Reconstituição de β-catenina degradação na Xenopus Extrato de ovo

Um método é descrito para a análise de degradação de proteínas utilizando radiolabeled e proteínas luciferase de fusão em Xenopus extrato do ovo e sua adaptação para high-throughput screening para modulares de degradação de proteínas.

O objetivo geral do experimento a seguir é usar o sistema bioquímico de extrato de ovo de xenopus sem células para analisar a beta-catina na rotatividade. Isso é conseguido primeiro adicionando e/ou esgotando efetores suspeitos ao extrato de ovo xip ativado, a fim de identificar moduladores da renovação da beta-catenina como uma segunda etapa exógena in vitro, transcrita e traduzida beta-catenina, seja radiomarcada com S 35 ou fundida com luciferase é adicionada ao extrato de ovo XUS, que é ativamente degradado em condições nativas. Em seguida, colete pontos de tempo para avaliar as mudanças nos níveis de beta-katina e proteína ao longo do tempo.

São obtidos resultados que mostram se uma modulação específica do extrato de ovo de xenopus aumenta ou diminui as taxas de beta catina e degradação com base na auto-radiografia e/ou detecção de luminescência. A vantagem dessa técnica sobre outros métodos existentes, como experimentos de perseguição de pulso ou perseguição de heide de ciclo em células cultivadas, é que o extrato de ovo de xenopus fornece um sistema bioquímico livre de células no qual se pode analisar a regulação de proteínas no nível da proteína e não tem a complexidade adicional da transcrição ativa. Este método pode ajudar a responder às principais questões no campo da transdução de sinal, identificando reguladores de proteínas-chave de sinalização, como beta catina.

Trabalhar com extrato de xenopus permite que o usuário esgote prontamente os componentes de uma via e adicione de volta uma quantidade definida de uma proteína. Para determinar seus efeitos dependentes da dose, use extrato de ovo XUS recém-preparado ou descongele rapidamente, extrato congelado e coloque no gelo. Execute todas as manipulações no frio, prepare anticorpos peletizados ou grânulos de afinidade em um décimo do volume do extrato para minimizar a diluição do extrato, retire o máximo de líquido possível dos grânulos antes da adição do extrato.

Usando pontas de carregamento de gel com extremidades longas e cônicas, aqui o extrato é adicionado à resina de ligação GST. Gire a mistura de extrato a quatro graus Celsius por uma hora. Em seguida, gire a mistura de extrato a 12.600 Gs em uma micro fuga a quatro graus Celsius por 30 segundos.

Tomando cuidado para não transferir contas com o extrato. Transfira o extrato esgotado para um novo tubo de micro fuga no gelo. Confirme a eficiência da depleção por immuno blotting, tanto o extrato empobrecido quanto as contas.

Como o T e a degradação dependem da energia, eles esgotam rapidamente os estoques endógenos de A TP. Consequentemente, para manter a degradação robusta do T, você deve usar uma mistura de regeneração de energia. Prepare uma regeneração de energia 20x ou mistura de ER, conforme detalhado no protocolo de texto.

Descongele rapidamente o extrato de ovo opus esfregando o tubo congelado entre as mãos. Coloque o tubo no gelo antes de todo o extrato derreter. Adicione 10 microlitros de regeneração de energia.

Misture até formar uma alíquota de extrato de ovo de xenopus. Misture bem sacudindo rapidamente o tubo e pulse o vórtice de pulso girando o pulso e coloque imediatamente no gelo. Alíquota dos volumes apropriados para o ensaio de degradação em microtubos pré-resfriados sobre gelo.

Para se preparar para os ensaios de beta-katina e degradação marcados com rádio, retire de dois a cinco microlitros de extrato para cada ponto de tempo para realizar o ensaio de degradação de beta-catenina marcada com rádio no extrato de ovo XUS. Primeiro, prepare a betacatenina marcada com rádio conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, adicione um a três microlitros de beta-catenina traduzida in vitro a 20 microlitros de xip reação, misture bem na mistura de gelo por um rápido movimento do tubo e um pulso curto de vórtice.

Este é um passo importante. Um extrato de ovo XUS é muito viscoso e a mistura incompleta afetará a consistência dos resultados pulsar, girar e colocar no gelo. Inicie a reação de degradação da beta-catenina deslocando os tubos para a temperatura ambiente no ponto de tempo designado.

Remova de um a cinco microlitros da amostra e misture imediatamente com um volume de cinco vezes de tampão de amostra SDS para interromper a reação e garantir que a reação de degradação seja completamente encerrada. Agite o tubo várias vezes e vortex vigorosamente para executar a página SDS. A auto-radiografia executa uma equivalência de microlitro do extrato para cada ponto de tempo por pista.

Os resultados podem ser quantificados usando imagem, J image quant ou outro software de imagem preferido. A degradação da beta-catenina no extrato de ovo de xap deve ser evidenciada pela diminuição dependente do tempo na intensidade do beta kaine marcado com rádio na banda. Para preparar a luciferase beta-catenina, sintetize a beta-catenina marcada com luciferase não radiomarcada.

Usando o sistema acoplado de tradução de transcrição com mistura completa de aminoácidos. Confirme a produção da beta-catenina marcada com luciferase medindo a atividade da luciferase de 0,5 a um microlitro da reação. Avalie a luminescência de fundo medindo a luminescência de uma mistura de reação não traduzida para realizar o ensaio de degradação da luciferase da beta-catina Primeiro, descongele e prepare o extrato de ovo de xenopus como antes.

Em seguida, adicione a fusão de beta-catina e luciferase traduzida in vitro na reação xip preparada. Misture no gelo e misture bem. Como antes, mude o extrato para a temperatura ambiente para iniciar a reação de degradação.

Remover uma alíquota da reacção no momento indicado e congelar com azoto líquido. Remover amostras triplicadas para análise em cada ponto de tempo. O extrato congelado pode ser armazenado a 80 graus Celsius negativos até que esteja pronto para ser analisado.

Descongele as amostras no gelo e transfira-as para placas brancas padrão de 96 poços no gelo antes do processamento. Para a atividade da luciferase, a degradação dependente de GSK três da betacatenina GS GSK pode ser prontamente demonstrada de várias maneiras usando o extrato de ovo XUS. A degradação da beta-catenina marcada com rádio S 35 no extrato XUS é inibida pela adição do inibidor de proteassoma MG 1 32.

O mutante beta-catenina é estabilizado no extrato de ovo XUS em relação à betaína do tipo selvagem e os inibidores de proteína da GSK três inibem de forma semelhante a degradação da beta-catenina. Finalmente, a depleção de GSK três do extrato de ovo xip inibe a degradação da beta-catenina pode ser resgatada pela adição de GSK três exógena. O ensaio de degradação da beta-catenina luciferase no extrato de ovo xip foi usado para avaliar a degradação da beta katina e da luciferase.

A taxa de degradação da beta-catatina e da luciferase é semelhante à proteína beta-catenina não marcada. A regulação da degradação para a fusão da beta katina e da luciferase é essencialmente idêntica à proteína de não fusão. Como a adição de cloreto de lítio resultou na inibição da beta catina e luciferase, alterações no sinal radioativo da beta catina.

A proteína luciferase é paralela às mudanças na atividade enzimática da luciferase ao longo do tempo ao tentar este procedimento. É importante manter todos os reagentes no gelo e misturar bem as reações antes de tentar este ensaio. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como identificar reguladores e analisar a beta-catina e a renovação usando o sistema de extrato de ovo de xenopus sem células.