Isolamento de ARN a partir de pequenas não-codificante de Soro Humano

O objetivo geral deste procedimento é isolar RNA de alta qualidade de amostras de soro. Utilizando nossa versão otimizada do protocolo comum de reagente MRC try RTLS. Isso é realizado primeiramente diluindo o soro em uma proporção de um para cinco com água livre de nucleases para reduzir a contaminação por proteínas.

O segundo passo é introduzir dois tubos de bloqueio de fase de mililitro para a primeira etapa de centrifugação. Isso retém a maioria dos contaminantes, como fenol e proteínas, na fase orgânica. Em seguida, o terceiro e último passo de otimização é a centrifugação rápida a 12.000 ×g, que remove qualquer contaminação residual do pellet de RNA antes das lavagens com etanol.

O passo final é reunir duas preparações de RNA modificado do mesmo paciente, caso seja necessário um rendimento total maior de RNA. Em última análise, utilizando este método modificado, que solubiliza o soro em água livre de nucleases e emprega um tubo com trava de fase para reter os principais contaminantes, além de introduzir uma centrifugação rápida, demonstramos que é possível maximizar a recuperação de RNAs pequenos não codificantes a partir do isolamento de RNA de soro.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o protocolo padrão de isolamento de RNA triol, é que, por meio de modificações simples, podemos maximizar o rendimento de RNA a partir do soro. Geralmente, indivíduos novos nesta metodologia enfrentam dificuldades porque os RNAs pequenos estão presentes em baixas quantidades no soro. O método otimizado e a visualização dessas etapas melhorarão a recuperação desses RNAs e orientarão iniciantes para um isolamento bem-sucedido.

Para iniciar, descongele a amostra de soro previamente preparada sobre gelo e, em seguida, transfira 400 microlitros do soro recém-descongelado para um tubo de microcentrífuga rotulado. Em seguida, dilua o soro com 100 microlitros de água livre de RNase e adicione 50 microlitros de proteinase K numa concentração de um miligrama por mililitro. Incube então o soro diluído a 37 graus Celsius por 20 minutos para permitir uma digestão proteica adequada, garantindo a completa solubilização em 1,5 mililitro de tri-reagente RTLS e 100 microlitros de quatro promonol.

Inverta brevemente o homogenato e realize pipetagem repetitiva por cinco segundos. Em seguida, transfira a mistura para um tubo de fase pesada com trava de dois mililitros identificado. Centrifugue o homogenato a 12.000 ×g por 20 minutos a quatro graus Celsius.

Em seguida, decante cuidadosamente um mililitro da solução aquosa resultante para um novo tubo de DNA com baixa ligação. A fase orgânica e a interface devem permanecer retidas sob o gel branco do tubo com bloqueio de fase. Então, adicione cinco microlitros de glicogênio e 500 microlitros de isopropanol a 100% à solução aquosa.

Agite a solução por inversão e incube-a durante a noite a menos 20 graus Celsius. Após a incubação durante a noite, centrifugue a amostra por 20 minutos a 12.000 ×g em uma centrífuga a quatro graus Celsius. Em seguida, descarte o sobrenadante límpido e realize uma centrifugação rápida por dois minutos a 16.000 ×g em uma centrífuga a quatro graus Celsius.

Usando uma pipeta, remova cuidadosamente a solução límpida ao redor do pellet. Em seguida, lave o pellet com um mililitro de etanol 70% e centrifugue a amostra a 10.000 ×g por 10 minutos. Para visualizar o pellet, incline o tubo diante de um fundo escuro e despreze a solução de lavagem.

Repita a lavagem. Prossiga. Suspenderemos o pellet em 10 microlitros de água livre de RNA.

Certifique-se de que o pellet está completamente dissolvido aquecendo a amostra a 55 graus Celsius por cinco minutos. Durante esse período, misture a amostra com pipetagem repetida para obter um maior rendimento total de RNA, dois preparos de RNA do mesmo paciente. Quantifique o RNA ressuspenso utilizando um UV versus.

Espetrofotômetro e avalie a qualidade do RNA utilizando um bioanalisador 2100. Em seguida, armazene as amostras de RNA combinadas a menos 80 graus Celsius para uso em aplicações posteriores. Os perfis espectrofotométricos de RNA de soro humano demonstram o rendimento melhorado de RNA devido à adição de várias etapas à abordagem tradicional de Chomsky.

Um perfil típico de UV de RNA isolado de soro humano contrasta com os perfis obtidos com a utilização de etapas de otimização, incluindo a adição de glicogênio e centrifugações extras, sendo que cada uma dessas ferramentas combinadas resulta na redução de contaminantes e no aumento do rendimento total de RNA. A pureza da amostra de RNA foi ainda maior com o uso de gel de bloqueio de fase, que retém fenol e proteínas. Além disso, o aumento do volume de soro tem um impacto significativo no rendimento de RNA.

Uma análise em bioanalisador foi realizada para analisar mais detalhadamente a qualidade da amostra. Um único pico em aproximadamente 21 nucleotídeos representa a fração de microRNA. O perfilagem em matriz e a QPCR foram realizadas seguindo o procedimento. Este perfil em matriz de três cânceres de cabeça e pescoço e de um tecido normal S mostra a expressão de microRNAs, analisada por agrupamento hierárquico e apresentada como um mapa de calor, no qual a superexpressão e a subexpressão dos microRNAs podem ser observadas.

As curvas de amplificação de QPCR foram geradas para microRNAs específicos. Esses dados foram então utilizados para plotar os valores de CT brutos do soro normal. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em qualquer número de pacientes, produzindo RNA de alta qualidade, desde que seja executada corretamente seguindo o procedimento. Outros métodos, como PCR quantitativa ou sequenciamento de nova geração, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como descoberta e validação de biomarcadores.