Name: Um simples e rápido protocolo para medir lipídios neutros em algas células usando fluorescência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Aprenda a quantificar lipídios neutros em células de algas usando a coloração com Nile Red e espectrofotometria de fluorescência. Este protocolo rápido oferece uma alternativa eficiente aos métodos tradicionais de extração.

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Os autores gostariam de agradecer às Ciências Naturais e Conselho de Pesquisa do Canadá Engenharia para a prestação de apoio financeiro para este projeto.

1. Isolamento de seco de algas biomassa a ser utilizadas como padrões de fluorescência Leituras <ol><li> Retirar um volume de amostra a partir da cultura de crescimento de algas que vai proporcionar, pelo menos, 200 mg de biomassa seca, 400-600 mg é preferível. </li><li> Amostra Centrifugar a 4 ° C durante 10 min a 10.000 x g. Descartar o sobrenadante e lavar o sedimento com um volume igual de tampão fosfato formulado para o mesmo pH que o meio de crescimento. </li><li> Repita o passo 1.2 para um total de 3 etapas de lavagem. </li><li> Re-suspender a pelete em água desionizada e transferir para um prato pré-pesado pesar. Deixar secar a 50 ° C durante 48 hr. NOTA: A secagem sob vácuo irá diminuir o tempo de secagem e a secagem da cultura, a temperaturas acima de 50 ° C, pode tornar difícil a ressuspensão. </li><li> Armazenar seco de algas culturas à temperatura ambiente para uso futuro. </li></ol> 2. Quantificação gravimétrica de lipídios neutros por hexano Extraction (Adaptado de Bligh e Dyer 4) <ol><li> Medir aproximadamente 50 mg de biomassa algal seco em um prato de pesar. NOTA: Massas variando 40-80 mg pode ser utilizado sem perda de reprodutibilidade. </li><li> Transferir a biomassa para um almofariz pré-lavado com hexano. Se necessário, lavar a louça pesar com uma pequena quantidade (1 ml) de hexano, utilizando uma pipeta de Pasteur, a fim de transferir totalmente a biomassa para a argamassa. NOTA: Hexano é uma substância altamente volátil e tóxico. Ele deve ser tratado da coifa com roupa de proteção adequada. </li><li> Moer a biomassa de algas por 5 minutos usando um pilão. Comece com moagem suave e aumentar gradualmente a intensidade. Moer a biomassa em uma pasta fina e lisa no período de 5 min. Se o excesso de hexano é usado na transferência da biomassa para a argamassa, é melhor esperar para o hexano se evaporar antes de moagem. </li><li> Adicionar algumas ml de hexano para a argamassa e misturar a pasta resultante com o pilão até que é homogeneizada. Certifique-se que todos os restos de células aderidas às paredes da mortar são batidos livre e suspenso no líquido. </li><li> Transferir a mistura de massa de células-hexano para um tubo de centrífuga. NOTA: O tubo de centrifugação deve ser de vidro ou de um polímero adequado compatível com hexano, tais como Teflon. </li><li> Repita os passos 2.4 e 2.5, até que toda a biomassa ter sido transferida para o tubo de centrifugação (3-5x). </li><li> Centrifugar a amostra a 4 ° C durante 20 min a 10.000 x g. </li><li> Pipetar cuidadosamente o sobrenadante para um metal pré-pesado pesar prato. Guarde na coifa. </li><li> Realizar a extracção de um 2 nd hexano por adição de 3 ml de hexano para a pelota e vórtex vigorosamente durante 1 min. </li><li> Repita os passos 2.7 e 2.8. Se necessário, executar as amostras durante 30 minutos na centrífuga durante a segunda extracção para garantir todos os detritos célula resolve inteiramente. Determine a massa de óleo extraído por gravimetria após hexano tenha evaporado completamente. </li></ol> 3. Fluorometric Quantificação de lipídios neutros Usando Nilo Red (como Reported por de la Hoz Siegler et al. 11) NOTA: Apenas a 10 ul de uma suspensão de algas a 5 g / L é necessário para a leitura de fluorescência. Geralmente, o isolamento de biomassa de algas secas a partir de 1,5 ml de caldo de cultura é mais do que suficiente. Além disso, a intensidade da luz da lâmpada no espectrofotómetro podem degradar ao longo do tempo. Recomenda-se para incluir padrões em cada ensaio para garantir que as variações no instrumento não adicionar erro desnecessário para as medições. <ol><li> Prepara-se uma solução de Vermelho do Nilo, a uma concentração de 10 mg / ml dissolvidos em etanol de grau reagente álcool. Conservar a solução no escuro a 4 ° C. </li><li> Prepara-se uma solução de etanol a 30% (v / v) em água desionizada e armazenar a 4 ° C. </li><li> Preparar todas as amostras de algas com a mesma concentração da biomassa (é recomendado 5 g / L) e do mesmo modo que os padrões utilizados na medição. Faça isso por qualquer suspensão amostras pré-secas na quantidade adequadade tampão de fosfato (0,6 g / l de fosfato dibásico de potássio, 1,4 g / L fosfato de potássio monobásico), ou o ajustamento da concentração de uma cultura de crescimento de algas que 5 g / L com tampão de fosfato após a medição da turbidez. NOTA: medições realizadas em culturas de algas vivas, muitas vezes, têm maior erro que lhes estão associados, dependendo da precisão da curva de calibração de turbidez. Ressuspender as amostras secas podem requerer o uso de um homogeneizador para dispersar completamente a biomassa. </li><li> Para cada amostra, misturar 80 mL de solução de etanol a 30%, 10 ul da solução de Vermelho do Nilo, e 10 ul de suspensão de algas em um único poço de uma placa de 96 poços. A fim de justificar adequadamente a variabilidade da medição de fluorescência, realizar 5 repetições de cada amostra. </li><li> Executar uma curva de calibração de dois pontos com os padrões previamente preparados para dar conta para o dia-a-dia variações no instrumento e preparação. Prepare os padrões de medição de fluorescência usando o sprocedimento ame como as amostras. NOTA: Geralmente dois pontos é suficiente para a recalibração do instrumento, três pontos podem ser executados para verificar a linearidade. </li><li> Execute as medições de fluorescência em um multi-bem espectrofotômetro leitor de placas. As condições seguintes foram encontradas para se obter os resultados mais consistentes 11: <ol><li> Agitar a 1.200 rpm, a órbita de 3 mm durante 30 segundos. </li><li> Incubar a 40 ° C durante 10 min. </li><li> Agitar a 1.200 rpm, a órbita de 3 mm durante 30 segundos. </li><li> Fluorescência Record, excitação a 530 nm, emissão em 604 nm. </li></ol></li><li> Convertem-se as medições de fluorescência para o conteúdo de óleo, utilizando os resultados dos padrões internos. </li></ol> 4. Técnica microscopia de fluorescência NOTA: O protocolo de coloração descrito na seção 3 é projetado para a análise quantitativa, mas também pode ser útil para fornecer representações visuais de técnicas baseadas em mancha de educativo e ilustrativo purposes. Para produzir imagens de fluorescência da amostra requer um microscópio óptico com fontes de transmissão e iluminação epifluorescência adicional tradicionais. Filtros de excitação e de emissão de luz na 530 nm (verde) e 604 nm (vermelho) gama, respectivamente, são necessários para a mancha vermelha do Nilo, bem como uma câmara montada microscópio com software associado. As imagens apresentadas neste estudo (Figura 1) foram obtidas utilizando um microscópio de campo claro equipado com uma câmera e Monochrome a unidade conversor de RGB. O procedimento para a produção de imagens de fluorescência Nilo Red uso dessas ferramentas é descrito abaixo: <ol><li> Prepare uma amostra de cultura com a mancha Nilo Red acordo com a secção 3 do protocolo. NOTA: uma amostra na faixa de concentração de 5 g / L produz lâminas de densidade celular adequada, sem superlotação. </li><li> Após concluir o passo 3.6 do protocolo de coloração, preparar uma lâmina de microscópio da amostra processada de acordo com os procedimentos padrão de laboratório. </li><li> Começando com o microscópio no modo de transmissão, coloque o slide preparado para o microscópio, e localizar as células com a ampliação desejada (imagens mostradas neste artigo foram adquiridos com o objetivo 100X). </li><li> Uma vez que o foco, mudar o microscópio de transmissão para o modo de iluminação de epifluorescência. A fonte de luz deve agora ser directamente provenientes da lente objetiva (isso pode ser confirmado visualmente através da observação do espaço entre a lâmina ea lente objetiva). </li><li> Insira um filtro de excitação verde para a fonte de luz e um filtro de emissão vermelha no caminho da luz de observação; a fluorescência das células coradas deverão agora ser directamente visível através da ocular. </li><li> Mude o modo de observação do microscópio ocular para a câmera montada e usar software de visualização para capturar uma imagem das células fluorescentes. Dependendo da sensibilidade da câmera, a amostra pode não parecer inicialmente na janela de visualização (ou seja, a tela seráser preto); para remediar esta situação, ajustar o tempo de exposição e ganho da câmera para um nível em que as células são visíveis. Configurações específicas irá variar de acordo com os instrumentos, aparelhos, e tipos de células. </li></ol>

<ol><li>Chisti, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodiesel+from+microalgae%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Biodiesel from microalgae.</a> Biotechnol. Adv. 25, 294-306 (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National+Algal+Biofuels+Technology+Roadmap.+Energy+Efficiency+%26+Renewable+Energy%5BTitle%5D)+AND+%22U.S.+Department+of+Energy%2C+Office+of+Energy+Efficiency+and+Renewable+Energy%2C+Biomass+Program%22%5BJournal%5D)">National Algal Biofuels Technology Roadmap. Energy Efficiency & Renewable Energy.</a> U.S. Department of Energy, Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, Biomass Program. , Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www1.eere.energy.gov/bioenergy/pdfs/algal_biofuels_roadmap.pdf">http://www1.eere.energy.gov/bioenergy/pdfs/algal_biofuels_roadmap.pdf</a> (2010).</li>
<li>de la Hoz Siegler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+microalgal+productivity+using+an+adaptive%2C+non-linear+model+based+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresour.+Technol%22%5BJournal%5D)">Optimization of microalgal productivity using an adaptive, non-linear model based strategy.</a> Bioresour. Technol. 104, 537-546 (2012).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A Rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).</li>
<li>Hara, A., Radin, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+extraction+of+tissues+with+a+low-toxicity+solvent%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lipid extraction of tissues with a low-toxicity solvent.</a> Anal. Biochem. 90, 420-426 (1978).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+methods+used+for+microalgal+lipid-content+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Energ.+Procedia%22%5BJournal%5D)">Review of methods used for microalgal lipid-content analysis.</a> Energ. Procedia. 12, 944-950 (2011).</li>
<li>Pino, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+high+throughput+microscopic+assessment+of+fat+mass+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans.</a> J. Vis. Exp. (73), (2013).</li>
<li>Sitepu, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+high-throughput+Nile+red+fluorescence+assay+for+estimating+intracellular+lipids+in+a+variety+of+yeast+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species.</a> J. Microbiol. Meth. 91, 321-328 (2012).</li>
<li>Izard, J., Limberger, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+screening+method+for+quantitation+of+bacterial+cell+lipids+from+whole+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Rapid screening method for quantitation of bacterial cell lipids from whole cells.</a> J. Microbiol. Meth. 55, 411-418 (2003).</li>
<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+throughput+Nile+red+method+for+quantitative+measurement+of+neutral+lipids+in+microalgae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae.</a> J. Microbiol. Meth. 77, 41-47 (2009).</li>
<li>de la Hoz Siegler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+reliability+of+fluorescence-based+neutral+lipid+content+measurements+in+microalgal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Algal+Res%22%5BJournal%5D)">Improving the reliability of fluorescence-based neutral lipid content measurements in microalgal cultures.</a> Algal Res. 1, 176-184 (2012).</li>
<li>de la Jara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+determination+of+lipid+content+in+a+marine+dinoflagellate%2C+Crypthecodinium+cohnii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phycol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric determination of lipid content in a marine dinoflagellate, Crypthecodinium cohnii.</a> J. Appl. Phycol. 15, 433-438 (2003).</li>
<li>Elsey, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+measurement+of+microalgal+neutral+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Fluorescent measurement of microalgal neutral lipids.</a> J. Microbiol. Meth. 68, 639-642 (2007).</li>
<li>Feng, G. -D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+FT-IR+and+Nile+Red+methods+for+microalgal+lipid+characterization+and+biomass+composition+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresour.+Technol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of FT-IR and Nile Red methods for microalgal lipid characterization and biomass composition determination.</a> Bioresour. Technol. 128, 107-112 (2013).</li>
<li>Guzmán, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimate+by+means+of+flow+cytometry+of+variation+in+composition+of+fatty+acids+from+Tetraselmis+suecica+in+response+to+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Aquacult.+Int%22%5BJournal%5D)">Estimate by means of flow cytometry of variation in composition of fatty acids from Tetraselmis suecica in response to culture conditions.</a> Aquacult. Int. 18, 189-199 (2010).</li>
<li>Huang, G. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+screening+method+for+lipid+production+in+alga+based+on+Nile+red+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biomass+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Rapid screening method for lipid production in alga based on Nile red fluorescence.</a> Biomass Bioenerg. 33, 1386-1392 (2009).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+method+for+the+determination+of+lipid+from+the+green+alga+Botryococcus+braunii%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Tech%22%5BJournal%5D)">Rapid method for the determination of lipid from the green alga Botryococcus braunii.</a> Biotechnol. Tech. 12, 553-556 (1998).</li>
<li>Montero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+high-lipid+content+strains+of+the+marine+microalga+Tetraselmis+suecica+for+biodiesel+production+by+flow+cytometry+and+single-cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phycol%22%5BJournal%5D)">Isolation of high-lipid content strains of the marine microalga Tetraselmis suecica for biodiesel production by flow cytometry and single-cell sorting.</a> J. Appl. Phycol. 23, 1053-1057 (2011).</li>
<li>Vigeolas, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+partial+characterization+of+mutants+with+elevated+lipid+content+in+Chlorella+sorokiniana+and+Scenedesmus+obliquus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Isolation and partial characterization of mutants with elevated lipid content in Chlorella sorokiniana and Scenedesmus obliquus.</a> J. Biotechnol. 162, 3-12 (2012).</li>
<li>Bertozzini, E., et al. Application of the standard addition method for the absolute quantification of neutral lipids in microalgae using Nile red. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBertozzini%2C+E+%22J.+Microbiol.+Meth%22">J. Microbiol. Meth</a>. 87, 17-23 (2011).</li>
<li>Kou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+measurement+of+lipid+content+in+the+model+organism+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phycol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent measurement of lipid content in the model organism Chlamydomonas reinhardtii.</a> J. Appl. Phycol. , 1-9 (2013).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

As algas utilizadas na curva padrão devem ser as mesmas espécies cultivadas sob as mesmas condições experimentais, como os que estão sendo medidos. As mudanças significativas na composição do meio, a técnica de cultivo, e protocolo de coloração pode afectar a intensidade da leitura de fluorescência. Extracção com hexano (descrito nas secções 1 e 2) foi utilizado para determinar o teor de lípidos neutros de amostras usadas na curva padrão. Para as medições da intensidade de fluorescência precisos, todas as amostras devem...

Devido à sua capacidade de armazenar corpos lipídicos sob certas condições de estresse, as algas têm recebido uma grande atenção nos últimos anos como uma potencial fonte de combustível renovável 1,2. Lípidos neutros pode representar mais de 60% ​​do peso seco da célula sob condições de crescimento apropriadas 3. No entanto, a indústria não tem um protocolo padronizado simples, limpo, rápido e confiável para quantificar o conteúdo lipídico de células de algas, a fim de monitorar adequadamente o desempenho de bioprocessos, analisar as culturas, e na tela de novas linhagens. O método gravimétrico Bligh-Dyer desenvolvido há 50 anos permanece entre as técnicas mais comuns usados ​​hoje 4,5. Enquanto este processo é simples, confiável e fácil de transportar para fora, que é demorada, necessita grandes volumes de amostra, e faz uso de solventes tóxicos. Não é prático para analisar muitas amostras de uma corrida de fermentação ou a triagem para novas linhagens ricas em petróleo. Outros métodos têm been desenvolvido, mas geralmente necessitam de equipamento avançado e não foram normalizados 6. Uma alternativa que tem atraído uma grande quantidade de interesse é a mancha Nilo Vermelho. Vermelho do Nilo, um corante que fluoresce preferencialmente em ambientes não-polar, foi utilizado para identificar ou quantificar corpos de lípidos em vários organismos incluindo nemátodos 7, 8 leveduras, bactérias e algas 9, 10-19. Técnicas iniciais envolvendo Nilo Red eram na maior parte qualitativa ou semi-quantitativa, combinando a mancha com uma única tina espectrofotometria ou citometria de fluxo. Além disso, algumas classes de algas, tais como algas verdes têm poços com células de espessura, que são principalmente impermeável à do corante, que limitam o alcance da técnica 10. As recentes melhorias para o método de coloração Vermelho do Nilo foram relatados que ignorar as deficiências iniciais do protocolo 10,11. Coloração das células na presença de um carrier solvente tal como DMSO a 10 ou 10,11 etanol lineariza a relação entre o teor de óleo e de absorção, permitindo medições quantitativos fiáveis. O solvente ajuda a permeabilizar a membrana da célula de modo a que as moléculas de Nile Red pode passar. Além disso, a incorporação de um espectrofotómetro com capacidade de leitura de micro-placa permite protocolos adequados de alto rendimento para a análise quantitativa. Neste artigo, detalhe um método simples para medir o teor de óleo de células de algas por coloração de culturas com Vermelho do Nilo, na presença de etanol, um solvente leve. A fim de mais precisão representam ruído de fundo nas medições, uma curva padrão relacionando a intensidade de fluorescência para o teor de óleo é desenvolvido utilizando células de algas da composição de óleo conhecidos. O método é adaptado a partir de protocolos publicados anteriormente 10,11. Usando um espectrofotómetro de 96 poços, é capaz de analisar a mesma quantidade de amostras num tha horat levaria dias para monitorar por métodos gravimétricos. Além disso, através da calibração com amostras representativas das espécies de algas desejado este método produz medições relativamente precisas que são directamente interpretável. Existem muitos protocolos descrevendo os métodos de coloração de algas com Nile Red otimizado para diferentes cepas e aplicações; o protocolo aqui apresentado foi desenvolvido originalmente por de la Hoz Siegler et al. 11 para protothecoides Auxenochlorella, Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus e Scenedesmus oblíquo, embora seja provável adequado para muitas outras espécies e classes. Ele foi projetado com a aplicação específica de desempenho de monitoramento de bioprocessos e funciona igualmente bem para amostras previamente secas e molhadas amostras de uma crescente cultura.

<table><tbody><tr><td>Peso</td><td></td><td></td><td></td>seco</tr><tr><td>25 ml pipetas descartáveis</td><td>Fisher</td><td>13-676-10K</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Bulb</td><td>Fisher</td><td>13-681-51</td><td></td></tr><tr><td>40 ml Nalgene Teflon Tubos de centrífuga</td><td>Fisher</td><td>05-562-16A</td><td>Teflon necessário para hexano</td></tr><tr><td>Pesar pratos (polipropileno)</td> <td>Fisher</td><td>2-202B</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml microcentrífuga tubos</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Sorvall</td><td>RC6plus</td><td></td></tr><tr><td>Forno de Secagem (Fisher 625D)</td>Frascos de armazenamento <td>Fisher</td><td>13-254-2</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de armazenamento</td><td>Fisher</td><td>0337-4</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga de bancada (Eppendorf 5415D)</td><td>Fisher</td><td>05-40-100</td><td></td></tr><tr><td>Quantificação</td><td></td><td></td><td></td> gravimétrica</tr><tr><td>Argamassa de Porcelana (Coorstek)</td><td>Fisher</td><td>12-961A</td><td></td></tr><tr><td>Pilão de Porcelana (Coorstek)</td><td>Fisher</td><td>12-961-5A</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrifugação de 40 ml (FEP)</td><td>Fisher</td><td>05-562-16A</td><td>Também pode usar tubos de vidro</td></tr><tr><td>Pipetas de vidro Pasteur</td><td>Fisher</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>Pratos de pesagem de alumínio</td><td>Fisher</td><td>08-732-101</td><td></td></tr><tr><td>Hexanos</td><td>Fisher</td><td>H292-4</td><td></td></tr><tr><td>Quantificação fluorométrica do teor</td><td></td><td></td><td></td>de óleo</tr><tr><td>Leitor de placas multipoços de fluorescência</td><td>Thermo Lab Systems</td><td>Fluoroskan Ascent</td><td></td></tr><tr><td>Software leitor de fluorescência</td><td>Thermo Lab Systems</td><td>Ascent Software 2.6</td><td></td></tr><tr><td>Placa de poço COSTAR 96 com fundo redondo</td><td>Fisher</td><td>06-443-2</td><td></td></tr><tr><td>Nile Red</td><td>Sigma</td><td>N3013-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (grau de reagente de álcool)</td><td>Fisher</td><td>AC65109-0020</td><td></td></tr><tr><td>Células</td><td></td><td></td><td></td>fluorescentes de imagem</tr><tr><td>Leica DMRXA2 (ou equivalente) microscópio</td><td>Leica</td><td>DMRXA2</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas de microscópio</td><td>Fisher</td><td>12-541B</td><td></td></tr><tr><td>Câmera</td><td>Qimaging</td><td>Retiga Ex</td><td></td></tr><tr><td>Imaging software</td><td>Qimaging</td><td>QCapture v.1.1.8</td><td></td></tr></tbody></table>

um simples e rápido protocolo para medir lipídios neutros em algas células usando fluorescência

A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

As algas são consideradas excelentes candidatos para as fontes de combustível renováveis, devido às suas capacidades de armazenamento de lipídios naturais. Monitoramento robusto de processos de fermentação de algas e de triagem para novas linhagens ricas em petróleo requer um protocolo rápido e confiável para a determinação do teor de lipídios intracelulares. As práticas atuais dependem em grande parte de métodos gravimétricos para determinar o teor de óleo, técnicas desenvolvidas décadas atrás, que são demoradas e exigem grandes volumes de amostra. Neste papel, Vermelho do Nilo, um corante fluorescente que foi usado para identificar a presença de corpos de lípidos em vários tipos de organismos, é incorporado um protocolo simples, rápido e fiável para a medição do teor de lípidos neutros de protothecoides Auxenochlorella, um verde alga. O método utiliza o etanol, um solvente relativamente suave, para permeabilizar a membrana da célula, antes da coloração e uma de 96 cavidades de micro-placa para aumentar a capacidade da amostra durante as medições da intensidade de fluorescência. Ele foi projetoed com a aplicação específica do desempenho do monitoramento de bioprocessos. As amostras previamente secas ou amostras vivas de uma cultura de crescimento pode ser utilizado no ensaio.

Células de algas representativos coradas com o corante Vermelho do Nilo estão representados na Figura 1. Partes A e B da Figura imagens de A. um visor protothecoides crescido em excesso de nitrogênio, o que leva ao acúmulo de lipídios intracelulares muito baixo. Em partes C e D, as amostras de A. protothecoides cultivadas sob limitação de nitrogênio são mostradas. Sob iluminaç...

Um protocolo simples para determinar o teor de lípidos neutros de células de algas com um procedimento de coloração com Vermelho do Nilo é descrito. Esta técnica de poupança de tempo, oferece uma alternativa aos protocolos de quantificação de lípidos tradicionais à base gravimétrica. Ele foi projetado para a aplicação específica do desempenho do monitoramento de bioprocessos.

Um simples e rápido protocolo para medir lipídios neutros em algas células usando fluorescência

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

O objetivo geral do experimento a seguir é medir o teor de lipídios neutros em células de algas utilizando o corante fluorescente Nile red. Isso é realizado primeiramente suspendendo as células em uma solução de etanol para tornar permeáveis a parede celular e a membrana celular. Como segundo passo, adiciona-se o corante fluorescente Nile red, que penetra nas células e se acumula nas regiões não polares da célula, incluindo os corpúsculos de lipídios neutros.Em seguida, as amostras são expostas a uma fonte de luz de excitação de 530 nanômetros, fazendo com que o vermelho de Nilo absorvido nos corpúsculos de lipídios neutros fluoresça em 604 nanômetros. Os resultados são obtidos em larga escala realizando os testes individuais em uma placa de microplacas e utilizando um espectrofotômetro para gerar leituras rápidas de fluorescência. As leituras mostram uma relação linear entre o teor de lipídios neutros nas células de algas e a intensidade da medida de fluorescência.A conversão de medições de fluorescência em teor de óleo pode ser realizada por meio de uma curva de calibração preparada com células de composição lipídica conhecida. A principal vantagem desta técnica em relação aos pr

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Chemistry

Química

Nós introduzimos um ensaio de fluorescência baseada rápido que monitora a taxa de extinção de fluorescência como uma medida da atividade do canal gramicidin. Os canais gramicidin são usados ​​como transdutores de força molecular para monitorar as mudanças nas propriedades bicamada lipídica como sentiu por proteínas bicamada de expansão.

Gramicidina baseado em Ensaio de fluorescência; para determinar Moléculas Pequenas Potencial para Modificação de Propriedades bicamada lipídica

Este vídeo demonstra um protocolo para detectar e quantificar lipídios neutros em células de algas, colorindo-as com corante vermelho do Nilo.

Coloração com vermelho do Nilo: uma técnica para detectar e quantificar lipídios neutros intracelulares em algas

Um método para a determinação do teor de ácidos gordos e composição de microalgas baseado em ruptura mecânica da célula, a extracção de lípidos à base de solvente, a transesterificação, e quantificação e identificação de ácidos gordos por cromatografia em fase gasosa é descrito. Uma norma interna tripentadecanoin é usado para compensar as possíveis perdas durante a extração e transesterificação incompleta.

Análise do conteúdo de ácidos graxos e composição em Microalgas

O uso de fluoróforos para imagens in vivo pode ser bastante limitado por opsonização, depuração rápida, baixa sensibilidade de detecção e efeitos citotóxicos no hospedeiro. O encapsulamento de fluoróforos em lipossomas por hidratação e extrusão de filme leva à extinção e proteção de fluorescência, o que permite imagens in vivo com alta sensibilidade de detecção.

Fluorescência-têmpera de um Fluoróforo encapsulado em lipossomas Near-infrared como ferramenta para In Vivo Imageamento óptico

Descrevemos um ensaio baseado em fluorescência para medir o embaralhamento de fosfolipídios em grandes lipossomas unilamelares reconstituídos com opsina.

Um ensaio baseado em fluorescência de Fosfolípido scramblase Atividade

Aqui, descrevemos um protocolo para obter o índice de gotículas lipídicas (índice de LD) para estudar a dinâmica de triglicérides nas células cultivadas em experimentos de alta produtividade. O ensaio de índice de LD é um método fácil e confiável que usa BODIPY 493/503. Este ensaio não precisa de extração de lipídios dispendious ou análise de microscopia.

Determinação de índice de lipídios pela recuperação de fluorescência líquido no patógeno fungo Ustilago Maydis

Aqui, apresentamos um protocolo para construir laboratório-escala bolha coluna fotobiorreatores e usá-los para a cultura de microalgas. Ele também fornece um método para a determinação da taxa de crescimento da cultura e do conteúdo de lipídios neutros.

Cultivo de microalgas verdes em fotobiorreatores coluna de bolha e um ensaio para lípidos neutros

Este protocolo descreve a fabricação de lipossomas e como estes podem ser imobilizados em uma superfície e imagemindividualmente de uma forma paralela maciça usando microscopia de fluorescência. Isso permite a quantificação do tamanho e inhomogeneidade composicional entre os lipossomos únicos da população.

Um ensaio de liposcopia única baseado em microscopia quantitativa para detectar a inhomogeneidade composicional entre lipossomos individuais

Aqui, descrevemos protocolos usando sensores lipídicos fluorescentes e lipossomos para determinar se uma proteína extrai e transporta fosfatidylserina ou fosfattidylinositol 4-fosfato in vitro.

Medidas baseadas em fluorescência de fosfatidaserina/fosfattidylinositol 4-fosfato troca entre membranas

Este protocolo apresenta um método de imagem por fluorescência que utiliza uma classe de fluoróforos lipídicos sensíveis ao pH para monitorar o tráfego de membrana lipídica durante a exocitose celular e o ciclo de endocitose.

Medindo o Turnover Lipídico da Membrana com o Análogo Lipídico Fluorescente Sensível ao pH ND6

O presente protocolo descreve imagens de autofluorescência passo a passo e avaliação de alterações ficobiliproteicas em algas vermelhas com base na análise espectral. Este é um método livre de rótulos e não destrutivo para avaliar a adaptação celular a habitats extremos, quando apenas material escasso está disponível e as células crescem lentamente, ou não, em condições de laboratório.

Imagem de autofluorescência para avaliar a fisiologia das algas vermelhas

Aprenda a quantificar lipídios neutros em células de algas usando a coloração com Nile Red e espectrofotometria de fluorescência. Este protocolo rápido oferece uma alternativa eficiente aos métodos tradicionais de extração.

Um simples e rápido protocolo para medir lipídios neutros em algas células usando fluorescência

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