Name: Reconstituição de β-catenina degradação na Xenopus Extrato de ovo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-17T20:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Aprenda a reconstituir a degradação de β-catenina usando extrato de ovo de Xenopus. Este método permite analisar a dinâmica de turnover proteico e identificar moduladores em sistema bioquímico livre de células.

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Agradecemos Laurie Lee para a leitura crítica do manuscrito. TWC é apoiado por um American Heart Association Predoctoral Clube (12PRE6590007). MRB é apoiado por uma bolsa de formação Instituto Nacional do Câncer (T32 CA119925). SSH é suportado pelo National Institutes of Health (R01DK078640). EL é apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (R01GM081635 e R01GM103926).

1. Preparação do extrato do ovo Xenopus NOTA: Cada sapo produz cerca de 1 ml de extrato de ovo utilizável. Extratos de 10 rãs são normalmente preparados ao mesmo tempo, eo volume de tampão descrito abaixo é para realizar a 10 sapo Xenopus extrato do ovo de preparação. O volume do tampão pode ser ajustada em conformidade, para preparações maiores ou mais pequenas de extracto de ovo. Preps gerados desta maneira consistente originar concentrações de proteína ≥ 50 mg / ml. O processo de coleta de ovos e transformá-los em extrato é mais eficiente quando realizada por duas pessoas. (Para técnicas básicas de criação de sapo, ver Sive et al. 33). <ol><li> Coleção do ovo <ol><li> Para preparar os sapos, injetar cada sapo fêmea com 100 U de grávida Mare Serum gonadotrofina (PMSG) de um recém-feitos 250 estoque U / ml. Use uma seringa de 3 ml de tuberculina com uma agulha G 27 para injectar por via subcutânea, com o bisel daa agulha para cima, para dentro do saco de linfa dorsal, que está localizado a aproximadamente 1 cm de distância da linha média das descolorações dentada ao longo do comprimento das pernas de rã. </li><li> Armazene rãs condicionadas em água (além de NaCl 20 mM, consulte Sive et al. 33) a 18 ° C durante 5-10 dias. Para pé sistemas de tanques de água, a densidade animal é de aproximadamente 4 L de água por sapo fêmea. NOTA: O tempo mínimo necessário para aprontar para entrar em vigor é de 5 dias, e os efeitos de priming desgastar depois de 10 dias. </li><li> Solução 0,5 x de Marc Modificado Ringer (MMR) a partir de um estoque de 20x MMR preparar. 20x MMR consiste de cloreto de sódio 2 M, cloreto de potássio 40 mM, cloreto de cálcio 40 mM, cloreto de magnésio 20 mM, e 100 mM de 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazinoetanossulfónico ácido (HEPES), pH 7,4. </li><li> Configure baldes para todos os sapos injetados (um sapo por 4 L balde). NOTA: Apesar de mais de uma rã pode ser colocado no mesmo depósito de recolha de ovos, se um dos sapospõe ovos predominantemente de baixa qualidade, uma quantidade substancial de esforço será necessário para separar os ovos de má qualidade daqueles que são adequados para a tomada de extrato. Assim, maximizar o número de rãs no mesmo tanque para minimizar a quantidade de tampão usado para coletar ovos não vale a pena o risco. </li><li> Injetar 750 U gonadotrofina coriônica humana (HCG) no saco linfático dorsal de cada sapo usando uma agulha 27 G, conforme descrito em 1.1.1. </li><li> Coloque cada um dos sapos com injecção de HCG em baldes de 4 L individuais contendo 0,5 x MMR arrefecido a 16 ° C. </li><li> Coloque os contentores com as rãs em uma incubadora de 16 ° C para coletar ovos O / N (15-16 h). NOTA: Manter a temperatura adequada é fundamental para todo o processo, desde a coleta de ovos para preparar o extrato do ovo. </li></ol></li><li> Dejellying Eggs NOTA: Os ovos são cobertos com um revestimento de gelatina que tem de ser removido antes de fazer extracto. A probabilidade de lise espontânea dos ovos aumenta à medida que o tempo between postura de ovos e extrair preparação aumenta. Assim, é importante levar a cabo através dos seguintes passos, tão rapidamente quanto possível. <ol><li> Prepare a 4 L de 1x MMR, 50 ml de 0,1 x MMR, e 400 ml de 2% de cisteína, pH 7,7, feita em água destilada. Manter todas as soluções a 16 ° C. </li><li> Para expelir ovos adicionais, esprema delicadamente o lombar e abdômen do sapo. </li><li> Retire os sapos e a maior parte do MMR, para deixar os ovos em cerca de 1-200 ml de MMR em cada balde. </li><li> Retire os resíduos com uma pipeta de transferência, e avaliar a qualidade dos ovos: ovos de alta qualidade são geralmente marcadas por uma clara separação entre o hemisfério animais mais pigmentadas eo hemisfério vegetal levemente colorido e tem o maior contraste-escuro a luz. Descarte com uma pipeta de transferência de todos os ovos que aparecem pegajoso, malhada, ou lise (branco e inchado) como eles vão diminuir a qualidade global do extrato. Se&gt; 10% dos ovos, são de fraca qualidade, a todalote deve ser descartada. </li><li> Misture os ovos em um copo de vidro de 500 ml e derramar tanto MMR quanto possível, mantendo os ovos submersos. </li><li> Lave os ovos, mexendo suavemente com o dobro do volume dos ovos de MMR. Repita duas vezes, e remover quaisquer detritos ou ovos obviamente de má qualidade. </li><li> Adicionar cerca de 100 ml de 2% de cisteína para o recipiente de vidro, agite a mistura, e permitir que os ovos que se contentar com 5 min a 16 ° C. Decantar a cisteína. NOTA: Dejellying é marcado pelo aparecimento gradual de camadas de geléia flutuam acima dos ovos e embalagem mais compacta dos ovos como eles agora ocupam um volume menor, sem o casaco de geléia. </li><li> Adicionar mais 100 ml de 2% cisteína, agite bem, espere 5 minutos, e em seguida despeje lentamente ao largo da cisteína. Repetir até que os ovos tornaram-se bem compactado (usualmente por tratamento terceira cisteína). Nota: Se os ovos são deixados demasiado tempo em cisteína, que são propensos a lise. Da mesma forma, os ovos dejellied são frágeis e propensos a lise mecânica sesão rodadas com muita força ou se eles são expostos ao ar. Uma vez que os ovos foram dejellied, é importante que prossiga rapidamente para os passos de centrifugação. </li><li> Deitar fora cisteína, e enxaguar o casaco geléia e outros detritos, lavando suavemente ovos em 1x MMR. Decantar cuidadosamente tampão ao longo do lado do recipiente. Repita duas vezes ou até que a solução MMR não é mais nublado. Ao lavar com MMR 1x continuar a remover os ovos más usando uma pipeta de transferência. </li><li> Realizar um enxágüe final suave com 30 ml 0,1 x MMR, e gentilmente despeje o máximo de buffer possível. Mais uma vez, retire todos os ovos obviamente ruins. </li></ol></li><li> Embalagem e Crushing ovos por centrifugação NOTA: O extracto descrito abaixo, que é usada para a degradação β-catenina é uma variante do factor de extracto citostático (metafase II-presos). Em contraste com o extracto de baixa velocidade e alta velocidade usada para estudos do ciclo celular, extracto de velocidade intermédia funciona melhor para a degradação β-catenina. Euextrato nterphase promove semelhante degradação β-catenina robusto, embora seja mais trabalhoso para se preparar. <ol><li> Adicionar leupeptina, pepstatina, aprotinina mistura (LPA, um inibidor da protease) a 10 ug / ml (diluído a partir de uma solução 10 mg / ml em DMSO) e citocalasina D em 20 ug / ml (diluído a partir de uma solução estoque de 10 mg / ml em DMSO) para os restantes 20 ml de 0,1 x MMR. </li><li> Adicionar a 0. X MMR contendo LPA e citocalasina D para os ovos lavados, agite bem, e incubar por 5 min a 16 ° C. </li><li> Transferir os ovos para 16 ° C previamente arrefecidos 50 ml de tubos de centrífuga, permita que os ovos de resolver, e remover o tampão residual a partir do topo. Para evitar a exposição ao ar, retiram uma pequena quantidade de solução tampão para a pipeta de transferência antes de retirar os ovos para transferência. Continuar a transferir os ovos adicionais para os tubos de centrifugação e remover o tampão residual a partir do topo do tubo até que os ovos de encher o tubo da centrífuga para o topo, o que vai maximizar o rendimento deextrair. </li><li> Para embalar os ovos, tubos de centrifugação de centrifugação a 400 xg durante 60 seg a 4 ° C utilizando um rotor de ângulo fixo. Remover o tampão residual a partir do topo dos tubos de centrífuga. </li><li> Para a rotação de esmagamento, girar tubos a 15.000 xg durante 5 min a 4 ° C. </li></ol></li><li> Coleta camada citoplasmática de Extrato NOTA: O método descrito abaixo difere do método clássico de perfurar a parede do tubo da centrífuga de forma a recolher o citoplasma. Este protocolo foi adaptado para a simplificação e para utilização com determinados tubos de centrifugação, que são reutilizáveis. Não houve diferenças perceptíveis na cinética de degradação β-catenina encontram-se com qualquer um dos métodos. Neste ponto extracto deve ser mantido frio durante todo o processo, e todos os passos devem ser realizados a 4 ° C. <ol><li> Limpar um buraco na camada lipídica utilizando P1000 ponta da pipeta. </li><li> Recolher a fase citoplasmática (entre a camada pigmentada escura ea light camada lipídica), utilizando uma nova ponta de pipeta P1000 em tubos de centrífuga limpas pré-refrigeradas (Figura 1). Para o extrato de alta qualidade que robustamente degrada β-catenina, minimizar a quantidade de camada pigmentada e lipídica que é retirado com a camada citoplasmática. </li><li> Rotação extraída citoplasma a 15.000 xg durante 10 min a 4 ° C e novamente recolher o citoplasma. Repita a rotação e extração 1X. NOTA: O extrato deve ser &quot;cor de palha&quot;. Se há contaminação substancial com as camadas pigmentadas e lipídicas, neste ponto, pode-se repetir a rotação mais uma vez, embora rotações excessivo irá diminuir a capacidade do extracto para degradar β-catenina. </li><li> Adicionar LPA e citocalasina D para o extracto a concentrações finais de 10 ug / ml cada. NOTA: Usando o método descrito proporciona uma concentração razoavelmente consistente de proteína total de cerca de 50 mg / ml (52,41 ± 5,40 mg / ml, n = 3), em preparações separadas, por exemplo Xenopusextractos de g. </li><li> (Opcional) para ensaios de tradução, adicionar tampado mRNA (0,1 mg / ml), RNAsin (1,5 U / ml), e mix de regeneração de energia (2.2.1) e incubar a reação à temperatura ambiente por 2 horas (para mais informações consulte sálica et ai. 2 e Sive et ai. 33). Use extrato traduzido imediatamente para ensaios de degradação β-catenina ou snap-congelamento em nitrogênio líquido para uso posterior. NOTA: extrato recentemente preparado tem uma alta capacidade de traduzir mRNA adicionado exogenamente, mas, infelizmente, essa capacidade se perde uma vez que o extrato é congelado. Tampado ARNm podem ser facilmente preparados utilizando kits disponíveis comercialmente. </li><li> Extrato Snap-congelamento em nitrogênio líquido. NOTA: Os extratos são armazenados em pequenas (200 mL) alíquotas para uso único, porque eles perdem rapidamente sua capacidade de degradar β-catenina se novamente congelados. Para armazenamento a longo prazo, o extracto pode ser armazenado em azoto líquido. Para armazenagem a curto prazo, o extracto pode ser armazenada a -80 ° C, embora a capacidade de of extracto de degradar β-catenina pode ser reduzido drasticamente com o armazenamento prolongado à temperatura de -80 ° C (mais de 2 meses). </li></ol></li></ol> 2. Preparando Extrato para β-catenina Degradação Assay <ol><li> Esgotamento de Extrato Xenopus Observação: Uma grande vantagem do extracto de Xenopus é a capacidade para esgotar rapidamente os componentes de uma via e precisamente adicionar novamente uma quantidade definida de uma proteína, a fim de determinar os seus efeitos dependentes da dose. <ol><li> Use preparada na hora extrato do ovo de Xenopus ou rapidamente descongelar extrato congelado e colocar no gelo. Realize todas as manipulações no frio. </li><li> Adicionar extracto para 1/10 do volume de anticorpo peletizada ou grânulos de afinidade (por exemplo, 20 ml de esferas sedimentadas a 200 ml de extracto). De modo a minimizar a diluição do extracto, retirar o máximo de líquido a partir das esferas quanto possível, antes da adição do extracto usando pontas de carregamento de gel, com pontas afiladas longos. </li><li> Gire extrato-mistura de esferas, a 4 ° C durante 1 hora. </li><li> Rotação mistura-extracto de talão em 12.600 xg em microcentrifuga a 4 ° C durante 30 seg. Alternativamente, se as esferas magnéticas são utilizadas, aplicam-se o campo magnético para recolher as esferas. </li><li> Transferência esgotados extrato para um tubo de microcentrífuga fresco no gelo. Tenha cuidado para não transferir quaisquer contas com o extrato. </li><li> Confirme eficiência de esgotamento por immunoblotting tanto extrato empobrecido e miçangas. </li><li> Prepare extrato para ensaio de degradação β-catenina, como descrito em 2.2. </li></ol></li><li> Otimizando Xenopus Extrato para β-catenina Degradação NOTA: degradação β-catenina em Xenopus extrato do ovo é um processo dependente de energia que se esgota rapidamente os estoques de ATP endógenos. Consequentemente, um sistema de regeneração de energia é necessária para manter a degradação β-catenina robusta. <ol><li> Prepare uma mistura de 20x de regeneração de energia (ER), constituído por 150 mM fosfato de creatina, ATP 20 mM, 600 mg / ml creatinofosfoquinase,e 20 mM MgCl2. ER devem ser divididos em alíquotas e armazenado a -80 ° C. Evitar ciclos de congelamento / descongelamento repetidos usando pequenas alíquotas congeladas. </li><li> Descongelar rapidamente Xenopus extrato do ovo, esfregando o tubo congelado entre as mãos. Colocar o tubo em gelo imediatamente antes de todo o extracto tenha derretido. </li><li> Adicionar 10 ml de mistura de regeneração de energia (20x ER) em uma alíquota (200 mL) de Xenopus extrato do ovo. Misture bem por rapidamente sacudindo o tubo e pulso vórtex. Pulso-spin e coloque imediatamente em gelo. </li><li> (Opcional) O volume de β-catenina pode ser ligeiramente aumentada no extracto de ovo de Xenopus, por adição de ubiquitina (1,25 mg / ml final). Cicloheximida (0,1 mg / ml final), também pode ser adicionado para minimizar a tradução dos transcritos endógenos. </li><li> Alíquota os volumes apropriados para o ensaio de degradação em tubos de microcentrífuga de pré-arrefecidas em gelo. Para os ensaios de degradação radiomarcados β-catenina, retirar 2-5 extrair ml para cada ponto de tempo. &lt;/ Li&gt; </ol></li></ol> 3. Radiolabeled ensaio de degradação β-catenina em Xenopus extrato do ovo Nota: Todos os passos devem ser executados em gelo, a menos que indicado de outra forma. <ol><li> Preparando Radiolabeled β-catenina <ol><li> Preparar mesmo em sintetizado in vitro [35 S] metionina-proteína radiomarcada utilizando kits disponíveis comercialmente. NOTA: A geração de 35 S-marcado (semi-vida de 87 dias) as proteínas são facilmente e eficientemente produzido usando disponíveis comercialmente em kits acoplada in vitro de transcrição-tradução. É importante que a proteína traduzida é suficientemente marcado de modo que alterações no volume de proteína pode ser facilmente visualizada. </li><li> Para confirmar a marcação radioactiva bem sucedida, realizar SDS-PAGE/autoradiography com 0,5 mL da proteína traduzida. Quantificar a intensidade da banda de β-catenina radiomarcado utilizando o ImageJ, ImageQuant, ou um progr software quantitativa alternativasou. NOTA: A banda radiolabeled proteína β-catenina deve ser claramente visível no filme dentro de algumas horas (4-6 horas). </li><li> Encaixe-congelar a proteína radiomarcada em nitrogênio líquido para o armazenamento até o uso. Nota: O armazenamento prolongado (&gt; 2 meses) e múltiplos de congelação / descongelação (maior que 2) pode impactar severamente a capacidade do radiomarcado β-catenina para degradar de forma robusta em Xenopus extracto de ovo. Tipicamente, a estabilidade das proteínas radiomarcadas diminui significativamente depois de 1 mês de armazenamento à temperatura de -80 ° C; assim, relativamente recentemente preparada radiomarcado β-catenina dá melhores resultados obtidos nestes ensaios de degradação. </li></ol></li><li> Realizando β-catenina Degradação Assay <ol><li> Adicionar 1-3 ul (dependendo da potência do sinal de banda radiomarcada) in vitro traduzida β-catenina (e outras proteínas, moléculas pequenas, etc, que estão a ser testados) em 20 ul de mistura de reacção em gelo de Xenopus. Misture bem por quickly sacudindo o tubo e um curto pulso de centrifugação; este é um passo importante como Xenopus extrato do ovo é muito viscoso e mistura incompleta irá afetar a consistência dos resultados. Rotação do pulso e colocar no gelo. </li><li> Inicie o β-catenina reacção de degradação, deslocando os tubos à temperatura ambiente. </li><li> No ponto de tempo designado, remover 1-5 ml de amostra e misturar imediatamente com tampão de amostra de SDS (volume de 5x) para parar a reacção. Para garantir que a reação de degradação está completamente terminado, o tubo de filme várias vezes e vortex vigorosamente. </li><li> Realize SDS-PAGE/autoradiography. Executar 1 ml equivalentes (~ 50 mg de proteína) do extrato para cada ponto de tempo / pista. Degradação de β-catenina em Xenopus extracto de ovo deve ser evidenciado pela diminuição dependente do tempo na intensidade da radiomarcado β-catenina banda Figura 2. Quantificar os resultados utilizando o ImageJ, ImageQuant, ou outro software de imagem preferido, se necessário. </li><li> (Optional) Soak gel de SDS-poliacrilamida em solução (ácido acético a 10% e 30% de metanol, que fixa em água destilada) antes de secagem para reduzir o fundo de radioactividade e aumentar a qualidade da imagem. </li></ol></li></ol> 4. Β-catenina-luciferase Degradação Ensaio no extrato do ovo Xenopus Execute todas as etapas no gelo, salvo indicação em contrário. <ol><li> Preparação β-catenina-luciferase <ol><li> Sintetizar não-radioactivamente, marcado com luciferase β-catenina utilizando o sistema acoplado de transcrição-tradução com uma mistura de aminoácidos completa. </li><li> Confirmar produção do marcado com luciferase β-catenina pela medição da actividade da luciferase 0,5-1 ul de reacção. Avaliar fundo luminescência através da medição da luminescência de uma mistura de reacção não traduzida. NOTA: Vários kits comerciais estão disponíveis para medir a atividade de luciferase. Luminescência de longa duração, no entanto, funciona particularmente bem para o assa degradaçãoy. </li></ol></li><li> Realizando β-catenina-luciferase Degradação Ensaio <ol><li> Descongele e prepare Xenopus extrato do ovo como em 2.2. </li><li> Adicionar em traduziu-vitro fusão β-catenina-luciferase (de 4.1) para preparar mistura de reacção Xenopus (de 2,2) em gelo e misture bem como em 3.2.1. NOTA: A actividade da luciferase β-catenina, que é adicionado ao extracto é tipicamente entre 20 - 50.000 unidades de luminescência relativa (RLU) / ml de extracto (com base em medições obtidas a partir de 4.1.2). Sinal de partida deve ser de aproximadamente 100.000 RLU (2-5 ml da β-catenina-luciferase fusão in vitro-traduzido). </li><li> Deslocar o extrato de RT para iniciar a reacção de degradação. </li><li> Retirar uma aliquota da reacção no momento indicado e encaixe por congelação em azoto líquido. NOTA: As amostras triplicadas são normalmente removidas para análise em cada ponto de tempo. Extracto congelado pode ser armazenado a -80 ° C until eles estão prontos para serem analisados. </li><li> Descongelar as amostras em gelo, as amostras de transferência para placas de 96 poços brancos padrão sobre gelo, e processo para a actividade da luciferase. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Glotzer, M., Murray, A. W., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+is+degraded+by+the+ubiquitin+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cyclin is degraded by the ubiquitin pathway.</a> Nature. 349, 132-138 (1991).</li>
<li>Salic, A., Lee, E., Mayer, L., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+beta-catenin+stability%3A+reconstitution+of+the+cytoplasmic+steps+of+the+wnt+pathway+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Control of beta-catenin stability: reconstitution of the cytoplasmic steps of the wnt pathway in Xenopus egg extracts.</a> Molecular Cell. 5, 523-532 (2000).</li>
<li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Cell cycle extracts.</a> Methods in cell biology. 36, 581-605 (1991).</li>
<li>Dabauvalle, M. C., Scheer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+nuclear+pore+complexes+in+Xenopus+egg+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+cell+%2F+under+the+auspices+of+the+European+Cell+Biology+Organization%22%5BJournal%5D)">Assembly of nuclear pore complexes in Xenopus egg extract.</a> Biology of the cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 72, 25-29 (1991).</li>
<li>Tutter, A. V., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+DNA+replication+in+a+soluble+cell-free+system+derived+from+Xenopus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs.</a> Methods Mol Biol. 322, 121-137 (2006).</li>
<li>Theriot, J. A., Rosenblatt, J., Portnoy, D. A., Goldschmidt-Clermont, P. J., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+profilin+in+the+actin-based+motility+of+L.+monocytogenes+in+cells+and+in+cell-free+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Involvement of profilin in the actin-based motility of L. monocytogenes in cells and in cell-free extracts.</a> Cell. 76, 505-517 (1994).</li>
<li>Maresca, T. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+spindle+assembly+and+chromosome+condensation+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).</li>
<li>Shennan, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+egg+extracts%3A+a+model+system+to+study+proprotein+convertases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Xenopus egg extracts: a model system to study proprotein convertases.</a> Methods Mol Biol. 322, 199-212 (2006).</li>
<li>Kornbluth, S., Yang, J., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+cell+cycle+using+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cell+biology+%2F+editorial+board%2C+Juan+S.+Bonifacino+...+%5Bet+al.%5D%22%5BJournal%5D)">Analysis of the cell cycle using Xenopus egg extracts.</a> Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.]. 11, (2006).</li>
<li>Chan, R. C., Forbes, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+study+of+nuclear+assembly+and+nuclear+import+using+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).</li>
<li>Masui, Y., Markert, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+control+of+nuclear+behavior+during+meiotic+maturation+of+frog+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+zoology%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic control of nuclear behavior during meiotic maturation of frog oocytes.</a> The Journal of experimental zoology. 177, 129-145 (1971).</li>
<li>Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+formation+of+nucleus-like+structures+around+bacteriophage+DNA+microinjected+into+Xenopus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs.</a> Cell. 34, 13-23 (1983).</li>
<li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220, 719-721 (1983).</li>
<li>Newport, J. W., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+cell+cycle+during+early+Xenopus+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of the cell cycle during early Xenopus development.</a> Cell. 37, 731-742 (1984).</li>
<li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+instability+of+microtubule+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312, 237-242 (1984).</li>
<li>Blow, J. J., Laskey, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+DNA+replication+in+nuclei+and+purified+DNA+by+a+cell-free+extract+of+Xenopus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs.</a> Cell. 47, 577-587 (1986).</li>
<li>Verma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubistatins+inhibit+proteasome-dependent+degradation+by+binding+the+ubiquitin+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ubistatins inhibit proteasome-dependent degradation by binding the ubiquitin chain.</a> Science. 306, 117-120 (2004).</li>
<li>Yu, H., King, R. W., Peters, J. M., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+ubiquitin-conjugating+enzyme+involved+in+mitotic+cyclin+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel ubiquitin-conjugating enzyme involved in mitotic cyclin degradation.</a> Curr Biol. 6, 455-466 (1996).</li>
<li>Thorne, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibition+of+Wnt+signaling+through+activation+of+casein+kinase+1alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibition of Wnt signaling through activation of casein kinase 1alpha.</a> Nature Chemical Biology. 6, 829-836 (2010).</li>
<li>Thorne, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biochemical+screen+for+identification+of+small-molecule+regulators+of+the+Wnt+pathway+using+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A biochemical screen for identification of small-molecule regulators of the Wnt pathway using Xenopus egg extracts.</a> Journal of Biomolecular Screening. 16, 995-1006 (2011).</li>
<li>Hinkson, I. V., Elias, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+state+of+protein+turnover%3A+It%27s+about+time%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The dynamic state of protein turnover: It's about time.</a> Trends in Cell Biology. 21, 293-303 (2011).</li>
<li>Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+Hereditary+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lessons from Hereditary Colorectal Cancer.</a> Cell. 87, 159-170 (1996).</li>
<li>Lee, E., Salic, A., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+regulation+of+%5Bbeta%5D-catenin+stability+by+Tcf3+and+CK1epsilon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Physiological regulation of [beta]-catenin stability by Tcf3 and CK1epsilon.</a> J Cell Biol. 154, 983-993 (2001).</li>
<li>Lee, E., Salic, A., Krüger, R., Heinrich, R., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+APC+and+Axin+derived+from+experimental+and+theoretical+analysis+of+the+Wnt+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">The roles of APC and Axin derived from experimental and theoretical analysis of the Wnt pathway.</a> PLoS Biology. 1, (2003).</li>
<li>Seeling, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+beta-catenin+signaling+by+the+B56+subunit+of+protein+phosphatase+2A%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of beta-catenin signaling by the B56 subunit of protein phosphatase 2A.</a> Science. 283, 2089-2091 (1999).</li>
<li>Guger, K. A., Gumbiner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Catenin+has+Wnt-like+activity+and+mimics+the+Nieuwkoop+signaling+center+in+Xenopus+dorsal-ventral+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">beta-Catenin has Wnt-like activity and mimics the Nieuwkoop signaling center in Xenopus dorsal-ventral patterning.</a> Dev Biol. 172, 115-125 (1995).</li>
<li>Cselenyi, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRP6+transduces+a+canonical+Wnt+signal+independently+of+Axin+degradation+by+inhibiting+GSK3%27s+phosphorylation+of+%CE%B2-catenin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">LRP6 transduces a canonical Wnt signal independently of Axin degradation by inhibiting GSK3's phosphorylation of β-catenin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 8032-8037 (2008).</li>
<li>Jernigan, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gbetagamma+activates+GSK3+to+promote+LRP6-mediated+beta-catenin+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Gbetagamma activates GSK3 to promote LRP6-mediated beta-catenin transcriptional activity.</a> Science Signaling. 3, (2010).</li>
<li>Major, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wilms+tumor+suppressor+WTX+negatively+regulates+WNT%2Fbeta-catenin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Wilms tumor suppressor WTX negatively regulates WNT/beta-catenin signaling.</a> Science. 316, 1043-1046 (2007).</li>
<li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+eggs+from+Xenopus+laevis+females%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Obtaining eggs from Xenopus laevis females.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+fractionation+of+Xenopus+laevis+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation and fractionation of Xenopus laevis egg extracts.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+DNA+damage+checkpoint+using+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+Development+of+Xenopus+Laevis+%3A+A+Laboratory+Manual%22">Early Development of Xenopus Laevis : A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).</li>
<li>Rubinfeld, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+GSK3%CE%B2+to+the+APC-%CE%B2-Catenin+Complex+and+Regulation+of+Complex+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Binding of GSK3β to the APC-β-Catenin Complex and Regulation of Complex Assembly.</a> Science. 272, 1023-1026 (1996).</li>
<li>Salic, A., King, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+small+molecule+inhibitors+of+the+ubiquitin-proteasome+pathway+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Identifying small molecule inhibitors of the ubiquitin-proteasome pathway in Xenopus egg extracts.</a> Methods in Enzymology. 399, 567-585 (2005).</li>
<li>Trinkle-Mulcahy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+specific+protein+interaction+partners+using+quantitative+mass+spectrometry+and+bead+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes.</a> J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).</li>
<li>Tan, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signalling+pathway+parameters+for+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Wnt signalling pathway parameters for mammalian cells.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Xenopus extrato do ovo é um sistema bioquímico robusta para investigar rotatividade β-catenina. A concentração de β-catenina no Xenopus extracto de ovo é de ~ 25 nM 2. Sob condições ideais, o extracto de ovo é capaz de degradar β-catenina, a uma taxa de 50-100 nM / h e é metade do máximo a 200 nm 24. Há vários passos críticos para a reconstituição bem sucedida de degradação β-catenina usando Xenopus extrato do ovo. Estes incluem: 1) a geração de alta qualidade Xenopus...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/51425">Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract</a>. At the time of publication there were some instances where an incorrect volume notation was used. These instances were corrected from:
2.1.2. Add extract to 1/10 the volume of pelleted antibody or affinity beads (e.g., 20 ml pelleted beads to 200 ml extract). In order to minimize dilution of the extract, withdraw as much liquid from the beads as possible before addition of the extract using gel loading tips with long, tapered tips.
2.2.5. Aliquot the appropriate volumes for degradation assay into pre-chilled microfuge tubes on ice. For radiolabeled &#946;-catenin degradation assays, withdraw 2-5 ml extract for each time point.
3.2.3. At the designated time point, remove 1-5 ml of the sample and mix immediately with SDS sample buffer (5x volume) to stop the reaction. To make sure the degradation reaction is completely terminated, flick tube several times and vortex vigorously.
3.2.4. Perform SDS-PAGE/autoradiography. Run 1 ml equivalents (~50 mg of protein) of the extract for each time point/lane. Degradation of &#946;-catenin in Xenopus egg extract should be evidenced by the time-dependent decrease in intensity of the radiolabeled &#946;-catenin band Figure 2. Quantify results using ImageJ, ImageQuant, or other preferred imaging software if necessary.
4.2.2. Add in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion (from 4.1) into prepared Xenopus reaction mix (from 2.2) on ice and mix well as in 3.2.1. NOTE: The activity of the &#946;-catenin luciferase that is added to the extract is typically between 20 - 50,000 relative luminescence units (RLU)/ml of extract (based on measurements obtained from 4.1.2). Starting signal should be approximately 100,000 RLU (2-5 ml of the in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion).
to:
2.1.2. Add extract to 1/10 the volume of pelleted antibody or affinity beads (e.g., 20 &#181;l pelleted beads to 200 &#181;l extract). In order to minimize dilution of the extract, withdraw as much liquid from the beads as possible before addition of the extract using gel loading tips with long, tapered tips.
2.2.5. Aliquot the appropriate volumes for degradation assay into pre-chilled microfuge tubes on ice. For radiolabeled &#946;-catenin degradation assays, withdraw 2-5 &#181;l extract for each time point.
3.2.3. At the designated time point, remove 1-5 &#181;l of the sample and mix immediately with SDS sample buffer (5x volume) to stop the reaction. To make sure the degradation reaction is completely terminated, flick tube several times and vortex vigorously.
3.2.4. Perform SDS-PAGE/autoradiography. Run 1 &#181;l equivalents (~50 mg of protein) of the extract for each time point/lane. Degradation of &#946;-catenin in Xenopus egg extract should be evidenced by the time-dependent decrease in intensity of the radiolabeled &#946;-catenin band Figure 2. Quantify results using ImageJ, ImageQuant, or other preferred imaging software if necessary.
4.2.2. Add in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion (from 4.1) into prepared Xenopus reaction mix (from 2.2) on ice and mix well as in 3.2.1. NOTE: The activity of the &#946;-catenin luciferase that is added to the extract is typically between 20 - 50,000 relative luminescence units (RLU)/&#181;l of extract (based on measurements obtained from 4.1.2). Starting signal should be approximately 100,000 RLU (2-5 &#181;l of the in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion).

Erratum: Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis extrato do ovo tem sido amplamente utilizado para estudar muitos processos biológicos celulares, incluindo a dinâmica do citoesqueleto, montagem e importação nuclear, apoptose, metabolismo ubiquitina, a progressão do ciclo celular, transdução de sinal, e turnover de proteína 1-17. O sistema de extrato de ovos de Xenopus é passível de análise bioquímica de uma legião de processos celulares porque extrato do ovo representa essencialmente citoplasma não diluído que contém todos os componentes citoplasmáticos essenciais necessários para executar esses processos e permitir investigação. Grandes quantidades de extracto de ovo, podem ser preparados ao mesmo tempo para manipulações bioquímicas que requerem grandes quantidades de material (por exemplo, a purificação de proteínas ou de triagem de alto rendimento) 18-20. Outra vantagem é que a concentração de proteínas específicas em Xenopus extracto de ovo pode ser ajustada com precisão por adição de proteína recombinante e / ou de imunodepleção endogproteínas enous em contraste com a transfecção do plasmídeo de DNA em que a expressão da proteína de interesse é difícil de controlar. Além disso, a ausência de proteínas recombinantes disponíveis pode ser eliminada pela adição de transcritos que codificam a proteína de interesse, tomando vantagem da elevada capacidade do extracto de ovo de Xenopus recentemente preparada para traduzir o mRNA exogenamente adicionado. A regulação da degradação de proteínas é fundamental para o controle de muitas vias celulares e processa 21. Xenopus extrato do ovo tem sido amplamente utilizado para estudar a degradação de proteínas como o sistema permite várias maneiras de monitorar turnover de proteína, sem influências de confusão de transcrição e tradução. A via de sinalização Wnt é uma via de sinalização altamente conservada, que desempenha um papel crítico no desenvolvimento e na doença. O volume de negócios de β-catenina, o principal efetor da via Wnt, é altamente regulado, e um aumento do estado de equilíbrio level de β-catenina é fundamental para a ativação de genes alvo de Wnt. A importância da degradação β-catenina é realçada pelo facto de que as mutações na via de Wnt que inibem a degradação β-catenina em ~ 90% de todos os casos esporádicos de cancro colorrectal 22. degradação β-catenina por componentes da via Wnt podem ser fielmente recapitulado em Xenopus extracto de ovo para estudar o mecanismo da sua rotação, assim como para identificar novos moduladores de pequenas molécula do seu degradação 2, 19, 20, 23-29. Os métodos para a preparação do extracto de ovo de Xenopus para o estudo do ciclo celular têm sido descritos nas publicações anteriores JoVE 30-32. O actual protocolo descreve uma modificação destes métodos e é optimizado para a degradação de [35 S]-radiomarcado β-catenina e marcaram-luciferase β-catenina emExtrato de ovos de Xenopus. O ensaio de degradação radiolabeled permite a visualização direta dos níveis de proteína através de auto-radiografia. [35 S]-metionina incorporada na proteína de interesse, utilizando uma reacção de tradução in vitro, que pode então ser directamente adicionado a uma reacção de degradação. Além disso, o ensaio de retorno da proteína marcada radioactivamente não requer um anticorpo contra a proteína de interesse ou um epitopo marcador, o qual pode influenciar a estabilidade da proteína. Porque até mesmo pequenas mudanças nos níveis de proteína, como reflectida em alterações na intensidade da banda de proteína marcada radioactivamente, são prontamente visualizados por auto-radiografia, o [35 S]-radiomarcado ensaio de degradação representa um método muito útil para a visualização da proteína volume 2. Fusão de β-catenina a luciferase de vaga-lume (adiante designado simplesmente como &quot;luciferase&quot;) permite medições quantitativas precisas e fáceis de níveis de proteína, a fimpara determinar as propriedades cinéticas de rotação β-catenina 19, 20. Uma grande vantagem do ensaio de luciferase é que ela proporciona um sistema forte quantitativa que pode ser facilmente dimensionada para cima. O protocolo seguinte fornece métodos simples para ensaiar a degradação β-catenina e um método robusto e eficiente, e eficaz para o rastreio de alto rendimento de novos moduladores β-catenina.

<table><tbody><tr><td>Gonadotrofina sérica de égua grávida (PMSG)</td><td>ProSpec</td><td>hor-272-A</td><td>Reconstituída com água destilada antes do uso.&nbsp;</td></tr><tr><td>Gonadotrofina coriônica humana</td><td>Sigma</td><td>CG10-10VL</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Fisher</td><td>BP366-1</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Research Products International</td><td>S23020-5000.0</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Fisher</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Acros Organics</td><td>AC42352-5000</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Cisteína</td><td>Acros Organics</td><td>AC17360-1000</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptina</td><td>Sigma</td><td>L2884-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinina</td><td>Sigma</td><td>A1153-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Pestatina</td><td>Sigma</td><td>P4265-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Citocalasina B</td><td>Sigma</td><td>C8273-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 3 ml: Ponta Luer Lock</td><td>Becton Agulha Dickinson</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>27 G</td><td>Becton Dickinson</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>microplaca de poliestireno branco sólido de 96 poços, fundo redondo</td><td>Corning</td><td>3605</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de ensaio de luciferase Steady-Glo</td><td>Promega</td><td>E2520</td><td>Armazene a longo prazo a -80 &deg; C, pode armazenar por até 1 mês a -20 graus; C</td></tr><tr><td>TNT Sp6 sistema de lisado de reticulócitos acoplado</td><td>Promega</td><td>L4600</td><td></td></tr><tr><td>TNT Sp6 sistema de expressão de proteína de gérmen de trigo de alto rendimento</td><td>Promega</td><td>L3260</td><td>Geralmente maior rendimento do que lisado de reticulócitos&nbsp;</td></tr><tr><td>Mistura de rotulagem de proteínas EasyTag Express [S35]</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG772007MC</td><td></td></tr><tr><td>Creatina fosfato</td><td>Sigma</td><td>27920-5G</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A2383-5G</td><td></td></tr><tr><td>Creatina fosfoquinase</td><td>Sigma</td><td>C3755-35KU</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D8418-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Sistema</td> <td>de ensaio de luciferase Dual-GloPromega</td><td>E2920</td><td>Mesmas condições de armazenamento que Steady-Glo</td></tr><tr><td>50 ml Tubos de centrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>0556214D</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall SS-34 rotor de ângulo fixo</td><td>Thermo Scientific</td><td>28020</td><td></td></tr><tr><td>115 V 50/60 Hz Minicentrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-090-128</td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine Sp6 kit</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Anti-vaga-lume anticorpo luciferase</td><td>Abcam</td><td>ab16466</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GSK3</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610201</td><td></td></tr><tr><td>FLUOStar Optima</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC-6 Plus centrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16 &deg; C Incubadora</td><td>Percival Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

reconstituição de β-catenina degradação na<em&gt; xenopus</em&gt; extrato de ovo

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis extracto de ovo é, um sistema robusto bem caracterizado para estudar a bioquímica de diversos processos celulares. Xenopus extracto de ovo foi utilizada para estudar a rotatividade de proteínas, em muitos contextos celulares, incluindo o ciclo de célula e de transdução de sinal de caminhos 1-3. Aqui, é descrito um método para o isolamento de Xenopus extracto de ovo que foi optimizada para promover a degradação do componente da via Wnt crítico, β-catenina. Dois métodos diferentes são descritas para avaliar a degradação das proteínas β-catenina no Xenopus extracto de ovo. Um método é visualmente informativo ([35 S]-radiomarcado proteínas), enquanto o outro é mais facilmente dimensionado para ensaios de elevado rendimento (firefly proteínas de fusão de luciferase-marcada). As técnicas descritas podem ser utilizadas para, mas não estão limitados a, avaliar retorno da proteína β-catenina e identificar componentes moleculares que contribuem para a sua rotação. Além disso, a capacidade para purificar grandes quantidades de extracto de ovo de Xenopus homogénea combinada com a leitura quantitativa e fácil de proteínas marcadas-luciferase permite que este sistema possa ser facilmente adaptado para o rastreio de alto rendimento para moduladores da degradação β-catenina.

Um esquema de degradação β-catenina no Xenopus extracto de ovo é mostrado na Figura 2A. 35S-marcado β-catenina foi incubada em Xenopus extracto de ovo, aliquotas (1 ml de extracto equivalente) foram removidos em tempos apropriados, e as amostras foram submetidas a SDS-PAGE seguido por autorradiografia. degradação β-catenina por componentes da via Wnt é mediada pelo sistema de ubiquitina-proteassoma 2, e a degradação de [35 S]-radiomarcado β-catenina em ...

Um método é descrito para a análise de degradação de proteínas utilizando radiolabeled e proteínas luciferase de fusão em Xenopus extrato do ovo e sua adaptação para high-throughput screening para modulares de degradação de proteínas.

Reconstituição de β-catenina degradação na<em&gt; Xenopus</em&gt; Extrato de ovo

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

O objetivo geral do experimento a seguir é utilizar o sistema bioquímico livre de células com extrato de ovo de Xenopus para analisar a degradação da beta-catenina. Isso é realizado primeiramente adicionando e/ou esgotando efetores suspeitos ao extrato de ovo Xip ativado, a fim de identificar moduladores da degradação da beta-catenina. Como segundo passo, beta-catenina exógena, transcrita e traduzida in vitro, marcada radioativamente com S 35 ou fundida à luciferase, é adicionada ao extrato de ovo XUS, no qual é ativamente degradada sob condições nativas. Em seguida, coletam-se pontos temporais para avaliar as alterações nos níveis da proteína beta-catenina ao longo do tempo.Os resultados obtidos mostram se uma modulação específica do extrato de ovo de xenopus aumenta ou diminui as taxas de beta catenina e degradação com base na auto-radiografia e/ou detecção de luminescência. A vantagem desta técnica em relação a outros métodos existentes, como experimentos de pulso e chaser ou chaser com ciclina em células cultivadas, é que o extrato de ovo de xenopus fornece um sistema bioquímico livre de células no qual é possível analisar a regulação proteica ao nível da proteína, e ele não po

reconstitution-of-catenin-degradation-in-xenopus-egg-extract

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Extratos de ovo cru e fracionado Xenopus pode ser usado para fornecer ingredientes para reconstituir processos celulares para análise morfológica e bioquímica. Lise de ovo e centrifugação diferencial são usados ​​para preparar o extrato bruto que, por sua vez, usado para preparar extratos fracionados e preparações de membrana de luz.

Preparação e fracionamento de Xenopus laevis Egg Extractos

Montagem membrana nuclear é um passo essencial no ciclo de divisão celular, este processo pode ser replicado no tubo de ensaio, combinando Xenopus cromatina de espermatozóides, citosol, e frações de membrana luz. Núcleos são formados completa, incluindo membranas nuclear com complexos de poros, e estes núcleos reconstituídos são capazes de processos normais de nuclear.

In Vitro Assembléia Nuclear Usando Extractos Egg fracionado Xenopus

Este protocolo de vídeo demonstra um método para a geração de...

Produção de transgênicos Xenopus laevis Por Restrição Integração Mediada por Enzima e Transplante Nuclear

Xenopus egg extracto é um sistema modelo útil para investigar o checkpoint danos no DNA. Este protocolo é para a preparação de extractos de ovos de Xenopus e os danos do ADN reagentes indutores de ponto de verificação. Estas técnicas são adaptáveis ​​a uma variedade de abordagens que danificam o ADN no estudo da sinalização checkpoint danificam o DNA.

Estudo da Checkpoint Dano ao DNA usando<em&gt; Xenopus</em&gt; Os extratos de ovos

Produção de<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Egg Extrai identificar RNAs associada aos microtúbulos

O controle da síntese proteica ocorre principalmente na etapa de iniciação da tradução, cujas deficiências estão ligadas a diversos distúrbios. Para melhor entender sua etiologia, descrevemos aqui um protocolo usando oócitos de Xenopus laevis avaliando a tradução do transcrito mos na presença de um mutante do fator de iniciação da tradução eIF4G1.

Xenopus laevis como um modelo para identificar Tradução Impairment

Os mecanismos moleculares de descondensação da cromatina mitótica altamente compactada são mal definidos. Apresentamos um ensaio livre de células baseado em aglomerados de cromatina mitótica isolados de células HeLa e extrato de ovo de Xenopus laevis que reconstitui fielmente o processo de descondensação in vitro.

A Free Cell Ensaio para estudar Chromatin descondensação no fim da mitose

Os mecanismos de escalonamento celular e intracelular permanecem indescritíveis. O uso de extratos de embriões de Xenopus tem se tornado cada vez mais comum para elucidar mecanismos de regulação do tamanho das organelas. Este método descreve a preparação do extrato de embrião e um novo ensaio de escala nuclear através do qual os mecanismos de regulação do tamanho nuclear podem ser identificados.

Um ensaio-Free Cell Usando<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryo Extrai para estudar mecanismos de regulação Tamanho Nuclear

Proteínas, muitas vezes contêm vários domínios que podem exercer diferentes funções celulares. Gene knock-out (KO) não consideram essa diversidade funcional. Aqui, relatamos uma abordagem de estrutura-função com base na troca de cassete mediada por recombinação (RMCE) em KO células estaminais embrionárias que permite a dissecação molecular de vários domínios funcionais ou variantes de uma proteína.

Estudos de estrutura-função em células estaminais embrionárias Rato Usando recombinase mediada por troca cassete

Nós apresentamos um método para a geração de em vitro auto-sustentado mitótica oscilações no nível de célula única encapsulando extratos de ovos de Xenopus laevis em microemulsões de água em óleo.

Reconstituição das oscilações do ciclo celular em microemulsões dos extratos de ovo sem célula Xenopus

Descrevemos um método para a preparação e imagem ao vivo de extratos citoplasmáticos não diluídos de ovos de Xenopus laevis .

Xenopus laevis Preparação de extrato de ovo e métodos de imagem vivos para visualização da organização citoplasmática dinâmica

Aprenda a reconstituir a degradação de β-catenina usando extrato de ovo de Xenopus. Este método permite analisar a dinâmica de turnover proteico e identificar moduladores em sistema bioquímico livre de células.

Reconstituição de β-catenina degradação na

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