Investigando interações proteína-proteína em células vivas usando a transferência de Bioluminescência Resonance Energy

O objetivo geral do experimento a seguir é observar a interação entre duas proteínas e células vivas cultivadas. Isso é conseguido subclonando os CDNAs para as duas proteínas de interesse em plasmídeos contendo a sequência de revestimento para luciferase ou proteína fluorescente amarela, abreviada como YFP para criar vetores para a expressão de proteínas em células de mamíferos. Como segunda etapa, os plasmídeos são transfectados em células cultivadas, o que leva à expressão das proteínas de fusão YFP e luciferase.

Em seguida, o substrato de luciferase é adicionado às células para iniciar a emissão de luz da luciferase. São obtidos resultados que mostram interação entre as duas proteínas de fusão com base na transferência de energia da LUCIFERASE para YFP. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a precipitação de coun, é que ela permite que as interações proteína-proteína sejam observadas em células vivas.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da genômica funcional, determinando se uma mutação encontrada em um paciente afeta as interações proteína-proteína. Demonstrando o primeiro passo do procedimento será RAB tric, um estudante de doutorado do meu laboratório Para começar a criar os plasmídeos conforme descrito no protocolo de texto. Estime a concentração deles com base na absorbância em 260 nanômetros.

Determine a massa molecular de cada plasmídeo multiplicando o número de pares de bases por 650.Daltons. Utilizar a concentração e a massa molecular para calcular a concentração molar de cada preparação de plasmídeos. Diluir as preparações de ADN plasmidial até uma concentração de 36 nano molar.

Estes serão os estoques de trabalho que serão usados para preparar as misturas de DNA. Para transfecção. O aspecto mais difícil desse procedimento é configurar as misturas de DNA Para garantir o sucesso, criamos planilhas para pré-calcular a quantidade correta de cada componente e tomamos muito cuidado.

Na configuração das misturas DN. Preparar a primeira mistura de ADN de controlo contendo 1800 nanogramas de plasmídeo de enchimento num volume final de 20 microlitros de água. Em seguida, configure uma segunda mistura de DNA controlada preparando cinco microlitros da construção de controle de aparência P.

Adicione plasmídeo de enchimento para trazer a massa total de DNA para 1800 nanogramas. Adicione água para trazer o volume final para 20 microlitros. Prepare uma terceira mistura de DNA de controle contendo cinco microlitros de construção de controle de aparência P e cinco microlitros de construção de controle PYFP.

Adicione plasmídeo de enchimento e água como antes. Finalmente, configure uma quarta mistura de DNA de controle contendo cinco microlitros da construção de controle positivo. Novamente, adicione enchimento, plasmídeo e água da mesma maneira.

Em seguida, prepare misturas 3D NA para testar a homodimerização de uma proteína de interesse x. Para cada mistura de DNA, combine cinco microlitros da construção de aparência P relevante e cinco microlitros da construção PYFP, adicionando plasmídeo de enchimento e água. Em seguida, prepare misturas de DNA para testar uma interação entre um par de proteínas de interesse X e Y.Para cada mistura de DNA, combine cinco microlitros da construção P relevante e cinco microlitros da construção PYFP junto com plasmídeo de enchimento e colher água subconfluente hec 2 9 3 células de um frasco de 75 centímetros quadrados diluir 10% do total de células em 13 mililitros de meio de cultura.

Em seguida, dispense 130 microlitros de suspensão celular em cada poço de uma placa de cultura de tecidos branca de fundo transparente de 96 poços antes de cultivar as células por 24 horas. Em seguida, calcule o número de poços a serem transfectados multiplicando o número de misturas de DNA por três. Prepare uma mistura principal contendo 6,3 microlitros de temperatura ambiente, meio livre de soro e 0,18 microlitros de reagente de transfecção por poço misturado por vórtice antes de incubar em temperatura ambiente por cinco minutos.

Em seguida, dispensou 20 microlitros de soro livre transfecção de meio transfecção master mix no número necessário de tubos. Adicione dois microlitros da mistura de DNA correspondente em cada tubo, incube em temperatura ambiente por 10 minutos. Finalmente, transfecte três poços com cada mistura de transfecção.

Dispensar 6,5 microlitros de mistura de transfecção por poço antes de cultivar as células por mais 36 a 48 horas. Para medir o sinal BRET. Primeiro dissolva o substrato de luciferase de células vivas a 34 miligramas por mililitro em DMSO por vórtice.

Diluir o substrato de luciferase de células vivas reconstituídas a um a 1000 em meio de diluição de substrato pré-aquecido a 37 graus Celsius. Deixe misturar 50 microlitros de meio de diluição de substrato por vórtice de poço. Um precipitado pode se formar, mas não interferirá no ensaio.

Aspire o meio de cultura da placa de 96 poços e dispense 50 microlitros de substrato de luciferase de células vivas diluídas em cada poço após a cultura das células por pelo menos duas horas. Remova a tampa da placa de 96 poços e incube a placa por 10 minutos em temperatura ambiente dentro do luminômetro. Meça a emissão de LUCIFERASE e YFP um poço de cada vez de acordo com os detalhes no protocolo de texto, integre sinais de emissão ao longo de 10 segundos.

Os membros da família Fox P de repressores transcricionais desempenham um papel no desenvolvimento do cérebro. Mutações têm sido implicadas em distúrbios do espectro da fala e do autismo. FOX P dois é conhecido por formar homodímeros para validar o ensaio de Brett para a detecção de Fox.

P duas células Homodímeros foram transfectadas com construções para expressão de luciferase como doador ou YFP como aceptor fundido a Fox P dois ou a um sinal de localização nuclear. As proteínas LUCIFERASE e YFP direcionadas ao núcleo servem como controles negativos como um controle positivo para a detecção de um Brett. As células sinalizadoras também foram transfectadas com uma construção para expressão de uma proteína de fusão YFP da luciferase.

O aumento no sinal BRET mostra que o ensaio Bret é eficaz na detecção de imagens de microscopia de fluorescência de homodímeros Fox P dois de células transfectadas com YFP fundido a um sinal de localização nuclear, ou com YFP fundido a FOX P dois são mostrados aqui. A especificidade da interação foi demonstrada pela introdução de uma mutação na FOX P dois, que é conhecida por interromper a dimerização. Quando a luciferase Fox P duas delta E 400 e YFP Fox B duas proteínas de fusão foram co-expressas.

Observou-se uma redução no sinal respiratório em comparação com quando Fox B dois e YFP Fox B dois foram co-expressos. Essa redução de sinal não foi devido a uma alteração na localização subcelular da proteína mutante para avaliar a eficácia do ensaio de Bret na detecção de interações típicas, a interação de Fox P dois com Fox P um foi testada, Um sinal de Brett foi observado em ambas as configurações possíveis do ensaio. Além disso, a adequação do ensaio de Brett ou a interação de detecção de Fox P dois com proteínas não FOX P foi testada examinando a interação com CT BP um, um co-repressor transcricional e conhecido parceiro de interação Fox P dois.

A interação Fox P dois CT BP um foi detectada pelo ensaio de Brett quando Fox P dois foi a proteína de fusão doadora e CT P um foi o aceitador, mas não na configuração reversa. A interação entre FOX P dois e CT P um foi observada, embora apenas uma pequena proporção de CT BP um estivesse localizada no núcleo, destacando a sensibilidade deste ensaio. Finalmente, o ensaio de Bret foi empregado para examinar os efeitos de mutações patogênicas em Fox P two nas interações proteína-proteína.

Foi relatado que duas mutações pontuais no Fox P dois causam um distúrbio autossômico dominante raro que afeta a fala e a linguagem. A capacidade das proteínas mutantes de dimerizar com a raposa selvagem P two foi avaliada usando o ensaio BRET. A mutação R 3 28 X, mas não a mutação R 5 53 H, interrompe a dimerização dos resultados usando a Fox B dois do tipo selvagem como doadora e a Fox B mutante dois.

Como os aceitadores são mostrados, os mesmos resultados foram observados para a configuração reversa. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como aplicar o ensaio de pão para monitorar as interações proteína-proteína. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia celular explorarem as interações proteína-proteína em células vivas.

Após este procedimento, técnicas adicionais podem ser realizadas para testar a atividade de sua proteína de interesse, a fim de avaliar as consequências funcionais de uma interação proteína-proteína observada.