A força resultante é igual à soma vetorial de todas as três forças. Aqui, consideramos apenas os componentes verticais: F Ny = F Dy + F Ty-F g + F B (4) onde F B é a força de empuxo. F g é igual em magnitude, mas oposta na direcção da força de flutuação assumindo que a densidade do sem-fim é o da água. Eq. 4 pode então ser escrita da seguinte forma: F Ny = F Dy + F Ty (5) F Ny permanece constante durante a descida. Isto implica queF Dy + F Ty permanece constante até o nemátodo atinge o ponto de reviravolta. F Dy é maior na parte superior, que é o princípio do percurso, e reduz gradualmente a zero até que a velocidade é igual a zero no ponto de retorno, enquanto F Ty deve aumentar para manter constante F Ny. Turnaround: Não há nenhuma força de arrasto na direção vertical no ponto de retorno desde a velocidade vertical igual a zero nesse ponto. As únicas forças que agem na direção vertical são a gravidade, - F g, flutuabilidade, F B eo impulso verme vertical, F Ty, conforme ilustrado na Figura 6b. Neste ponto, o teor de C. elegans pode ser determinado: F Ty = F Ny (6) A pressão na parte inferior do percurso é, então, mais ou menos igual a 0,33 pN, que é de cerca de 0,001% do peso do sem-fim. Levando-se emTendo em conta que o peso estimado, F g de um C. elegans é de 28 nn, Ascent: Da mesma forma, durante a subida, o aumento de arrasto, mas é apontado para baixo (Figura 6): F = Ny-F Dy + F Ty (7) O impulso implementado pelo worm agora deve ser ainda maior e igual a soma da força de arrasto eo peso. O verme está a abrandar depois de começar a nadar para cima. Para nadar até à mesma taxa como o verme desceu, o sem-fim terá de exercer um impulso para cima de pelo menos duas vezes o seu peso. Pairando Um exemplo de um sem-fim que retarda a sua descida por cerca de 3 segundos é apresentado na Figura 7. &#160; Um polinômio de 3 º grau é um ajuste razoável para o caminho todo. Os erros na aceleração e velocidade a partir deste ajuste ficam a menos de 15%. O worm começa com um upwa significativard impulso, fica mais lento e começa a girar em torno de 68 segundos; No entanto, a aceleração vertical diminui continuamente (Figura 8) &#160; até o aceleração líquida igual a zero em torno de 68,5 seg. Isto conduz eventualmente a uma aceleração de líquido no sentido descendente, seguido por um outro ponto zero na velocidade (Figura 9) &#160; e o nemátodo começa a descer de novo em 69 seg. É interessante que o máximo de aceleração vertical observada neste caso é de 2,7 mm / s 2. A aceleração nos pontos de inflexão são 0,455 milímetros / s 2 e - 0,455 milímetros / s 2, respectivamente; cerca de quatro vezes maior do que no caso do nemátodo que se vira para cima e nada. Usando Eq. 6, pode-se estimar que o impulso para cima é de cerca de 1,32 pN no primeiro ponto de viragem. No segundo ponto de viragem, a aceleração líquida é negativa, de modo que o impulso para cima é 1,32 pN. o: manter-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig1.jpg" /> Figura 1. Configuração Experimental. O laser, expansor de feixe, lente e tela são essenciais para a configuração experimental. Os espelhos de direcção e os encaixes pode ser omitido, mas irá fazer o alinhamento óptico menos estável. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig2.jpg" /> Figura 2. Imagem Única Wavelength Shadow (SWSI). Usando 2 mW de 543 nm laser a sombra de um worm é projetada em uma tela. A imagem é invertida de modo que o nemátodo parece cair para cima. 424/51424fig3highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51424/51424fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Descida vertical de um único tipo selvagem C. elegans em uma coluna de água. Este nematóide foi ensombrado por 633 nm de luz coerente. A inclinação do ajuste linear indica uma velocidade de queda de 1,09 mm / s ± 0,01 milímetros / seg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51424/51424fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig4.jpg" /> Figura 4. Gráfico deslocamento de um único tipo selvagem para cima natação C. elegans. Dois ataques estriados rastrear o caminho geral do nematóide. A segunda derivada do ajuste revela a aceleração. A aceleração máxima é facilmente determinada a partir do primeiro ajuste: 0,110 milímetros<html> / Seg 2 ± 0,002 milímetros / seg 2. Apenas algumas barras de erro são apresentados de modo que os pontos de dados e o ajuste permanecem visíveis. Este nematóide foi ensombrado por 633 nm de luz coerente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51424/51424fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig5.jpg" /> Gráfico Figura 5. Aceleração de um único tipo selvagem C. elegans. Este nematóide mantém uma aceleração para cima constante de 0,110 milímetros / seg 2 ± 0,002 milímetros / seg 2 fazendo com que ele fique lento e, em seguida, mover para cima. Logo após o ponto de retorno a aceleração diminui de forma constante e aceleração líquida diminui para zero.<html> g &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig6.jpg" /> Diagramas Figura 6. Força para descida, ponto e subida. Flutuabilidade e gravidade girando são iguais em magnitude e oposta em direção para que o efeito dessas forças se anulam mutuamente. Eles, portanto, não são mostrados nestes diagramas. (A) O worm está descendo com arraste e impulso para cima. (B) O worm está no ponto mais baixo da trajetória, sem arrastar. Thrust está apontando para cima. (C) O worm é ascendente com drag apontando para baixo enquanto impulso está apontando para cima. &quot;Src =&quot; / files/ftp_upload/51424/51424fig7.jpg &quot;/&gt; Figura 7. Gráfico de Deslocamento único nematóide pairando. O worm desacelera e começa a girar em torno de cerca de 68 segundos, mas começa a descer cerca de 69 seg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51424/51424fig7highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig8.jpg" /> .. Figura 8 gráfico Aceleração de um único nematóide pairando Este worm inicia-se com uma aceleração para cima de 2,7 mm / s 2, diminui a zero e, finalmente, tem uma aceleração de queda de -. 2,6 milímetros / seg 2 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51424/51424fig8highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma vers maiores</a>ião desta figura. <img alt="Figura 9" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig9highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig9.jpg" /> Figura 9. Gráfico de velocidade de um único nematóide pairando. Este worm trata de uma parada em 68 segundos e começa a cabeça para cima, desacelera e atinge uma velocidade zero na direção vertical em 69 segundos seguido de uma descida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51424/51424fig9highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Tabela 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424table1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424table1.jpg" width="400" /> Tabela 1. Velocidades de descida média de N2 C. elegans. 50 ao vivo e 50 nematóides mortos são tracked durante a sua descida. A velocidade média para as descidas é o mesmo para o vivo e as lagartas mortas: a 1,5 mm / seg de ± 0,1 mm / seg.

A técnica apresentada aqui mede a caminho de nadar livremente espécies microscópicas usando exposição comprimento de onda único. C. elegans são usados ​​para demonstrar imagem sombra como uma alternativa barata para microscópios caros. Esta técnica pode ser adaptada para acomodar várias orientações, ambientes e espécies para medir a direcção, velocidade, aceleração e forças.

Comprimento de Onda Único Sombra Imagem de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Locomotion incluindo a força Estimativas

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, ...

O objetivo geral deste procedimento é medir e avaliar a velocidade do percurso vertical e as forças exercidas por um nematódeo nadando livremente, utilizando radiação coerente monocromática. Isso é realizado primeiramente montando um experimento de sombra coerente monocromática para o "sea elegance" nadando livremente. Em seguida, um indivíduo adulto de "sea elegance" é colocado na câmara de visualização do experimento de sombra, que é um vet.A sombra do verme ao descer através do feixe de laser é registrada como um vídeo, e esse vídeo é usado para analisar o movimento do animal. Assim, determina-se a trajetória de um nematódeo nadando livremente e as forças associadas geradas. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como a microscopia tradicional em um plano horizontal, é que o movimento de microrganismos nadando livremente pode ser investigado utilizando uma ampla gama de luz monocromática a um baixo custo.Este método pode responder perguntas fundamentais sobre as forças geradas por ou respondidas por nematoides em um ambiente líquido. Tivemos a ideia inicial deste método quando começamos a explorar a possibilidade de movimento vertical em espécies microscópicas. A demonstração visual deste método é essencial, pois as etapas do procedimento são difíceis de aprender, já que é necessário algum treinamento para ajustar corretamente o alinhamento do laser.Além disso, é necessário algum tempo no laboratório de biologia para aprender como preparar os vermes, montar a configuração experimental para criar imagens de sombra. Use dois ou mais espelhos para direcionar o laser de hélio-neônio para o expansor de feixe galileano, onde ele deve aumentar para 12 milímetros. Coloque um ou dois orifícios de alfinete no trajeto do feixe para garantir seu alinhamento a partir do expansor.Direcione o feixe para um quartzo Q montado. Após a passagem do feixe, o quartzo Q o amplia usando uma lente plano-convexa com uma distância focal positiva de 75 milímetros. Em seguida, posicione uma tela a cerca de 120 centímetros da lente, que é a distância de resolução ideal.Posicione uma câmera de alta velocidade de forma que possa capturar a imagem da tela, como ao lado do Q vet. Um microscópio estereoscópico para coletar os vermes também deve estar próximo ao qve. Prenda temporariamente uma régua transparente com divisões em milímetros ao centro do suporte QVAD na tela, próximo à borda do campo de visão da câmera.Use as linhas da régua para marcar a distância da escala para um milímetro. Faça isso para cada comprimento de onda utilizado, pois a refração variará devido às aberrações cromáticas no QV e às mudanças na ampliação conforme descrito anteriormente. No JoVE, tenha nematoides adultos jovens prontos para o qve.Prepare também nematoides mortos devido à exposição ao clorofórmio. Comece enchendo o Q Vet com água destilada até um milímetro da borda. Inicie uma gravação com as luzes do ambiente acesas, de modo que a linha na tela seja inicialmente visível, e então apague as luzes do ambiente.Em seguida, colete um nematódeo com uma alça de fio de platina. É importante colocar os vermes na placa vetorial tocando levemente a alça na superfície da água, sem agitar o meio. A imagem projetada do verme e da coluna de água é invertida.Os vermes que descem com a gravidade parecerão mover-se para cima na tela. Para cada verme, grave cerca de 20 segundos e registre cerca de 50 vermes por condição. Primeiro, importe o vídeo para o programa de análise de vídeo.Defina a escala utilizando as marcações de comprimento no vídeo para determinar o fator de ampliação. Em seguida, comece a rastrear o deslocamento linear da cabeça do nematódeo sombreado. Selecione pelo menos 10 pontos de dados ao longo do trajeto percorrido, um a cada 0,3 segundos aproximadamente.A velocidade vertical é então calculada a partir da derivada dividida pelo fator de ampliação. É fundamental criar curvas separadas para o deslocamento horizontal e o deslocamento vertical. Já que a gravidade atua apenas na direção vertical.Se os pontos de dados formarem uma linha geralmente reta, o trajeto é linear. Algum desvio no movimento da cabeça pode ser ignorado. Em seguida, no menu de análise, crie uma linha de regressão linear ajustando uma linha reta aos dados.A inclinação da linha é a velocidade vertical do verme. Se um verme se mover de forma não linear, selecione ajuste de curva no menu de análise. A partir daí, ajuste a curva a uma equação de segunda ou terceira ordem.Polinômio para cada curva no caminho ajusta uma curva aos dados. Ao deslizar os colchetes em cada lado do gráfico, a expressão matemática da curva é apresentada. Um erro relativo de até 15% aqui é aceitável.Adicione curvas adicionais conforme necessário para cobrir os pontos de dados e tente interpolar as funções. Os ajustes das curvas devem ter a mesma inclinação onde se sobrepõem. A primeira e a segunda derivadas da curva fornecem a velocidade e a aceleração.O empuxo é calculado utilizando três microgramas como massa do verme durante a deriva; não houve diferença distinguível nas taxas de descida de Caenorhabditis elegans vivos e mortos. A taxa de deriva descendente para ambos foi de 1,5 milímetro por segundo. No entanto, nematoides vivos são capazes de mudar de direção e nadar contra a gravidade; curvas são ajustadas ao deslocamento vertical do nematoide e a aceleração é calculada a partir de suas segundas derivadas.As forças que atuam sobre o verme até que ele atinja o ponto de inversão são a gravidade, o arrasto, o empuxo e o empuxo propulsivo. A força resultante equivale à soma vetorial dessas forças. Considere as componentes verticais da força.A força gravitacional é igual em magnitude à força de empuxo, assumindo que o verme possui densidade aproximadamente igual à da água, de modo que a equação pode ser simplificada até o ponto de inversão. O arrasto somado ao empuxo é constante. Inicialmente, o arrasto é maior, mas reduz-se gradualmente a zero enquanto o empuxo aumenta; no ponto de inversão, não há arrasto vertical, e o empuxo está direcionado para cima durante o movimento do verme.O arrasto de subida vertical aumenta na direção descendente, portanto a força de empuxo deve ser maior que o arrasto mais o peso. O caminho não linear desta minhoca foi analisado. Ela mudou de direção.Analisando seu deslocamento, ele desacelerou e começou a inverter o movimento aos 68 segundos. No entanto, a aceleração para cima diminuiu continuamente até que a aceleração resultante atingiu zero aos 68,5 segundos. Em seguida, passou a acelerar na direção negativa, descendo novamente.Assim, quando a velocidade era zero, o verme apresentava um empuxo ascendente significativo, calculado em 1,32 piconewtons. Uma vez dominado, os dados podem ser obtidos em 10 minutos, desde que os vermes estejam prontos para serem retirados do parafuso sem-fim. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manter constante a taxa de gravação da câmera para todos os dados coletados, pois precisamos ajustar a taxa de quadros no programa de análise de vídeo após este procedimento. Outros estudos podem ser realizados, como estudos com comprimento de onda único, com o objetivo de responder perguntas como quais forças são exercidas em várias direções, vertical e horizontal.Por exemplo, esta técnica óptica poderia ser usada por outros biólogos interessados nas propriedades de locomoção de organismos pequenos, como Proti ou outras unás aquáticas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa ideia de como analisar o movimento de micro-organismos nadando livremente utilizando a ampliação de imagens de sombra e, em seguida, um programa de análise de vídeo.

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