Lineage-reprogramação de células pericyte derivados do Adulto Cérebro Humano em neurônios induzidos

O objetivo geral do experimento a seguir é converter células derivadas de parasitas cerebrais humanos em neurônios induzidos. Isso é conseguido isolando e cultivando células derivadas de parasitas de espécimes cerebrais cirúrgicos. Em seguida, após a expansão, as células in vitro são imunomarcadas para marcadores parasitários, o que permite a caracterização e eventual enriquecimento adicional das células.

Em seguida, as células derivadas do parasita são transduzidas com vetores retrovirais que codificam determinantes do destino neuronal para convertê-las diretamente em neurônios induzidos. São obtidos resultados que mostram neurônios induzidos obtidos a partir de células derivadas de parasitas reprogramadas por linhagem com base na imunocoloração para o marcador neuronal beta três tubulina. A principal vantagem dessa abordagem sobre os métodos existentes, como a reprogramação de fibroblastos ou a diferenciação de células-tronco embrionárias em neurônios, é que visamos células endógenas ao cérebro, o que pode abrir caminho para a conversão direta de linhagem dentro do cérebro sem ter que transplantar as células.

O protocolo a seguir foi desenvolvido de acordo com a aprovação do Comitê de Ética da Faculdade de Medicina da LMU Munique e o consentimento informado por escrito de todos os pacientes, começando com uma nova biópsia cerebral humana. Mantenha no gelo em HBSS e montes dissocie o tecido em células únicas, transferindo-o para uma placa de Petri de 65 milímetros e, usando dois bisturis estéreis de uso único, pique-o em pedaços pequenos. Transfira o tecido para um tubo cônico de 15 mililitros e adicione três a seis mililitros de triple incubar por 15 a 30 minutos a 37 graus Celsius em banho-maria.

Após a reação de digestão, adicione um volume de meio de crescimento pré-aquecido para facilitar a associação e use uma pipeta descartável de cinco mililitros seguida de uma pipeta de pastagem de vidro para tritar suavemente a suspensão celular. Centrifugar a solução a 157 Gs durante cinco minutos. Suspender novamente o pellet em meio de cultura e transferir a cultura para um balão T 75.

Incube as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e 5% de oxigênio. Substitua metade do meio a cada três ou quatro dias até que as células atinjam a cofluência. Quando as células atingirem a cofluência, aspirar o meio de cultura e lavar com PBS à temperatura ambiente antes de adicionar três mililitros de triple.

Após uma incubação de cinco a 10 minutos a 37 graus Celsius. Bata suavemente no frasco para ajudar a levantar as células. Em seguida, adicione três volumes de meio de crescimento depois de girar a suspensão e susus suspendendo as células em meio de crescimento, passe-as na proporção de um para três para obter um rendimento ideal em novos frascos de cultura T 75.

As células foram passadas até cinco vezes sem quaisquer sinais de reprogramação reduzida e o número de células endoteliais se tornará insignificante a cada passagem para realizar a imunocitoquímica semear aproximadamente 60.000 células em poli D lisina. Lamínulas de vidro revestidas em 500 microlitros de meio de crescimento fresco em 24. Placas e cultura de cultura de tecidos bem.

As células por 24 horas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e 5% de oxigênio. Para análise imunoquímica das células cerebrais humanas cultivadas, remova o meio e lave três vezes com um mililitro de PBS. Adicione 500 microlitros de 4% de paraldeído em PBS e incube por 15 minutos.

À temperatura ambiente. Transfira as lamínulas de cobertura de vidro para uma câmara de coloração umidificada apropriada e adicione 80 microlitros de bloco P-B-S-B-S-A Triton X 100 por uma hora em temperatura ambiente antes de adicionar anticorpos primários diluídos na mesma solução e incubar uma hora em temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Use PBS para lavar as células três vezes antes de adicionar anticorpos secundários e incubar por uma hora em temperatura ambiente.

Após lavar três vezes, aplique o meio anti-desbotamento e monte as lamínulas. Use epifluorescência ou microscopia confocal para analisar as amostras. Siga as diretrizes locais de biossegurança ao manusear partículas retrovirais 24 horas antes da transdução retroviral da semente, aproximadamente 60.000 células no topo.

Lamínulas de vidro revestidas com poli de lisina em 500 microlitros de meio de crescimento fresco em 24. Placas de cultura de tecidos de poço e incubar a 37 graus Celsius. No dia seguinte.

Substitua o meio de crescimento por 500 microlitros de meio de crescimento fresco pré-aquecido e adicione um microlitro dos respectivos sobrenadantes concentrados contendo partículas retrovirais. Agite suavemente a placa para garantir uma distribuição uniforme das partículas virais por todo o poço. Um dia depois, remova o meio com partículas virais das células e adicione um mililitro de pré-aquecimento fresco.

B 27 conforme descrito no protocolo de texto, manter as células em cultura por quatro a oito semanas sem alterar o meio, pois isso pode prejudicar os neurônios induzidos à medida que amadurecem para demonstrar a aquisição de um fenótipo neuronal. Realize imunocitoquímica contra antígenos neuronais, como beta, três, tubulina, mapa dois e nen. Como demonstrado anteriormente neste vídeo, a imunocitoquímica realizada em culturas estabelecidas com sucesso do córtex cerebral adulto humano revela um grau considerável de heterogeneidade entre as culturas derivadas de amostras de diferentes pacientes, quantificadas por citometria de fluxo.

Há uma fração substancial de células que expressam P DG FR beta e outros marcadores parasitas, como CD 1 46, NG dois e CD 13, são expressos em níveis mais baixos. Da mesma forma, a SMA é expressa em uma subpopulação menor de células cultivadas na passagem zero, geralmente há menos de 10% das células endoteliais positivas para CD 34 e elas diminuem abaixo da detecção com mais empacotamento. Da mesma forma, os astrócitos compreendem apenas uma contaminação insignificante em passagens anteriores.

Os dados imunofitoquímicos e de citometria de fluxo são totalmente corroborados pelo R-T-P-C-R-A quantitativo. O enriquecimento adicional de células derivadas do parasita pode ser alcançado por fatos nesta fase. Isso é particularmente relevante quando a pureza da cultura está na extremidade inferior do espectro, conforme refletido pelo nível de expressão beta de P-D-G-F-R.

Assim, utilizamos um anticorpo contra P-D-G-F-R beta CD one 40 B sozinho ou em combinação com um anticorpo anti CD 1 46, excluindo quaisquer contaminantes positivos de CD 34 para classificar os fatos. Especificamente, os parasitas que transduzem essas culturas com vírus de controle não alteram seu perfil de expressão, indicando que eles permanecem na linhagem do parasita. Da mesma forma, a expressão mediada por retrovírus de SOX dois sozinha não resulta em nenhuma alteração na morfologia nem induz a expressão de tubulina beta três.

Em contraste, aproximadamente 10% das células transduzidas com um A SCL que codifica apenas o retrovírus. Exibe expressão de tubulina beta três, mas não adquire uma morfologia neuronal surpreendentemente quase 50% de todos, então dois e um SCL um berço. As células transduzidas apresentam expressão de tubulina beta três, e um terço delas também exibe processos neuronais indicando sua conversão de destino em SNP para seguir este procedimento.

Outras técnicas, como a eletrofisiologia patch ggl, podem ser empregadas para abordar questões adicionais relacionadas à maturação e funcionalidade dos neurônios induzidos.