A pele completa Defeito Modelo Estudar a vascularização de Biomateriais In Vivo

O objetivo geral deste procedimento é visualizar vasos sanguíneos em construções de engenharia de tecidos. Isso é feito criando um defeito de pele completo padronizado nas costas dos camundongos. Em seguida, uma amostra do material de engenharia de tecido é implantada no defeito da pele.

Então, no final do tempo de observação, o material é implantado e colocado em um dispositivo de iluminação trans. Finalmente, fotos de alta resolução da rede vascular são adquiridas com uma câmera digital padrão. Em última análise, a rede de vasos é analisada por segmentação digital e quantificação usando o software de ferramenta de ovo Vest.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como microscopia, tomografia computadorizada ou ressonância magnética, é que permite a visualização e quantificação eficazes dos processos vasculares dentro dos biomateriais, concentrando-se em todos os novos vasos funcionais. Este método pode fornecer informações sobre a vascularização de materiais de substituição dérmica. Também pode ser aplicado a outros organismos modelo ou para estudar a vascularização em outros órgãos.

Para começar, use punções de biópsia de 12 milímetros para gerar amostras de andaimes, como materiais de reposição dérmica bovina à base de colágeno cortados em pedaços de malha de tetina redonda de 14 milímetros de diâmetro para colocar sob cada andaime. Depois de anestesiar um camundongo, verificar a profundidade da anestesia com uma pitada no dedo do pé e remover o pelo traseiro de acordo com o protocolo de texto. Coloque o animal em uma posição de bruços e use uma caneta permanente de ponta fina para marcar a linha média das costas do rato.

Defina uma área de excisão que não seja muito distante para evitar que o animal remova o andaime. Usando um punção de biópsia de 10 milímetros, crie defeitos bilaterais redondos forçando cuidadosamente o punção contra a pele. Para delinear a área de excisão com fórceps, levante suavemente a pele marcada e use uma tesoura cirúrgica para fazer uma incisão ao longo do círculo marcado.

Se ocorrer sangramento, use gaze estéril para comprimir cuidadosamente a área para abrir espaço para a malha do Titanic. Estenda a separação da pele e do tecido subjacente na borda da ferida e mais dois a quatro milímetros. Coloque a malha no defeito diretamente no leito da ferida e sob as bordas da ferida.

Em seguida, coloque os andaimes diretamente sobre a malha. Use de quatro a seis nós simples para suturar o andaime, de modo que as bordas adjacentes saiam das bordas ligeiramente sobre o andaime. Em seguida, suture um curativo transparente acima dos defeitos para proteger o andaime e permitir o monitoramento da área da ferida.

Avalie diariamente o estado geral do animal através da monitorização da atividade motora, peso corporal, sinais de dor, tolerância ao penso e automutilação. Além disso, monitore a área da ferida quanto a sinais locais e sistêmicos de infecção e a posição do curativo. Depois de sacrificar o animal no momento desejado.

De acordo com o protocolo de texto, use um marcador permanente para marcar o local de excisão que inclui os andaimes. Use uma tesoura ou um bisturi para incisar a pele ao longo das linhas marcadas por meio de uma excisão romba, separe toda a pele, incluindo os andaimes e a malha do tecido subjacente, coloque um tecido esticado de cabeça para baixo em uma placa de Petri. Para visualizar a amostra, coloque-a sobre um dispositivo de iluminação trans.

No modo macro, tire fotos dos andaimes completos e áreas de tamanho igual de pele normal e armazene as imagens em formato TIFF para análise digital posterior. Depois de baixar o software ves EQ tool, abra uma imagem e selecione uma região de interesse para análise pressionando a tecla backspace. Em seguida, pressione inverter.

Para visualizar a rede vascular em branco, escolha a transformação da cartola do limiar de histerese do filtro de aprimoramento do vaso de imagem e calcule o aprimoramento do vaso em todas as etapas anteriores. Role para aumentar e diminuir o zoom da imagem. Segmente o mapa da embarcação selecionando o primeiro limite ou cobertura da embarcação para que cada pixel que seja remotamente semelhante a uma embarcação seja rotulado como uma embarcação.

Pressione calcular. Para visualizar sua seleção, selecione o segundo limite ou cobertura de plano de fundo para que apenas os pixels que são particularmente semelhantes a vasos sejam rotulados como recipientes. Para calcular o comprimento dos navios e a área total coberta por eles, clique em imagem, estatísticas de imagem e estatísticas de imagem binária.

O comprimento do vaso é melhor estimado pré-afinando a rede vascular para uma largura de pixel. Para isso, acesse filtros morfológicos de imagem e esqueletização antes do cálculo. A razão entre a área do vaso e o comprimento do vaso fornece um valor para o tamanho do vaso na região de interesse.

Se necessário, elimine artefatos selecionando apenas os vasos de interesse. Ao clicar no modo de seleção, pressione backspace para copiar os vasos selecionados em uma nova imagem. Por fim, analise a área da pele nativa sob os mesmos parâmetros de um scaffold, atribuindo um valor de 100% ao tecido nativo e relacione o scaffold a esse valor.

Por exemplo, se a porcentagem de pixels brancos for de 30% no tecido normal e 15% no andaime, isso representa uma vascularização de 50% da área total do andaime. Observe que os valores correspondem a toda a área da imagem. Portanto, é necessário corrigi-lo para a área da região selecionada conforme mostrado aqui.

Duas semanas após o implante do tecido, a iluminação trans permitiu a visualização clara de estruturas vasculares de até 30 micrômetros de largura em uma amostra de tecido total que incluía tecido nativo e andaimes implantados. Usando segmentação digital para analisar os níveis de vascularização do tecido explantado de 62,28 mais ou menos 8,6% foram observados no andaime em comparação com a pele nativa. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de criar defeitos de pele completa reproduzíveis e fixar o biomaterial de forma confiável na ferida.

Após este procedimento, o tecido expandido pode ser usado para análises posteriores, como histologia ou expressão de RNA e proteínas.