Um simples e rápido protocolo para medir lipídios neutros em algas células usando fluorescência

O objetivo geral do experimento a seguir é medir o conteúdo lipídico neutro das células de algas usando corante fluorescente vermelho do Nilo. Isso é conseguido suspendendo primeiro as células em uma solução de etanol para permear a parede celular e a membrana celular. Como segunda etapa, é adicionado corante fluorescente vermelho do Nilo, que entra nas células e se acumula nas regiões não polares da célula, incluindo os corpos lipídicos neutros.

Em seguida, as amostras são expostas a uma fonte de luz de excitação de 530 nanômetros, fazendo com que o vermelho do Nilo absorvido nos corpos lipídicos neutros fluoresça a 604 nanômetros. Os resultados são obtidos em escala de massa realizando os testes individuais em um micro poço múltiplo e usando um espectrofotômetro para produzir leituras rápidas de fluorescência. As leituras mostram uma relação linear entre o conteúdo lipídico neutro das células lgal e a intensidade da medição de fluorescência.

A conversão de medições de fluorescência em teor de óleo pode ser obtida com uma curva de calibração preparada com células de composição de óleo conhecida. A principal vantagem dessa técnica em relação aos protocolos existentes, como o método gravimétrico Blyre, é que ela permite a determinação rápida do conteúdo lipídico neutro usando materiais disponíveis para a maioria dos laboratórios. Este método fornece feedback imediato sobre o desempenho do bioprocesso durante o cultivo de algas.

Além disso, o alto rendimento permitido pelo leitor de placas de 96 poços é ideal para estudos de triagem e experimentos fatoriais. Embora esta técnica tenha sido otimizada para chlorella e s Desus, ela pode ser facilmente modificada para análise de outras espécies de lgal. Okey. Para começar, remova um volume de amostra da cultura de algas em crescimento que fornecerá pelo menos 200 miligramas de biomassa seca.

400 a 600 miligramas é preferível. Centrifugue a amostra a quatro graus Celsius por 10 minutos a 10.000 vezes. G, rejeitar o sobrenadante e lavar o sedimento com um volume igual de tampão fosfato formulado com o mesmo pH que o meio de cultura.

Repita este processo para um total de três etapas de lavagem. Ressuspenda o pellet em água desionizada e transfira para um prato de pesagem pré-pesado. Deixe a amostra secar a 50 graus Celsius por 48 horas.

As culturas de algas secas podem ser armazenadas em temperatura ambiente para uso futuro. Meça aproximadamente 50 miligramas de biomassa de algas secas em um prato de soro de leite. Transfira a biomassa para uma argamassa pré-lavada com hexano, se necessário, lave o prato de soro de leite com uma pequena quantidade de hexano usando uma pipeta passada para transferir completamente a biomassa para a ordem de argamassa.

Em seguida, triture a biomassa de algas por cinco minutos usando um pilão. Comece com uma moagem suave e aumente gradualmente a intensidade. Moa a biomassa em uma pasta fina e lisa.

Durante o período de cinco minutos, adicione alguns mililitros de hexano ao almofariz e misture a pasta resultante com o pilão até homogeneizar. Certifique-se de que todos os detritos celulares aderidos às paredes da argamassa sejam soltos e suspensos no líquido. Em seguida, transfira a mistura de massa de células hexânicas para um tubo de centrífuga compatível.

Repita três a cinco vezes até que toda a biomassa tenha sido transferida para o tubo da centrífuga. Centrifugue a amostra a quatro graus Celsius por 20 minutos a 10.000 vezes. G. Após a centrifugação, pipete cuidadosamente o sobrenadante em um prato de metal pré-pesado, que pode ser armazenado na capela de exaustão.

Realize uma segunda extração de hexano adicionando três mililitros de hexano ao pellet e vortando vigorosamente. Durante um minuto, repetir a centrifugação e a transferência do sobrenadante. Determine a massa de óleo extraído gravimétrico após o hexano ter evaporado completamente.

Para a quantificação fluorométrica, preparar todas as amostras de algas com a mesma concentração de biomassa e da mesma forma que os padrões utilizados na medição. Faça isso suspendendo amostras pré-secas na quantidade apropriada de tampão fosfato. Se necessário, use um homogeneizador para facilitar a suspensão resus de células lgal secas.

Para cada amostra, misture 80 microlitros de uma solução preparada de etanol a 30%, 10 microlitros de uma solução preparada de vermelho do Nilo e 10 microlitros de suspensão de algas em um único poço de uma placa de 96 poços. Para ter devidamente em conta a variabilidade da medição de fluorescência, efectuar cinco réplicas de cada amostra. Em seguida, execute uma curva de calibração de dois pontos com padrões preparados anteriormente.

Para levar em conta as variações diárias no instrumento e a preparação para realizar as medições de fluorescência em um espectrofotômetro leitor de placas de vários poços, defina os parâmetros para agitar a 1.200 RPM e orbitar três milímetros por 30 segundos, seguido de incubação a 40 graus Celsius por 10 minutos. Outro shake a 1.200 RPM e órbita de três milímetros por 30 segundos, e para registrar fluorescência com excitação a 530 nanômetros e emissão a 604 nanômetros. Em seguida, inicie a corrida como uma etapa final.

Converta as medições de fluorescência em teor de óleo usando os resultados dos padrões internos para realizar a microscopia de fluorescência. Use a amostra preparada com a coloração vermelha do Nilo para preparar uma lâmina de microscópio da amostra de processo de acordo com os procedimentos laboratoriais padrão. Começando com o microscópio no modo de transmissão, carregue a lâmina preparada no microscópio e localize as células na ampliação desejada.

Uma vez focado, mude o microscópio do modo de transmissão para o modo de iluminação de fluorescência epi. A fonte de luz agora deve vir diretamente da lente objetiva, o que pode ser confirmado visualmente observando o espaço entre a lâmina e a lente objetiva. Insira um filtro de excitação verde na fonte de luz e um filtro de emissão vermelho no caminho da luz de observação.

A fluorescência das células coradas agora deve ser diretamente visível através da ocular. Mude o modo de observação do microscópio da ocular para a câmera montada e use o software de visualização para capturar uma imagem das células fluorescentes. As configurações específicas variam de acordo com os instrumentos, equipamentos e tipos de células.

Células de algas representativas coradas com corante vermelho do Nilo são mostradas imagens de um prothe cultivado em excesso de nitrogênio levando a um acúmulo de lipídios intracelulares muito baixo, que são mostrados em contraste com amostras de OIDs cultivados sob limitação de nitrogênio. Sob iluminação de transmissão, os corpos lipídicos das células podem ser visualizados com inspeção cuidadosa, onde aparecem como estruturas circulares brilhantes e constituem a maior parte do volume celular. As células mostradas aqui têm apenas 5% de óleo em peso seco e não contêm níveis significativos de corpos lipídicos quando mostradas as condições de luz apropriadas.

As diferenças nessas amostras são ampliadas. As células magras do óleo aparecem como anéis fluorescentes com corpos escuros, enquanto as células ricas em óleo exibem um brilho vermelho laranja brilhante onde acumularam corpos lipídicos. O vermelho do Nilo fluoresce em diferentes comprimentos de onda, dependendo da presença de lipídios neutros, fosfolipídios localizados na parede celular e proteínas celulares apolares, razão pela qual as células magras do óleo aparecem como anéis fluorescentes com corpos escuros.

Essa não especificidade também é o que causa o nível de fluorescência de fundo durante as medições do espectrofotômetro dos lipídios neutros sob as condições otimizadas do ensaio, curvas de calibração com valores quadrados de R maiores que 0,980 são facilmente alcançáveis. A relação entre o teor de óleo celular e a fluorescência torna-se não linear se as células forem coradas em uma solução, sem um solvente transportador como o etanol. Os dados aqui apresentados possuem um quadrado R de 0,395, e foram obtidos através da realização do protocolo em solução de etanol a 0%.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 15 a 20 minutos, se executada corretamente. Ao realizar este procedimento, é fundamental garantir que todas as amostras sejam preparadas na mesma concentração de biomassa. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir o conteúdo lipídico neutro das células lgal usando os protocolos tradicionais de extração de hexano e o procedimento mais simples de coloração fluorescente vermelha NAL.